一种银黄颗粒外加内标指纹图谱测定方法与流程

本发明涉及药物分析
技术领域：
，特别涉及一种银黄颗粒指纹图谱的测定方法。
背景技术：
：银黄颗粒系由金银花提取物、黄芩提取物组成的复方制剂，具有清热解毒、消炎等功效，被广泛用于治疗上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽炎、流行性腮腺炎、眼科疾病、烧伤感染等疾病。目前该品种在国家食品药品监督管理局获得批准文号的有102家企业，生产厂家众多，加之原料药、生产工艺等方面的差异都会影响产品质量。中药指纹图谱采用各种先进的分析手段（光谱、波谱、色谱等技术）标示中药组分群体的特性，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。指纹图谱包括了对已知成分和未知成分的分析，反映的化学成分信息（具体表现为相对保留时间和相对峰面积）具有高度特异性和选择性，可较充分地反映出中药复杂混合体系中各种化学成分量分布的整体状况，尤其是在现阶段有效成分绝大多数没有明确的情况下，能够结合各种色谱、光谱、波谱手段，特征性地鉴定中药的真伪与优劣，成为中药自身的“化学条码”。《药物分析杂志》2009年第29卷第8期的一篇《银黄颗粒的hplc特征图谱分析》论文中，建立了银黄颗粒rp-hplc指纹图谱测定方法，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液,梯度洗脱,流速为1.0ml/min,检测时间为35min，采用自身所含成分绿原酸峰为参照峰，共确定12个共有峰作为该品种指纹图谱的数学表达，该文献采用自身成分为参照，不能体现不同批次样品的差异，无法定量表达样品化学信息。《分析试验室》2015年第34卷第7期的一篇《超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法测定银黄颗粒中化合成分和主要成分》论文中，建立了超高效液相色谱－四极杆飞行时间质谱(uhplc-qtof-ms)测定银黄颗粒中活性成分的定性和定量分析方法，以0.5%甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱，流速0.4ml/min，检测时间25min，对色谱图中的12种已知成分进行了定量检测，该文献只对已知成分进行定量表达，无法满足我们谱效相关数学模型建立的需要对指纹图谱进行全成分定量表达的基本要求。技术实现要素：为解决上述问题，本发明提供一种银黄颗粒指纹图谱测定方法，采用液相色谱与质谱连用的方法，精确测定银黄颗粒共有峰的化学成分，简便准确、灵敏度高、重复性好。本发明是通过以下技术方案实现的：一种银黄颗粒指纹图谱测定方法，采用以下步骤：（1）对照品溶液的制备：称取黄芩苷、黄芩素、木犀草苷、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素，分别加50%甲醇溶液溶解，分别制成0.1mg/ml对照品溶液；（2）内标溶液的制备：称取葛根素，加水溶解，定容成浓度为30µg·ml-1的内标溶液；（3）供试品溶液制备方法：取银黄颗粒，加热水制成浓度为10mg·ml-1样品溶液；将样品溶液与步骤（2）制备的内标溶液等体积混匀，经微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；（4）测定：利用高效液相色谱-质谱法进行分析测定。优选地，高效液相色谱仪色谱条件为venusilmpc18（4.6mm×250mm，5μm）+venusilmpc18（4.6mm×250mm，3μm）组合柱；条件为：柱温30℃,流速0.7ml·min-1，检测波长235nm，进样量为：10μl，以乙腈为流动相a，体积分数为0.3%磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱。优选地，梯度洗脱的条件为：0~103min，17%流动相a;103~142min，17%→27%流动相a；143~165min，24%→33%流动相a；166~195min，33%流动相a；196~280min，33%→70%流动相a；其中所述的百分比为体积百分比。优选地，质谱法的条件为：采用esi离子源，正离子扫描模式；q-tof质量分析器，质量扫描范围为500～1000m/z；喷雾电压为5500v；干燥气温度为600℃；碰撞气为氮气。优选地，步骤(2)所述的加水溶解为加水后在超声状态下溶解；步骤（3）所述的微孔滤膜的直径为0.45µm。优选地，步骤（3）中供试品溶液的制备方法为：取银黄颗粒，称取细粉1.0g，置于250ml圆底烧瓶内，加入沸水溶液100ml，称重，加热回流30min，放冷，补重，过滤，得续滤液1；取续滤液1与内标溶液等体积混匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，得续滤液2作为供试品溶液。有益效果(1)在梯度洗脱过程中，选择了组合柱（5μm+3μm）进行色谱分离，通过增加柱长，增加柱效，分离效果好，更好的分辨共有峰的化学成分。（2）本发明针对成品所含有效成分的结构特点和理化特征，对供试品溶液配制方法、流动相、洗脱程序、色谱柱及质谱参数等条件进行了筛选和优化，利于液相色谱与质谱的连用，且方法重复性及稳定性好。（3）选用葛根素为参照物，对含有内标物质的供试液进行指纹图谱的测定，采用共有峰与内标峰的相对峰面积比值作为该指纹图谱的数学表达，这样比通常选用中药自身成分做参照计算各共有峰的相对峰面积，更能体现各共有峰含量的绝对变化与相对变化。（4）该方法能够更全面地监控原料药材、半成品和成品质量，监控生产工艺的稳定性。（5）本发明通过建立谱效相关质量评价系统，对样品全息成分的分离检测，对指纹图谱全成分进行定量表达，然后再与药效相联，计算每个成分对药效的贡献率，最后形成一个最终与药物成分相关，以药效为表达的质量评价方法。附图说明图1为实施例1得到的银黄颗粒指纹图谱；图2为对照指纹图谱；图3为本发明对10批银黄颗粒进行了指纹图谱测定，采用中位数法生成对照指纹图谱。具体实施方式下面通过实施例对本发明进行进一步的阐述，下述说明仅为了解释本发明，并不对其内容进行限定。1.1仪器waterse2695高效液相色谱仪(美国waters公司)，waters2998紫外检测器(美国waters公司)，watersempower色谱工作站(美国waters公司)；agbp210s电子天平(sartorius公司)；millipore纯水机(millipore公司)；agelavenusilmpc18色谱柱(4.6mm×250mm，5µm)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。1.2试药葛根素（批号:110752-200511）、黄芩苷(批号:110715-200514)、汉黄芩素(批号:111514-200403)、木犀草苷(批号:111720-200603)、绿原酸（批号：0166-201101rs）购自中国食品药品检定研究院。隐绿原酸(批号:14030213)、黄芩素(批号:15081307)、新绿原酸(批号:13112712)、异绿原酸a(批号:14041309)、异绿原酸b(批号:14022812)、异绿原酸c(批号:14042509)、千层纸素(批号:14062410)、白杨素(批号:13080712)、汉黄芩苷(批号:13120401)购自成都普瑞法科技开发有限公司，纯度>98%。液相色谱用乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，试验用银黄颗粒样品均购自药店。实施例1一种银黄颗粒指纹图谱测定方法，包括以下步骤：（1）对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷、黄芩素、木犀草苷、绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、异绿原酸a、异绿原酸b、异绿原酸c、千层纸素、白杨素、汉黄芩苷、汉黄芩素，分别加甲醇溶解，再加入等体积的水，分别制成0.1mg/ml的对照品溶液，在4℃下避光保存。（2）内标溶液的制备：精密称取葛根素，加水溶解，定容成浓度为30µg·ml-1的内标溶液。内标物的选择：共考察了丹皮酚、丹酚酸b、葛根素、异鼠李素、橙皮苷、山奈酚、槲皮素、槲皮苷等对照品最终选择了葛根素为内标。葛根素的保留时间为93min左右，与相邻峰达到基线分离，无干扰，相邻峰的分离度均>1.5。内标物溶媒的选择：内标物用水溶液，制备成内标物溶液。内标物溶液经超声(20min)后澄清，然后再与供试液混合，混合后仍澄清，且放置24h内不浑浊。故用此方法配制内标溶液。内标物浓度的确定：选取10个银黄颗粒样品，制备样品溶液，并加入等体积不同浓度的内标溶液，混匀，进高效液相色谱仪测定，选择谱图中峰面积适中的葛根素浓度，以确定内标物的浓度。经考察，确定葛根素的浓度为30µg·ml-1。（3）供试品溶液制备方法：取银黄颗粒，精密称取细粉1.0g，置于250ml圆底烧瓶内，精密加入沸水溶液100ml，称重，加热回流30min，放冷，补重，过滤，得续滤液1；取续滤液1与内标溶液等体积混匀，经0.45µm微孔滤膜滤过，得续滤液2作为供试品溶液；（4）测定：高效液相色谱-质谱法测定。高效液相色谱仪色谱条件为：venusilmpc18（4.6mm×250mm，5μm）+venusilmpc18（4.6mm×250mm，3μm）组合柱；条件为：柱温30℃,流速0.7ml·min-1，检测波长235nm，进样量为：10μl，以乙腈为流动相a，体积分数为0.3%磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱。梯度洗脱的条件见表1：表1所述百分比为体积百分比。（5）按照上述方法得到的色谱图，如图1所示。以葛根素为参照，标定了24个共有峰，共有峰面积占总面积的94.27%以上，测定13个成分的对照品溶液，通过与对照品保留时间和紫外吸收光谱的比对，确定了其中6、7、8、12、14、15、16、18、22、23、24号色谱峰分别为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸b、异绿原酸a、异绿原酸c、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、白杨素、千层纸素。结合质谱解析以及对照品的比对，共确定了11个共有峰的化学成分，分析结果见表2。质谱法的条件为：采用esi离子源，正离子扫描模式；q-tof质量分析器，质量扫描范围：500～1000m/z；喷雾电压5500v；干燥气温度600℃；碰撞气：氮气。表2银黄颗粒中部分共有峰成分解析2.1精密度和稳定性试验对保留时间和峰面积比值。结果显示各共有峰的相对保留时间rsd＜1.66%，相对峰面积rsd＜2.78%，表明仪器精密度良好，且样品在30个小时内稳定性良好。表3银黄颗粒指纹图谱稳定性（相对峰面积）峰编号保留时间s1s2s3s4s5rsd%111.9100.0580.0580.0590.0570.0571.632231.4690.0560.0560.0560.0540.0551.471350.7630.2750.2670.2590.2580.2682.605454.8720.1670.1620.1710.1620.1622.333571.5410.1840.1910.1930.1950.1902.168673.4720.3990.3980.4110.3960.3931.722781.6742.4622.4892.4712.4542.4510.616884.9030.2630.2740.2790.2660.2662.426989.8220.1470.1560.1530.1530.1522.02510107.5170.5150.5200.5230.5140.5140.80311109.4180.1700.1640.1650.1660.1631.55312145.4020.1700.1640.1650.1660.1631.55313148.8780.1340.1340.1350.1400.1331.98114150.4840.1140.1150.1140.1190.1151.65115159.9170.1380.1410.1370.1460.1402.37916164.0100.3660.3630.3610.3620.3590.71317167.5520.0340.0350.0360.0360.0342.31318169.68212.19212.30312.31612.19612.1510.60119176.7400.1000.1050.1040.1030.1011.87220179.7410.6800.6810.6910.6780.6740.91221180.8440.2280.2380.2370.2270.2312.19322185.2480.2410.2370.2410.2310.2322.02423220.4380.0800.0850.0850.0810.0812.78324252.9700.0440.0440.0460.0460.0462.659表4银黄颗粒指纹图谱稳定性（相对保留时间）峰编号保留时间s1s2s3s4s5rsd（%）111.9100.2670.2680.2670.2660.2650.373231.4690.2810.2800.2800.2900.2791.661350.7630.4230.4230.4270.4210.4200.644454.8720.6110.6130.6120.6080.6080.430571.5410.7960.7960.7950.7940.7940.157673.4720.8180.8170.8170.8160.8160.097781.6740.9090.9110.9110.9080.9080.174884.9030.9450.9470.9470.9430.9430.197989.8221.0811.0811.0821.0791.0800.11710107.5171.1971.1971.1971.1951.1960.08111109.4181.2101.2111.2101.2111.2110.09612145.4021.6021.6021.6021.6031.6040.05013148.8781.6571.6581.6571.6551.6570.06114150.4841.7181.7181.7171.7151.7170.06515159.9171.7801.7801.7791.7781.7800.05116164.0101.8261.8251.8251.8261.8280.06217167.5521.8651.8651.8641.8681.8690.11818169.6821.8891.8881.8881.8911.8930.11119176.7401.9681.9661.9661.9691.9710.11020179.7412.0012.0001.9882.0042.0050.34321180.8442.0132.0132.0112.0162.0170.11822185.2482.0622.0622.0602.0652.0660.12023220.4382.7652.7632.7612.7662.7690.10524252.9702.8162.8142.8122.8172.8200.104峰编号保留时间s1s2s3s4s5rsd（%）111.9100.0140.0150.0140.0140.0152.937231.4690.0190.0200.0190.0190.0202.942350.730.0970.1020.0960.0980.0982.444454.8720.0610.0620.0610.0590.0611.970571.5410.1620.1670.1570.1570.1612.614673.4720.0880.0890.0860.0850.0902.286781.6740.9931.0160.9680.9690.9881.976884.9030.0990.1000.0970.0980.1001.459989.8220.0460.0460.0440.0450.0472.67010107.5170.1970.2000.1910.1920.2012.40411109.4180.0600.0630.0630.0610.0631.96512145.4020.0640.0670.0640.0640.0642.06113148.8780.0680.0680.0660.0660.0702.37514150.4840.0370.0380.0360.0360.0372.17415159.9170.0600.0610.0600.0610.0621.36416164.0100.1510.1540.1450.1460.1542.75517167.5520.0170.0180.0170.0170.0182.17618169.6825.9006.0035.7505.8526.0321.94219176.7400.0380.0390.0380.0370.0392.18220179.7410.2950.2980.2880.2860.3012.19221180.8440.1020.1040.0980.0980.1032.84422185.2480.0960.0970.0940.0940.0981.95723220.4380.0310.0330.0320.0320.0331.56924252.9700.0260.0260.0250.0250.0262.165表6银黄颗粒指纹图谱重复性（相对保留时间）峰编号保留时间s1s2s3s4s5rsd（%）111.9100.1720.1680.1690.1690.1641.823231.4690.2500.2500.2490.2500.2421.432350.7630.3940.3930.3920.3940.3831.138454.8720.5690.5690.5700.5760.5630.811571.5410.7590.7580.7560.7560.7560.192673.4720.7950.7900.7900.7910.7890.266781.6740.8450.8470.8490.8510.8390.534884.9030.8740.8770.8800.8840.8760.419989.8220.9340.9300.9300.9290.9310.22010107.5171.1131.1071.1061.1041.1210.59711109.4181.5031.4981.4931.4861.5321.16912145.4021.5191.5151.5141.5081.5450.94113148.8781.5551.5551.5521.5461.5840.94714150.4841.6091.6091.6051.6621.6471.60715159.9171.6741.6731.6671.6621.7151.24816164.0101.7221.7191.7121.7021.7681.47817167.5521.7661.7601.7511.7381.8121.58718169.6821.7881.7821.7741.7621.8381.61619176.7401.8621.8561.8461.8321.9171.73620179.7411.8931.8831.8731.8601.9471.76621180.8441.9041.8941.8851.8721.9561.71122185.2481.9491.9371.9291.9142.0001.68323220.4382.6192.6052.5962.5772.7021.85624252.9702.6672.6562.6412.6212.7551.9252.3相似度评评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004a版）》，采用多点校正对10批图谱进行匹配，计算相似度，中位数法生成对照指纹图谱，如图2所示。经计算，样品间相似度在0.989以上，各批样品与生成的对照指纹图谱相似度均在0.989~0.999之间。表明各批次间银黄颗粒存在一定差异，但总体上工艺较稳定，产品均一性较好，该方法能较好用于银黄颗粒质量控制。表7相似度计算结果s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10对照指纹图谱s110.9890.9950.9940.9930.9950.9960.9940.9970.9950.996s20.98910.9940.9940.9930.9940.9930.9930.9920.9950.995s30.9950.99410.9990.9990.9980.99910.9980.9991s40.9940.9940.99910.9980.9970.9970.9990.9960.9980.999s50.9930.9930.9990.99810.9970.9970.9990.9950.9970.999s60.9950.9940.9980.9970.99710.9990.9970.9980.9990.999s70.9960.9930.9990.9970.9970.99910.9980.9980.9990.999s80.9940.99310.9990.9990.9970.99810.9960.9980.999s90.9970.9920.9980.9960.9950.9980.9980.99610.9990.998s100.9950.9950.9990.9980.9970.9990.9990.9980.99910.999对照指纹图谱0.9960.99510.9990.9990.9990.9990.9990.9980.9991当前第1页12