本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种食品细菌数快速检测方法。
背景技术：
近些年来，由食物引起的疾病越来越引起人们的重视。因此对于食品卫生检验领域，快速和灵敏的检测设备是十分重要的。同样对于食品加工企业和食品监测部门，如果能够快速的检测食品中的目标细菌数量，就可以提高食品质量的监控，从而有效实施对公共食品卫生与安全的保障。
传统上的细菌检测手段是采用菌落培养的方法，该种方法能够很准确地测定食品中有害的目标细菌是否超标，但是这种方法的缺点是等待结果时间过长，通常需要几天的时间才能确定检测结果；同时，这种方法需要专业技术人员的全程操作，导致成本较高。
现有技术如授权公告号为cn103884695b的中国发明专利，公开了一种快速检测细菌的聚烯烃纳米纤维膜传感器及其制备方法。该发明采用聚烯烃共聚物为基体材料，经表面化学改性、生物活性分子的固相合成工艺，制备出化学改性的聚烯烃纳米纤维膜的生物传感器。采用该发明制备出来的纳米纤维膜生物传感器，在性能方面克服了传统检测细菌存在的细菌培养，数菌落等耗时耗力和准确性差的缺点，利用三磷酸腺苷、荧光素酶、荧光素之间发光原理，快速检测细菌释放出来的atp，实现了对生物有害物质快速响应的纳米纤维膜传感器。并且由于采用了固相合成，使生物活性酶很好的固定在纳米纤维膜表面，可以起到反复循环地检测细菌。可以广泛地应用在生物技术、医疗卫生、食品药品检测、水处理等领域。然而，该发明方法无法快速准确地检测细菌数。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种食品细菌数快速检测方法，该方法操作简便、耗时短、成本低，采用电化学法制备电极并将细菌固定于电极表面，通过电极标准曲线测定菌液样本的细菌浓度，能够实现细菌数快速准确地检测。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种食品细菌数快速检测方法，包括，
s1：在cus量子敏化二氧化钛电极表面制备聚乙烯/细菌复合薄膜；
s2：绘制聚乙烯/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线；
s3：根据步骤s2所得标准曲线测定待测菌液样本的细菌浓度。
作为优选，步骤s1具体包括以下步骤：
标准菌悬液准备：
配制细菌培养液，高压灭菌后接种适量菌种进行培养，将培养后所获得菌液离心清洗，得到标准菌悬液；
细菌在cus量子敏化二氧化钛电极表面的固定：
测定cus量子敏化二氧化钛电极的循环伏安曲线，直至氧化-还原峰电位差降至80mv以内，将电极晾干；取标准菌悬液滴至电极表面后，经烘干即可将细菌固定在电极表面；
聚乙烯在电极表面的掺杂：
将固定有细菌的电极置于含有聚乙烯的硫酸溶液中采用循环伏安法扫描，得聚乙烯/细菌复合薄膜。
更优选地，聚乙烯在电极表面的掺杂通过将电极置于含有聚乙烯、乙酰胺、苯乙醇和硫酸的溶液中采用循环伏安法扫描；聚乙烯为0.1-0.2m，乙酰胺为0.01-0.06m，苯乙醇为35-50vol％，硫酸溶液为0.3-0.4m，循环伏安法扫描1-10圈，扫描速率为5-100mv/s，电压下限为–0.6-0v，电压上限为0.1-1.0v；乙酰胺和苯乙醇具有协同效果，一是降低聚乙烯粉末在掺杂过程中的粘度，抑制其聚集或堵塞二氧化钛纳米管管口，从而使其均匀地分散到固定有细菌的cus量子敏化二氧化钛电极表面，这在一定程度上也加强了细菌在电极表面的固定，确保了细菌数测定的准确性；二是有利于降低电极表面势能，提高电极在循环伏安法扫描下对聚乙烯的吸附，从而提高聚乙烯在电极表面的掺杂率，最终可制得聚乙烯/细菌复合薄膜，聚乙烯的掺杂使得电极表面的电化学性质发生改变，提高了电极循环伏安特性测量的敏度，从而可更加快速准确地测定对应细菌菌体的浓度。
作为优选，步骤s2具体包括以下步骤：
a.将步骤s1所得的标准菌悬液依次按梯度稀释获得不同浓度的菌悬液；
b.利用所获得的不同浓度的菌悬液分别按照步骤s1制备聚乙烯/细菌复合薄膜，蒸馏水漂洗后于0.1m硫酸溶液中测定其循环伏安曲线，扫描速率为50mv/s，扫描的电压范围为–0.2-0.9v；
c.以细菌浓度对数为横坐标，以b中所得循环伏安曲线最高峰所对应的峰电流为纵坐标，绘制聚乙烯/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线。
作为优选，步骤s3具体包括以下步骤：
d.利用待测菌悬液按照步骤s1在cus量子敏化二氧化钛电极表面制备聚乙烯/细菌复合薄膜，按照步骤s2测定其循环伏安曲线；
e.确定循环伏安曲线的峰电流，根据步骤s2中所得聚乙烯/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线计算其细菌浓度。
作为优选，二氧化钛电极的制备方法为：采用卧式旋转阳极氧化法制备二氧化钛纳米管阵列，然后于400-450℃煅烧1.5-2h制得定型二氧化钛纳米管。
作为优选，阳极氧化电解液组成为：80-120ml乙二醇，1-2ml去离子水，0.05-0.5gnh4f，1-10ml三乙醇胺和0.1-1ml对甲基苯甲酸乙酯；三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯的特殊存在，一方面能够提高电解液的电导传输性能，有利于电子从中心向四周传导进行阳极氧化，既提高了氧化的速度，同时可加强阳极氧化层的均匀性：钛金属从四周向中心递进氧化形成氧化膜，可避免造成局部未氧化或氧化过度；另一方面，能够造成氧化物形成和ti4+溶剂化之间的竞争不平衡，即提高f-腐蚀二氧化钛氧化层的速度，从而削弱f-与ti4+络合的速度，最终有利于所需孔径二氧化钛纳米管的形成与生长，其比表面积增大，机械强度也得到提升。
作为优选，cus量子敏化二氧化钛电极的制备方法为：将定型二氧化钛纳米管，cucl2溶液以及na2s2o3溶液进行水热反应。
作为优选，水热反应条件：cucl2溶液浓度为0.001-0.005mol/l，na2s2o3溶液浓度为0.01-0.03mol/l；水热反应温度为110-150℃、时间为1-5h。
本发明的有益效果为：
1)本发明利用电化学法在电极表面制备聚乙烯/细菌复合薄膜，将聚乙烯掺杂到固定有细菌的cus量子敏化二氧化钛电极表面，一是可以加强细菌在电极表面的固定；同时还使得电极表面的电化学性质发生改变，提高了电极循环伏安特性测量的敏度，从而可更加快速准确地测定对应细菌菌体的浓度；
2)本发明通过将二氧化钛与cus复合得电极，能够改善单一电极的电化学性质，有利于提高电极的伏安特性参数测量敏度，因此可提高细菌菌体浓度测定的准确性；
3)本发明实施过程中无需像传统平板计数法等对细菌进行培养后再统计，因此耗时短、操作简便；
4)本发明所述方法对同一细菌菌体浓度测量具有重复性好、检测线性范围宽的优点。
本发明采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
具体实施方式
下面分别以埃希氏大肠杆菌和嗜热链球菌结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种食品细菌数快速检测方法，具体包括以下步骤：
一、cus量子敏化二氧化钛电极的制备：
采用卧式旋转阳极氧化法制备二氧化钛纳米管：将购买的厚度为0.05mm的钛片裁剪成长、宽为40mm×20mm的规格，用7000目砂纸打磨至表面光滑平整，在丙酮和无水乙醇中分别超声清洗30min，去除表面油污；然后在组成为10ml蒸馏水，5ml硝酸，1ml18wt％的nh4f和1ml18％wt的氨水的抛光液中去除表面的氧化膜，最后用蒸馏水清洗3-5次；
配制组成为100ml乙二醇，1ml去离子水，0.2gnh4f，3ml三乙醇胺和0.6ml对甲基苯甲酸乙酯的电解液溶液；将预处理的钛片和钛基底平整叠加放入自制模具中，将其整体夹持在阳极，铂电极作为阴极，调整两电极使其正对，然后在直流电压50v、温度45℃条件下进行阳极氧化反应，反应过程中保持适当速率的磁力搅拌，反应3h后，关闭电源停止反应，从电解液中取出电极，将二氧化钛纳米管在乙醇中超声清洗3min；三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯的特殊存在，一方面能够提高电解液的电导传输性能，有利于电子从中心向四周传导进行阳极氧化，既提高了氧化的速度，同时可加强阳极氧化层的均匀性：钛金属从四周向中心递进氧化形成氧化膜，可避免造成局部未氧化或氧化过度；另一方面，能够造成氧化物形成和ti4+溶剂化之间的竞争不平衡，即提高f-腐蚀二氧化钛氧化层的速度，从而削弱f-与ti4+络合的速度，最终有利于大孔径二氧化钛纳米管的形成与生长，其比表面积增大，机械强度也得到提升；
将二氧化钛纳米管在马弗炉中400℃煅烧1.5h制得定型二氧化钛纳米管；
将定型二氧化钛纳米管，cucl2溶液以及na2s2o3溶液进行水热反应；水热反应条件为：cucl2溶液浓度为0.001-0.005mol/l，na2s2o3溶液浓度为0.01-0.03mol/l；水热反应温度为110-150℃、时间为1-5h；
二、在cus量子敏化二氧化钛电极表面制备聚乙烯/细菌复合薄膜：
(1)标准菌悬液准备
取酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，氯化钠10g，加水配制成1l培养液，利用naoh调节ph至7.0，121℃，20min，高压灭菌后接种适量大肠杆菌菌种，37℃恒温培养箱培养20h。将所获得菌液于4℃离心10min清洗3次，得到标准大肠杆菌菌悬浮液，采用平板菌落计数法测定其菌体浓度为9.38×108cfu·ml-1；
(2)细菌在cus量子敏化二氧化钛电极表面的固定：
测定cus量子敏化二氧化钛电极的循环伏安曲线，直至氧化-还原峰电位差降至80mv以内，晾干，确保电极初始状态一致；取10μl标准大肠杆菌菌悬液滴至电极表面，经50℃烘箱15min烘干即可将细菌固定在cus量子敏化二氧化钛电极表面，得到细菌/cus量子敏化二氧化钛电极；
(3)聚乙烯在电极表面的掺杂：
聚乙烯在电极表面的掺杂通过将电极置于含有聚乙烯、乙酰胺、苯乙醇和硫酸的溶液中采用循环伏安法扫描；聚乙烯为0.1m，乙酰胺为0.03m，苯乙醇为35vol％，硫酸溶液为0.3m，循环伏安法扫描10圈，扫描速率为50mv/s，电压下限为–0.2v，电压上限为0.9v；乙酰胺和苯乙醇具有协同效果，一是降低聚乙烯粉末在掺杂过程中的粘度，抑制其聚集或堵塞二氧化钛纳米管管口，从而使其均匀地分散到固定有细菌的cus量子敏化二氧化钛电极表面，这在一定程度上也加强了细菌在电极表面的固定，确保了细菌数测定的准确性；二是有利于降低电极表面势能，提高电极在循环伏安法扫描下对聚乙烯的吸附，从而提高聚乙烯在电极表面的掺杂率，最终可制得聚乙烯/细菌复合薄膜，聚乙烯的掺杂使得电极表面的电化学性质发生改变，提高了电极循环伏安特性测量的敏度，从而可更加快速准确地测定对应细菌菌体的浓度；
三、绘制所述聚苯胺/细菌复合薄膜修饰电极标准曲线：
将步骤二所得浓度为9.38×108cfu·ml-1标准大肠杆菌悬液，依次稀释为9.38×107cfu·ml-1，9.38×106cfu·ml-1，9.38×105cfu·ml-1，9.38×104cfu·ml-1，9.38×103cfu·ml-1；利用所获得的不同浓度的菌悬液按照步骤二在cus量子敏化二氧化钛电极表面制备聚乙烯/大肠杆菌复合薄膜，蒸馏水漂洗后于0.1m硫酸溶液中测定其循环伏安曲线；扫描范围电压为–0.2-0.9v，扫描速率为50mv/s；
以细菌浓度对数为横坐标x，以所得循环伏安曲线在0.2v处的峰电流为纵坐标y，绘制聚乙烯/大肠杆菌复合薄膜修饰电极标准曲线；可得线性关系：y＝-26.124x+231.03，r2＝0.993；
四、测定待测菌液样本的细菌浓度：
利用待测菌悬液按照步骤二所述制备聚乙烯/大肠杆菌复合膜，按照步骤三测定其在0.1m硫酸溶液中的循环伏安曲线，根据其在0.2v处的峰电流由步骤三中所得聚乙烯/大肠杆菌复合薄膜修饰电极标准曲线计算其菌体浓度。表1为基于聚乙烯/细菌复合薄膜计数法和平板菌落计数法的测定结果对比，结果表明，本发明所述方法5次测定的菌悬液浓度均值与平板菌落计数法测定结果基本一致，但其相对标准偏差明显低于平板菌落计数法，说明其具有更好的稳定性，本发明聚乙烯/细菌复合薄膜计数法计数结果优于传统的平板菌落计数法。
表1基于聚乙烯/细菌复合薄膜计数法和平板菌落技术法的测定大肠杆菌样本结果对比
实施例2：
本实施例与实施例1采用的方法相同，不同之处在于本实施例以嗜热链球菌为例进行说明：
称取mrs肉汤培养基52.4g，加热溶解于1l蒸馏水中，118℃高压灭菌15min，冷却后接种适量嗜热链球菌菌种，37℃恒温培养箱培养20h。将所获得菌液于4℃离心10min清洗3次，得到标准嗜热链球菌悬浮液，采用平板菌落计数法测定其菌体浓度为6.16×109cfu·ml-1。将该标准悬浮液依次稀释为6.16×108cfu·ml-1，6.16×107cfu·ml-1，6.16×106cfu·ml-1，6.16×105cfu·ml-1，6.16×104cfu·ml-1；以细菌浓度对数为横坐标x，以所得循环伏安曲线在0.2v处的峰电流为纵坐标y，绘制聚乙烯/嗜热链球菌复合薄膜修饰电极标准曲线；可得线性关系：y＝-30.105x+236.279，r2＝0.986；
按照实施例1中步骤四测定待测嗜热链球菌菌液样本，将聚乙烯/细菌复合薄膜计数法和平板菌落技术法的测定嗜热链球菌样本结果对比，表2结果表明，本发明所述方法5次测定的菌悬液浓度均值与平板菌落计数法测定结果基本一致，但其相对标准偏差明显低于平板菌落计数法，说明其具有更好的稳定性，本发明聚乙烯/细菌复合薄膜计数法同样适用于嗜热链球菌样本。
表2基于聚乙烯/细菌复合薄膜计数法和平板菌落技术法的测定嗜热链球菌样本结果对比
对比例1：
二氧化钛纳米管阳极氧化电解液组成未添加三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯，其余部分和实施例1完全一致。
对比例2：
聚乙烯在电极表面的掺杂过程中未使用乙酰胺和苯乙醇，其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
对本发明制备的电极的表面及结构进行检测和表征，得到表3所示；对金属钛进行阳极氧化3h得一定尺寸的二氧化钛纳米管；很明显，当阳极氧化电解液组成不含有三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯时，对比例1制得的二氧化钛纳米管的长度和孔径均减小，表明三乙醇胺和对甲基苯甲酸乙酯的特殊存在能够加快氧化速度，且有利于大孔径二氧化钛纳米管的形成与生长；对比例2中电极表面聚乙烯掺杂不理想，表明乙酰胺和苯乙醇具有协同效果，能够抑制聚乙烯粉末聚集或堵塞二氧化钛纳米管管口，提高其分散度，同时加强细菌在电极表面的固定。
表3电极表面及结构性质
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。