红豆杉提取物及检测方法与流程

本发明涉及红豆杉领域，主要是一种红豆杉提取物及检测方法。

背景技术：

申请人在2009-09-18申请了一个名称为：红豆杉无毒提取物的工艺，专利号为：200910152866.3，用于保健品的添加物,可以让人们提前预防肿瘤。可作为抗瘤中成药的添加物,可治疗肿瘤,可减轻患者的痛苦；但是该红豆杉提取物的成份及如何检测红豆杉提取物的成份及含量则一直没有办法解决。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种红豆杉提取物及检测方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种红豆杉提取物，该提取物中主要含有如下原料配比：总黄酮(以芦丁计，按干燥品计算)120-200mg/g，鞣质(按干燥品计算)60-150mg/g，总萜(以紫杉醇计，按干燥品计算)80-200mg/g，紫杉醇按干燥品计算)4.5-10mg/g。

本发明公开了一种红豆杉提取物的检测方法，具体步骤如下：

(1)、总黄酮含量测定：

(1.1)样品处理：称取0.1g红豆杉提取物，置于50ml烧杯中，加入20ml60％乙醇溶液，超声10min，至黄酮类化合物基本提取完全，用60％乙醇定容成50ml；称取1.5～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和；吸取上述乙醇水溶液4ml，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一段时间，待测液被充分吸附后，用95％乙醇洗脱，至流出液基本无色；上述洗出液用洗脱剂95％乙醇定容后即可用于测定；

(1.2)、标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml，分别移入10ml刻度比色管中，加入60％乙醇液至5ml，各加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀后放置60min，加入1.0mol/l氢氧化钠溶液2ml，用60％乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1cm的比色皿，在510nm处测定吸光度，绘制芦丁含量(μg/ml)与吸光度的标准曲线；

(1.3)、样品测定：根据样品中的总黄酮含量高低，取5ml待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处测定吸光度；芦丁浓度在0.0075～0.060mg/ml范围内呈直线，以最小二乘法计算，其回归方程为y＝0.0108x+0.0166，r²＝0.9981；

(1.4)、结果计算：根据标准曲线，求出相当于试样吸光度的芦丁含量，按下列公式求出总黄酮含量：

式中：

x—样品中总黄酮含量(以芦丁计)[mg/g]；

m1—依据标准曲线计算出被测液中总黄酮含量(μg)；

m—试样的质量或者体积(g)；

v1—待测液分取的体积(ml)；

v2—待测液的总体积(ml)；

(2)、总萜含量测定：

(2.1)样品处理：称取0.05g红豆杉提取物，置于50ml烧杯中，加入15ml60％乙醇溶液，超声10min，用60％乙醇溶液定容至50ml；称取1.5～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和；吸取上述乙醇水溶液5ml，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一段时间20min，待测液被充分吸附后，先用30％乙醇溶液冲洗，舍去洗脱液，再用60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液20ml左右，用60％乙醇溶液定容至25ml，得到待测液；

(2.2)、标准曲线的绘制：准确吸取紫杉醇标准溶液0ml、1.00ml、2.00ml、2.50ml、3.00ml、4.00ml，分别移入50ml小烧杯中，于80℃水浴蒸干或加氮气吹干，然后加入0.4ml5％香草醛冰醋酸溶液，混匀，再加入1ml高氯酸，混匀，60℃水浴加热15min后移入冰浴中冷却，并加入5ml冰醋酸，混匀后置室温下，在15～30min内，在565nm处测定吸光度，绘制紫杉醇含量mg与吸光度的标准曲线；

(2.3)、样品测定：根据样品中的总萜含量高低，取10ml待测液，按标准曲线制备操作步骤于565nm处测定吸光度；紫杉醇浓度在0.25～1.00mg范围内呈直线，以最小二乘法计算，其回归方程为y＝0.7945x-0.0324，r²＝0.9993；

(2.4)、根据标准曲线，求出相当于试样吸光度的紫杉醇含量，按下列公式求出总萜含量：

式中：

x—样品中总萜含量(以紫杉醇计)[mg/g]；

m1—依据标准曲线计算出被测液中总萜含量(mg)；

m—试样的质量或者体积(g)；

v1—待测液分取的体积(ml)；

v2—待测液的总体积(ml)；

(3)、紫杉醇含量测定：

(3.1)对照品溶液的制备：精密称取紫杉醇5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得浓度为0.5mg/ml的紫杉醇标准液；量取1ml紫杉醇标准液，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得浓度为0.05mg/ml的紫杉醇对照品溶液；

(3.2)绘制标准曲线：分别取紫杉醇对照品溶液0.5、1、2、2.5、3、4ml，用甲醇稀释成10ml，均仅进样20μl，按照色谱条件进行测定，分别精密进样；测定峰面积，以对照品的质量μg为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线；结果显示紫杉醇的标准曲线在0.25μg～3.0μg范围内呈直线，以最小二乘法计算，其回归方程为：y＝499.1x-68.785，r²＝0.9999；

(3.3)供试品溶液的制备：精密称取红豆杉提物0.25g，用60％乙醇超声10min溶解，定容至25ml容量瓶，吸取溶液过0.45μm微孔滤膜，即得；

(3.4)样品测定：根据样品中的紫杉醇含量高低，取供试品溶液，按照色谱条件进行测定，进样20μl，测定峰面积；

(3.5)结果计算：根据标准曲线，求出相当于试样峰面积的紫杉醇含量，按下列公式求出紫杉醇含量：

式中：

x—样品中紫杉醇含量[mg/g]；

m1—依据标准曲线计算出被测液中紫杉醇含量(mg)；

m—试样的质量或者体积(g)；

v1—待测液进样的体积(μl)；

v2—待测液的总体积(ml)。

所述的色谱条件：cosmosilc18色谱柱(4.16×250mm)；检测波长：227nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相：乙腈-水44-56；紫杉醇出峰时间：30min。

本发明的有益效果为：对三种功效成分总黄酮、鞣质、萜类的确定及四种成份含量测定等质量标准相关项目的检测分析，最终形成完整的减毒红豆杉提取物企业标准。

附图说明

图1为本发明中芦丁标准曲线示意图。

图2为本发明中紫杉醇标准曲线示意图1。

图3为本发明中紫杉醇标准曲线示意图2。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明做详细的介绍：

本发明以红豆杉(树枝、树根、树皮、树干，不包括树叶)为原料，经含水乙醇提取、浓缩、萃取、干燥、粉碎等特定加工工艺制成的以黄酮、酚类、萜类、紫杉醇为主要指标成分的植物提取物(详见发明专利，专利号200910152866.3)。

这种红豆杉提取物，该提取物中主要含有如下原料配比：总黄酮(以芦丁计，按干燥品计算)120-200mg/g，鞣质(按干燥品计算)60-150mg/g，总萜(以紫杉醇计，按干燥品计算)80-200mg/g，紫杉醇按干燥品计算)4.5-10mg/g。其中鞣质按《中华人民共和国药典(2015年版)》四部通则2202进行检测。

总黄酮含量测定：

1试剂

1.1亚硝酸钠：分析纯。

1.2硝酸铝：分析纯

1.3氯仿：分析纯

1.4无水乙醇：分析纯。

1.5甲醇：分析纯。

1.6聚酰胺树脂：60～80目。

1.7芦丁标准品：成都曼思特生物科技有限公司

1.8芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥至恒重的芦丁标准品15.0mg，用甲醇溶解并定容至100ml，配成150μg/ml的芦丁标准溶液。

2仪器

2.1分光光度计

2.2恒温水浴锅

2.3真空泵

3分析步骤

3.1样品处理：称取0.1g红豆杉提取物，置于50ml烧杯中，加入20ml60％乙醇溶液，超声10min，至黄酮类化合物基本提取完全，用60％乙醇定容成50ml。

称取1.5～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述乙醇水溶液4ml，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一段时间，待测液被充分吸附后，用95％乙醇洗脱，至流出液基本无色，一般收集20ml即可。上述洗出液用洗脱剂(95％乙醇)定容后即可用于测定。

3.2标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml(相当于芦丁0μg、75μg、150μg、300μg、450μg、600μg)，分别移入10ml刻度比色管中，加入60％乙醇液至5ml，各加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀后放置60min，加入1.0mol/l氢氧化钠溶液2ml，用60％乙醇定容至刻度，以零管为空白，摇匀后用1cm的比色皿，在510nm处测定吸光度，绘制芦丁含量(μg/ml)与吸光度的标准曲线。

3.3样品测定：根据样品中的总黄酮含量高低，取5ml待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处测定吸光度(样品如有沉淀，应过滤后测定)。

芦丁浓度在0.0075～0.060mg/ml范围内呈直线，以最小二乘法计算，其回归方程为y＝0.0108x+0.0166，r²＝0.9981。

4结果计算

根据标准曲线，求出相当于试样吸光度的芦丁含量，按下列公式求出总黄酮含量：

式中：

x—样品中总黄酮含量(以芦丁计)[mg/g]；

m1—依据标准曲线计算出被测液中总黄酮含量(μg)；

m—试样的质量或者体积(g)；

v1—待测液分取的体积(ml)；

v2—待测液的总体积(ml)。

计算结果保留三位有效数字。

表1.红豆杉提取物总黄酮含量测定数据

总萜含量测定：

1试剂

1.1冰醋酸：分析纯。

1.2高氯酸：分析纯

1.3乙酸乙酯：分析纯

1.4石油醚：分析纯。

1.5甲醇：分析纯。

1.6乙醇：分析纯。

1.7聚酰胺树脂：60～80目。

1.8香草醛：5％香草醛冰醋酸溶液(m/v)

1.9紫杉醇标准品：成都曼思特生物科技有限公司

1.10紫杉醇标准溶液：精确称取紫杉醇标准品12.5mg，用甲醇溶解并定容至50ml，配成0.25mg/ml的芦丁标准溶液。

2仪器

2.1分光光度计

2.2恒温水浴锅

2.3超声波提取器

2.4分析天平

3分析步骤

3.1样品处理：称取0.05g红豆杉提取物，置于50ml烧杯中，加入15ml60％乙醇溶液，超声10min，用60％乙醇溶液定容至50ml。

称取1.5～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述乙醇水溶液5ml，沿层析柱慢慢滴入柱内，放置一段时间20min，待测液被充分吸附后，先用30％乙醇溶液冲洗，舍去洗脱液，再用60％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液20ml左右，用60％乙醇溶液定容至25ml，得到待测液。

3.2标准曲线的绘制：准确吸取紫杉醇标准溶液0ml、1.00ml、2.00ml、2.50ml、3.00ml、4.00ml(相当于芦丁0mg、0.25mg、0.50mg、0.625mg、0.75mg、1.00mg、)，分别移入50ml小烧杯中，于80℃水浴蒸干(或加氮气吹干)，然后加入0.4ml5％香草醛冰醋酸溶液，混匀，再加入1ml高氯酸，混匀，60℃水浴加热15min后移入冰浴中冷却，并加入5ml冰醋酸，混匀后置室温下，在15～30min内，在565nm处测定吸光度，绘制紫杉醇含量(mg)与吸光度的标准曲线。

3.3样品测定：根据样品中的总萜含量高低，取10ml待测液，按标准曲线制备操作步骤于565nm处测定吸光度(样品如有沉淀，应过滤后测定)。

紫杉醇浓度在0.25～1.00mg范围内呈直线，以最小二乘法计算，其回归方程为

y＝0.7945x-0.0324，r²＝0.9993。

4结果计算

根据标准曲线，求出相当于试样吸光度的紫杉醇含量，按下列公式求出总萜含量：

式中：

x—样品中总萜含量(以紫杉醇计)[mg/g]；

m1—依据标准曲线计算出被测液中总萜含量(mg)；

m—试样的质量或者体积(g)；

v1—待测液分取的体积(ml)；

v2—待测液的总体积(ml)。

计算结果保留三位有效数字。

表2.红豆杉提取物总萜含量测定数据

紫杉醇含量测定：

1试剂

紫杉醇标准品(成都曼思特生物科技有限公司)，甲醇、乙腈(色谱纯，fisher公司)，哇哈哈纯净水

2仪器

agilenttechnologies1200series高效液相色谱仪，超声波提取器，分析天平，旋转蒸发仪

3分析步骤

3.1色谱条件：cosmosilc18色谱柱(4.16×250mm)；检测波长：227nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；进样量：20μl；流动相：乙腈-水44-56；紫杉醇出峰时间：30min。

3.2对照品溶液的制备：精密称取紫杉醇5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得浓度为0.5mg/ml的紫杉醇标准液。量取1ml紫杉醇标准液，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，制得浓度为0.05mg/ml的紫杉醇对照品溶液。

3.3标准曲线：分别取紫杉醇对照品溶液0.5、1、2、2.5、3、4ml，用甲醇稀释成10ml，均仅进样20μl，按照3.1项下色谱条件进行测定，分别精密进样。测定峰面积，以对照品的质量μg为横坐标，峰面积y为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示紫杉醇的标准曲线在0.25μg～3.0μg范围内呈直线，以最小二乘法计算，其回归方程为：

y＝499.1x-68.785，r²＝0.9999。

3.4供试品溶液的制备：精密称取红豆杉提物0.25g，用60％乙醇超声10min溶解，定容至25ml容量瓶。吸取溶液过0.45μm微孔滤膜，即得。

3.5样品测定：根据样品中的紫杉醇含量高低，取供试品溶液，按照3.1项下色谱条件进行测定，进样20μl，测定峰面积。

4结果计算

根据标准曲线，求出相当于试样峰面积的紫杉醇含量，按下列公式求出紫杉醇含量：

式中：

x—样品中紫杉醇含量[mg/g]；

m1—依据标准曲线计算出被测液中紫杉醇含量(mg)；

m—试样的质量或者体积(g)；

v1—待测液进样的体积(μl)；

v2—待测液的总体积(ml)。

表3.红豆杉提取物紫杉醇含量测定数据

可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。