一种烟草脆裂病毒粒体原位分离固定电子显微镜诊断方法与流程

本发明属于植物保护领域，进一步属于植物病毒的鉴定与检测，具体涉及一种烟草脆裂病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法。

背景技术：

烟草脆裂病毒（tobaccorattlevirus,trv）是烟草脆裂病毒属（tobravirus）的典型成员，是马铃薯的重要病毒病原之一，在烟草上的病害于1898年由behrens记述，病毒于1943年由quanjer记述。trv在自然条件下主要通过线虫和菟丝子传播，寄主范围广，可侵染60科400多种双子叶和单子叶植物。trv在欧洲、北美、前苏联、日本和新西兰马铃薯产区广泛发生分布，侵染马铃薯引起块茎坏死弧茎斑驳和花芽黄斑，在北欧的挪威引起产量的严重损失，并引起块茎质量下降。中国国马铃薯生产中种苗与种薯感染trv普遍，但对其引起的马铃薯病害与产量损失研究较少。

trv是双组分的单链正义rna病毒，rna分别包被与长、短两种粒体中。trv病毒粒体为杆状，已报道的直径为20～23nm，长的病毒粒体长度为180～215nm，短的病毒粒体长度为46～115nm。

trv在马铃薯生产上以种苗、种薯传播为主，带毒种苗种薯中毒源量积累以及远距离传播，导致病害发生日益严重，发生范围不断扩大。马铃薯生产上trv的防控方法主要是检测筛选应用无病毒种苗种薯，检测方法以酶联免疫吸附试验（elisa）为主，通过制备trv外壳蛋白抗体进行间接检测，灵敏度较低且需要样品量较大。也有应用反转录多聚酶链式反应（rt-pcr）检测，通过设计外壳蛋白基因引物，从病组织提取rna为模版进行扩增，灵敏度较高，但是成本较高且耗时较长，而且是间接检测方法。间接检测方法如elisa的优势是成本低，可用于大量样品检测，其局限是难以避免假阳性反应（或非特异性反应）的问题。常规电子显微镜检测以病组织研磨制样或通过化学沉淀差速离心进行负染色制样，容易破坏病毒粒体结构及难以反映其原位分布或聚集特征，观察结果不易判断。

为此，本发明改进了现有的透射电镜的样品制备方法，提供了一种快速诊断烟草脆裂病毒的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种烟草脆裂病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，所述方法包括如下步骤：

（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；

（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；

（3）加入固定液固定2~3min；

（4）将覆盖有formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1min；

（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1min；

（6）透射电镜上样、观察和拍照；

（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。

附图说明

图1游离的trv完整的单个病毒粒体；

图a中，病毒粒体直径20～25nm，长度200～420nm；图b中，病毒粒体直径20nm，长度140nm～380nm。黑箭头所指为病毒粒体，白箭头所指为病毒外壳蛋白亚基聚集体，宽箭头所指为囊泡。

图2trv完病毒粒体聚集体；

图a中，宽箭头所指为集块状聚集；图b中，宽黑箭头所指为成团聚集，细黑箭头所指为单个病毒粒体散布，白箭头所指为较多病毒蛋白以及聚集体。

图3trv大量病毒粒体聚集体；

图a中，宽箭头所指为集束状堆积；图b中，宽箭头所指为簇状堆积，核酸芯线明显。

图4trv病毒粒体（黑箭头）与大量囊泡（ve）和病毒外壳蛋白亚基聚集体（白箭头）紧密相连分布。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的一种烟草脆裂病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法，包括如下步骤。

（1）取1mm×2mm×6mm大小的感病组织；所述感病组织可以为叶、茎或块茎。

（2）将所述感病组织用徒手切片法切成细丝；细丝的直径约为0.01~0.03mm。

（3）加入固定液固定2~3min，使得原生质体中的病毒粒体或其聚集体自然浸出。作为本发明的一种优选，所述固定液为2.5%戊二醛，用量为0.2ml。

（4）将覆盖有formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液1~3min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1min。作为本发明的一种优选，吸附样品浸出液的时间为2min。

（5）将染液滴于疏水膜上，再将所述铜网面朝下置于染液染色1~3min，然后用滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1min。作为本发明的一种优选，所述染液为2%钼酸铵染液，用量为0.1ml，染色时间2min。

（6）透射电镜上样、观察和拍照。作为本发明的一种优选，所述透射电镜的参数设置为：

（a）加速电压：60～80kv；

（b）放大倍数:20，000～50,000倍。

（7）根据病毒粒体的分布与聚集特征进行判断。所述trv病毒粒体在寄主组织细胞中的分布与聚集特征包括以下几个方面：

（a）个体特征：杆状，核酸芯线较宽（约5nm），直径20～25nm，长短2种组分，短粒体长度140～200nm，长粒体长度280～420nm，与囊泡、病毒外壳蛋白聚集体相连或交叉散布；

（b）聚集特征：呈集块状交叉聚集、团状、集束状和簇状聚集；

（c）trv病毒粒体与大量囊泡、病毒外壳蛋白聚集体紧密相连，交叉分布，长短两种组分散布或聚集。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：

（1）提供的trv病毒粒体在病组织中的原位分离固定负染色制样技术，能完整保存病毒粒体的形态特征、分布特征及原位聚集特征；

（2）有效避免elisa、rt-pcr间接检测技术的假阳性反应和样品量较大的问题，克服常规制样方法对病毒粒体结构及其原位聚集体的破坏；

（3）应用本发明所建立的trv病毒粒体原位分布与聚集特征的电镜诊断技术，可保障高质量脱毒马铃薯核心种苗的检测筛选，并对间接方法检测结果进行有效验证，对大田生产中的疑似trv感染植株进行快速直观的诊断；

（4）该检测方法与elisa及rt-pcr检测结果比较，符合率达到95%以上，检测结果可靠。

本发明可高效应用于无病毒种子种苗的检测筛选，从源头保障种子种苗的质量，对生产中的病植株进行适时监测。对大田生产的作物疑似病样实现快速精准诊断，有利于采取针对性强的绿色防控措施的制定和实施，保障作物生产的产量和品质。还可以对elisa检测结果进行复测验证，提高检测结果的可靠性。

下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。

实施例1：原位分离固定负染色电子显微镜诊断。

取疑似感染trv的马铃薯种苗，切取1mm×2mm×6mm大小。将所取样品置于消毒载玻片上，用消毒刀片将样品切成直径约为0.01～0.03mm大小的细丝。

应用移液枪吸取0.2ml2.5%戊二醛固定液（0.2mol/lpbs，ph7.2配制）滴于样品上。将覆盖有formvar膜和碳膜的铜网膜面朝下吸附样品浸出液3min。用专用镊子取铜网，滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1min。移液枪吸取0.1ml2%钼酸铵染液（ph6.4）（0.2mol/lpbs，ph7.2配制）滴于疏水膜上，将吸附样品的铜网膜面朝下置于染液上2min，用专用镊子取铜网，滤纸沿铜网边缘吸附，膜面朝上放置1min。

将上述制备样品的铜网放入透射电子显微镜样品杆，插入样品杆，设备处于观察调试状态。设置透射电子显微镜观察参数为：

（1）加速电压：60～80kv；

（2）放大倍数:20，000～50,000倍。

电镜观察染病马铃薯30个样品，每个样品观察30个有效视野（有病毒粒体分布的视野）下的病毒粒体分布与聚集特征，进行拍照与文字描述记录。

观测结果如下：

（1）如图1所示：杆状，核酸芯线较宽（约5nm），直径20～25nm，长短2种组分，短粒体长度140～200nm，长粒体长度280～420nm，与囊泡、病毒外壳蛋白聚集体相连或交叉散布；

（2）如图2、3所示：多个trv病毒粒体呈集块状交叉聚集、团状、集束状、簇状聚集；

（3）如图4所示：trv病毒粒体与大量囊泡、病毒外壳蛋白聚集体紧密相连，交叉分布，长短两种组分散布或聚集。

比较观测结果与trv病毒粒体分布和聚体特征，染病马铃薯被诊断为trv病毒感染。

实施例2：das-elisa检测验证。

（1）主要试剂与材料。

（a）包被抗体：trv外壳蛋白多克隆抗体，4℃保存、备用。

（b）酶标抗体：4℃保存，备用。

（c）包被缓冲液：

溶解于1000ml双蒸水中，调ph值为9.6。

（d）洗液pbst:

溶解于1000ml双蒸水中，加入0.5%tween20。

（e）病毒抽提缓冲液：

溶解于1000mlpbst中，调ph值为7.4。

（g）封闭缓冲液：pbst中加入5%的脱脂奶粉，溶解（即用即配）。

（h）底物缓冲液：10%乙二醇胺(ph9.8)，底物为硝基苯磷酸盐（p-npp）。

（i）阴性对照：经电子显微镜、elisa、rt-pcr检测无病毒的脱毒马铃薯组培苗作为阴性对照。

（j）阳性对照：经电子显微镜、elisa、rt-pcr检测含有pvx的铃薯组培苗作为阳性对照。

（k）空白对照：仅加病毒抽提缓冲液作为空白对照。

（l）待测样品：取上述经电子显微镜制样观察的样品（阴性、阳性对照同样处理）1g，加入病毒抽提缓冲液（约5~10倍，重量体积比）研磨样品，作为待测样品。

（2）trv的das-elisa操作技术规程。

（a）包被抗体加入酶标板(包被缓冲液稀释)，每孔加入100µl,37℃下放置2h。（b）pbst洗板6次，快速3次，慢速3次（3min/次），拍干。

（c）将待测样品（包括阴性、阳性、空白对照）每孔100µl加入酶标板，37℃下放置2h。

（d）同上洗板。

（e）每孔加入200µl封闭缓冲液,37℃下放置30min。

（f）抛弃孔中液体，拍干。

（g）酶标抗体(pbst稀释),加入酶标板，每孔加入100µl,37℃下放置2h。

（h）同上洗板。

（i）用底物缓冲液溶解底物（1mg/ml），加入酶标板，每孔100µl,室温（25℃）下至充分显色（每孔加入50µl1nnaoh终止显色）。肉眼判别或酶标仪读数。

（3）阴阳性判别。

目测待测样品颜色反应与阴性和空白对照颜色反应深浅对比，较深则为阳性，较浅则为阴性，同时观察阳性样品的颜色反应并与待测样品比较。

应用酶标仪进行检测结果判别，根据酶标仪在405nm波长下酶标板每孔的od数值，待测样品od值与阴性对照od值之比大于等于2.0时，待测样品为阳性，否则为阴性。

对实施例1的30个样品进行检测das-elisa，待测样品与trv外壳蛋白多克隆抗体das-elisa检测均呈阳性反应，说明感染染病马铃薯的确为trv病毒。

实施例3：rt-pcr检测验证。

（1）应用triozl法提取rna：

（a）取待测样品（包括阳性对照和阴性对照样品）1g，样品加入液氮充分研磨至粉末状（研钵要进行灭菌，提前预冷），转移到1.5ml离心管中（离心管需预先用液氮冷冻，防止rna降解）；

（b）向装有样品的离心管中加入1ml的triozl，混匀5min，让样品充分溶解；

（c）加入200µl氯仿，充分混匀，4℃冷冻离心机中12000rpm离心15min；

（d）转移上清于新的离心管，加入等体积的异丙醇混匀后静置15min，4℃冷冻离心机中12000rpm离心10min，弃上清；

（e）加入1ml70％的酒精，混匀，4℃冷冻离心机中12000rpm离心5min，重复此操作1次；

（f）将离心管底部留有的沉淀于通风厨中干燥10min后保存于-80℃冰箱。

（2）rt-pcr。

（a）引物（目的片段450bp）：

trv-f5′-atgggtgacatgtacgatg-3′；

trv-r5′-gaggcgtcatcgaatttgt-3′。

（b）反应体系。

i）逆转录。

ii）pcr体系（50µl）。

（c）反应条件:94℃3min;94℃30s，54℃45s，72℃45s，35cycles；72℃10min。

（3）反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

对实施例1中的30个染病样品进行rt-pcr。结果表明：与标准分子量相比较，样品和阳性对照条带的分子量大小均为450bp左右，即为阳性。待测样品与阳性对照与预期结果相符，通过rt-pcr检测验证。

由此可见，本发明所述的烟草脆裂病毒粒体的原位分离固定电子显微镜诊断方法诊断准确率高，成本较低，大大缩短了检测时间。