一种烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法与流程

本发明涉及一种烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，属于烟草及烟草制品中酸性成分的分析
技术领域：
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背景技术：
：有机酸广泛存在于烟草中，含量为10％～16％，对卷烟的香气和吃味具有重要作用。目前研究最多的烟叶中的有机酸为脂肪酸，如挥发性脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸等)和高级脂肪酸(十一酸、油酸、亚麻酸等)。对非脂肪类有机酸，如乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸等的研究较少。然而，这些非脂肪类有机酸具有特征的香气和吃味，对卷烟烟气风格特征的形成起到十分重要的作用。例如，乳酸具有奶香味，能使烟气更柔顺醇和；乙酰丙酸具有焦糖香味，能增加烟气丰满度；2-呋喃甲酸具有淡的坚果香味；苯甲酸表现为弱的、淡的醇和的香味；苯乙酸具有蜜香味；4-氧代壬酸具有刺激的、辛辣的味道，能增加烟气丰满度；2-羟基苯甲酸表现为弱的、淡的香味；肉桂酸具有和顺的、醇和的，微弱的香脂香味。烟叶中非脂肪类有机酸如乳酸、乙酰丙酸、苯甲酸、苯乙酸、2-呋喃甲酸的测定目前已有文献报道，如迟广俊等在《初烤烟叶提取物中酸味关键成分的感官导向分析》(烟草科技，2015,48,27-32)中对烟叶提取物中乳酸、乙酰丙酸等有机酸采用gc/ms进行了分析，气相色谱条件：升温程序：50℃保持3min，然后以3℃/min的速率升温至250℃，其中乳酸的检出限为0.48μg/ml(相当于8260μg/g)，乙酰丙酸的检出限为0.08μg/ml(相当于0.2μg/g)；冒德寿等在《基于味觉活力值的烤烟主流烟气关键酸味物质的研究》(中国烟草学报，2014,20,21-27)中采用n,o-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺衍生化法对51种烟叶样本中的苯甲酸、苯乙酸和乳酸进行了分析；王文领等在《反相hplc法同时测定烟草中甲酸、乙酸和乳酸》(烟草科技，2008，(6)41-43)中采用反相高效液相色谱法对烟草中乳酸等有机酸的含量进行了测定，乳酸的检出限为3.3μg/ml。郭磊等在《烟叶中26中挥发性和半挥发性有机酸的gc-ms/sim法同时分析》(分析测试学报，2008,27,739-743)对乳酸和2-呋喃甲酸等有机酸进行了分析，气相色谱条件：初始炉温为40℃，保持3min，以4℃/min升温至280℃保持40min；其中，乳酸的检出限为2.3μg/g，2-呋喃甲酸的检出限为0.2μg/g，苯甲酸的检出限为0.3μg/g。乳酸、乙酰丙酸、苯甲酸、苯乙酸、2-呋喃甲酸等非脂肪类有机酸均可采用气相色谱-质谱联用法(gc-ms)分析；其中乳酸还可采用离子色谱和液相色谱分析，乙酰丙酸可用离子色谱法分析。然而，迄今为止，烟草及烟草制品中3-羟基丙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸的分析研究尚未见文献报道。同时，由于受仪器灵敏度的限制，一些含量较低的非脂肪类有机酸，如肉桂酸，采用现有的gc-ms法为未检出。因此，采用现有技术中对烟草及烟草制品中的非脂肪类有机酸进行分析时，通常不能对含量交底的有机酸进行有效地分离，检测灵敏度较低。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高灵敏度的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，包括以下步骤：将待测样品与萃取剂、内标物混合后进行萃取，取萃取液加入硅烷衍生化试剂进行衍生化反应，得到待测液；取待测液采用气相色谱-串联质谱法进行分析，气相色谱条件包括如下的升温程序：40℃～60℃保持1～3min，然后以3℃/min～10℃/min的速率升温至140～160℃，再以5℃/min～10℃/min的速率升温至190～210℃，最后以20℃/min～30℃/min的速率升温至270～290℃，保温15～25min。本发明的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，能够对待测液中的多种非脂肪类有机酸形成有效的分离，灵敏度高，可用于对乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸中的至少一种非脂肪类有机酸的含量进行测定。优选的，升温程序为：40℃～60℃保持1～3min，然后以3℃/min～10℃/min的速率升温至140～160℃，再以5℃/min～10℃/min的速率升温至190～210℃，最后以20℃/min～30℃/min的速率升温至280～290℃，保温15～25min。所述非脂肪类有机酸为乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸中的至少一种。所述待测样品为将烟叶或烟丝研磨后过40目筛的筛下物。所述气相色谱条件还包括：进样口温度：280℃；进样量：1.0μl；分流比10:1；载气：氦气，恒流流速1.0ml/min；色谱柱：db-5ms色谱柱。优选的，所述db-5ms色谱柱的规格为60m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.。优选的，所述萃取剂为二氯甲烷、正己烷、乙腈中的至少一种。优选的，所述萃取为超声萃取。萃取的时间为15～60min。优选的，每0.5g待测样品对应采用的萃取剂的体积为3～10ml。优选的，所述硅烷衍生化试剂为双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)、n,o-双(三甲基硅烷基)乙酰胺、二甲基二氯硅烷中的一种。优选的，所述衍生化反应是在15～40℃反应10～60min。为了简化分析步骤，优选将衍生化反应在室温下进行。优选的，每0.5g待测样品对应采用的硅烷衍生化试剂的体积为50～350μl。优选的，所述内标物为反式-2-己烯酸。优选的，将待测样品中与萃取剂、内标物混合是将待测样品与萃取剂、内标物溶液进行混合；每0.5g待测样品对应采用的内标物溶液的体积为50～200μl。优选的，所述内标物溶液的浓度为10～30μg/ml。优选的，所述保温的时间为20min。优选的，所述气相色谱-质谱法采用的是gc-ms/ms仪器。采用gc-ms/ms仪器进行分析，能够进一步降低测定方法的检出限。进一步优选的，所述气相色谱-串联质谱法采用的是gc-ms/ms仪器；质谱分析条件包括：电离方式：ei；传输线温度：250℃～290℃；离子源温度：250℃～300℃；扫描方式：多反应监测模式，cid气体压力为2.0mtorr；对每个离子的监测时间为20ms～100ms。优选的，上述测定方法还包括取萃取液加入硅烷衍生化试剂进行衍生化反应前，将所得萃取液过滤。过滤采用的滤膜的孔径为0.2～0.5μm。附图说明图1为实施例1中的标准溶液中乳酸(1)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图2为实施例1中的标准溶液中乙酰丙酸(2)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图3为实施例1中的标准溶液中2-呋喃甲酸(3)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图4为实施例1中的标准溶液中3-羟基丙酸(4)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图5为实施例1中的标准溶液中苯甲酸(5)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图6为实施例1中的标准溶液中苯乙酸(6)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图7为实施例1中的标准溶液中间甲基苯甲酸(7)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图8为实施例1中的标准溶液中4-氧代壬酸(8)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图9为实施例1中的标准溶液中2-羟基苯甲酸(9)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图10为实施例1中的标准溶液中肉桂酸(10)在gc-ms/ms仪器上的色谱图；图11为实施例1中的标准溶液中反式-2-己烯酸(11)在gc-ms/ms仪器上的色谱图。具体实施方式以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。实施例1本实施例的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，是同时对烟叶中乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸等10种非脂肪类有机酸的含量进行测定，包括以下步骤：1)将烟叶样品磨成粉末，过40目筛，得到筛下的烟粉；称取烟粉0.5g作为待测样品置于样品瓶中，然后加入3ml二氯甲烷萃取剂，再加入50μl20μg/ml反式-2-己烯酸内标物溶液，超声萃取30min，得到萃取液；将萃取液过有机相滤膜；2)取过有机相滤膜的萃取液0.5ml，然后加入双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)衍生试剂200μl于室温下衍生化反应10min，然后进gc-ms/ms仪器检测；gc-ms/ms仪器条件为：进样口温度：280℃；进样量：1.0μl；分流比10:1；载气：氦气，恒流流速1.0ml/min；色谱柱：db-5ms色谱柱(60m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；程序升温：60℃保持2min，然后以3℃/min的速率升至150℃，再以5℃/min的速率升至200℃，最后以30℃/min的速率升至280℃，保持20min；电离方式：ei；传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；扫描方式：多反应监测(mrm)模式，cid气体压力为2.0mtorr；对每个离子的监测时间为50ms；10种非脂肪类有机酸及内标化合物的保留时间、母离子、子离子以及优化后的碰撞能量(ce)值见表1。表110种非脂肪类有机酸的质谱分析参数实施例2本实施例的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，包括以下步骤：选取烤烟、白肋烟、香料烟、晒红烟四种不同类型烟叶c3f样品各一个，采用实施例1中的测定方法对待测样品中乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸等10种非脂肪类有机酸的含量进行测定。四种烟叶中10种非脂肪类有机酸(乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸)含量结果如表2所示。表2不同类型烟叶中10种非脂肪类有机酸的含量(μg/g)非脂肪类有机酸烤烟白肋烟香料烟晒红乳酸19.8721.6619.1013.88乙酰丙酸2.2413.016.913.732-呋喃甲酸2.834.973.141.533-羟基丙酸6.2516.239.074.95苯甲酸3.8215.9818.3941.01苯乙酸12.9354.2547.8693.63间甲基苯甲酸0.120.280.220.184-氧代壬酸0.302.503.951.732-羟基苯甲酸5.153.796.592.92肉桂酸0.690.850.890.70实施例3本实施例的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，也是同时对烟叶中乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸等10种非脂肪类有机酸的含量进行测定，具体测定方法除将步骤1)中的二氯甲烷替换为正己烷，并将步骤2)中升温程序替换为如下的升温程序外，其余完全同实施例1；升温程序：40℃保持3min，然后以10℃/min的速率升至160℃，再以10℃/min的速率升至190℃，最后以25℃/min的速率升至280℃，保持25min。实施例4本实施例的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法，也是同时对烟叶中乳酸、乙酰丙酸、2-呋喃甲酸、3-羟基丙酸、苯甲酸、苯乙酸、间甲基苯甲酸、4-氧代壬酸、2-羟基苯甲酸、肉桂酸等10种非脂肪类有机酸的含量进行测定，具体测定方法除将步骤1)中的二氯甲烷替换为乙腈，并将步骤2)中升温程序替换为如下的升温程序外，其余完全同实施例1；升温程序：50℃保持1min，然后以6℃/min的速率升至140℃，再以7℃/min的速率升至210℃，最后以20℃/min的速率升至290℃，保持15min。实验例按照实施例1中的测定方法，将同一烟叶样品一天内进行5次平行测定及分5天测定，测定结果的相对标准偏差(rsd)表示该方法的日内精密度和日间精密度，同时进行回收率实验，结果如表3所示。可见，本方法的精密度和回收率较好，适用于大批量样品的分析。取最低浓度标准工作溶液，10次平行测定，计算标准偏差，以3倍标准偏差为检测限，10倍标准偏差为定量限，结果如表3所示。表3测定方法的精密度、回收率、检测限和定量限由表3中数据可知，与现有技术相比(如
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中所引用的现有技术)，本发明的烟草及烟草制品中非脂肪类有机酸的测定方法灵敏度更高、检测限更低。当前第1页12