一种吴茱萸药材特征图谱的构建方法和吴茱萸药材质量检测方法与流程

本发明属于中药材技术领域，具体涉及一种吴茱萸药材特征图谱的构建方法和吴茱萸药材质量检测方法。

背景技术：

吴茱萸首载于《神农本草经》，具有温中散寒、舒肝止痛的功效，常用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、呕吐吞酸、五更泄泻等症。吴茱萸药材中所含化学成分丰富，成分类型包括生物碱、苦味素、萜类、黄酮、香豆精、甾体、挥发油、木脂素、多糖等,其中生物碱和苦味素类化合物为其主要有效成分。近年来，吴茱萸药材价格居高不下，市场上逐渐衍生出一些混伪品，主要有臭辣树、峴氏吴茱萸、花椒属植物未成熟或近成熟果实等。

传统的药材及其提取物评价指标具有很大的局限性。《中国药典》(2010年版一部)吴茱萸项下仅以吴茱萸药材中总碱和柠檬苦素含量控制吴茱萸的质量，未能较全面地反映吴茱萸及其提取物中其他成分的情况。虽然已有一些工作对吴茱萸药材进行了指纹图谱研究及其化学成分的含量测定研究，但迄今为止仍然缺少有效可靠的质量控制与品质评价方法。目前对吴茱萸药材的质量评价研究多集中于2～3种主要有效成分的含量测定和指纹图谱研究，但共有峰较少，各色谱峰的分离度较低，不能对吴茱萸药材的质量进行有效的鉴别。

目前的伪品中，比如密果吴萸，其化合物指纹峰和吴茱萸药材的共有峰具有相似的地方，采用现有的吴茱萸特征图谱的构建方法构建的图谱，其特征峰的数量较少，不能全面的代表吴茱萸的特征，致使在检测伪品，特别是检测与吴茱萸近缘种的药材时，难以准确无误的判断其是否为伪品，给鉴定工作带来很大难度。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种吴茱萸药材特征图谱的构建方法和吴茱萸药材质量检测方法。

本发明提供一种吴茱萸药材特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

1)供试品溶液的制备：称取吴茱萸药材粉末，加入乙醇和/或甲醇，超声处理，定容，过滤，取滤液，得吴茱萸药材供试品溶液；

2)对照品溶液的制备：对照品为绿原酸、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸卡品碱，将上述对照品以及甲醇混合，定容，得到对照品溶液；

3)高效液相色谱检测：

色谱条件为：色谱柱为c18反相色谱柱；柱温为30～40℃；检测波长为245nm，采用流动相a为乙腈，流动相b为0.2～0.4％体积浓度的甲酸水溶液，总流速为0.8～1ml/min，分析时间为95min；进行梯度洗脱，梯度洗脱程度见下表1：表1梯度洗脱程序表

5)吴茱萸药材对照特征图谱建立：吸取吴茱萸药材供试品溶液、对照品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪中，用步骤3)的高效液相色谱检测，匹配20个共有峰，确定9个特征峰，建立吴茱萸药材特征图谱。所述9个特征峰中，其中8号峰、12号峰、14号峰、15号峰和18号峰分别为绿原酸、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱。

本发明通过乙醇和甲醇共同对吴茱萸药材进行处理，得到特定的吴茱萸药材供试品溶液，处理效果好，药材有效成分得以充分提取，结合后续的流动相b，即0.2-0.4％的甲酸水溶液，使吴茱萸药材中的有效成分得以充分分离，形成20个共有峰，9个特征峰，远远超出了当初的预估，其稳定性非常好，精密度较高、重现性良好，以之检测吴茱萸药材的真伪。

所述步骤1)所述供试品溶液的制备方法中，所述乙醇的体积浓度为70％，甲醇的体积浓度为30％。

所述步骤1)所述供试品溶液的制备方法中，超声处理前，还加入氯化钠水溶液和丙酮，所述氯化钠水溶液的浓度为0.5mol/l，所述乙醇和/或甲醇、氯化钠水溶液和丙酮的重量配比优选为12-15:0.5-2:4-5，更优选为14:1:5，最优选为所述乙醇和甲醇混合溶液、氯化钠水溶液和丙酮的重量配比为14:1:5。

所述步骤3)的色谱条件中，色谱柱为cl8色谱柱，柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm。

还包括特征峰的指认，步骤为：采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术进行测定，其中质谱条件为：液质分析采用分流设置，分流比1:4，正、负离子模式扫描；毛细管电压3500v；离子源温度320℃；雾化器压力35psi；干燥器体积流量8l/min；锥孔电压65v；干燥器温度350℃；碎片电压130v；质量数扫描范围m/z100～1500；采样频率0.1s，间隔0.02s；碰撞能量分别采用5～50ev。

所述吴茱萸药材特征图谱有9个特征峰，所述特征图谱的9个特征峰的相对保留时间如下表2，相对保留时间在规定值的±5％内。

表2特征图谱9个特征峰的相对保留时间及相对标准偏差

本发明还提供一种吴茱萸药材质量检测方法，包括如下步骤：

按照步骤1)的方法制备吴茱萸药材待检品溶液，按照步骤3)的方法对吴茱萸药材待检品溶液；按照步骤4)的方法构建吴茱萸药材待检品溶液的特征图谱，将其和吴茱萸药材特征图谱进行比较，根据比较结果，检测吴茱萸药材待检品的真伪。

本发明步骤2)中所用甲醇为纯甲醇，科密欧化学试剂有限公司供应的。

本发明所述乙腈为色谱纯，美国tedia公司供应的。

目前，常采用超声波提取来制备吴茱萸药材供试品溶液，提取所用的溶剂为甲醇，采用此方法得到的供试品溶液，后期用高效液相色谱测定的特征谱图中，特征峰的数量较少，峰形不明显，不能对吴茱萸药材的质量进行有效的鉴别。本发明采用超声提取，并且提取的溶剂为体积浓度70％的乙醇水溶液、0.5mol/l的氯化钠溶液和丙酮三者混合得到的混合液，此三种物质共同配合对吴茱萸药材进行超声提取，得到的供试品溶液，后期用高效液相色谱测定的特征谱图中，峰的数量多，并且峰形好，对吴茱萸药材的质量能进行有效的鉴别。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用超声波提取，并且提取的溶剂为体积浓度70％的乙醇水溶液、0.5mol/l的氯化钠溶液和丙酮三者混合得到的混合液，此三种物质共同配合对吴茱萸药材进行超声波提取，得到的供试品溶液，后期用高效液相色谱测定的特征谱图中，峰的数量多，并且峰形好，峰的分离度好，并且重复高，对吴茱萸药材的质量能进行有效的鉴别。

2、本发明针对吴茱萸药材存在的质量控制问题，建立了吴茱萸药材的特征图谱，同时采用uplc-q-tof-ms/ms进行相关物质基础研究的确认，标定了9个特征峰，采用本发明建立的吴茱萸药材的特征图谱，可充分展示吴茱萸药材的化学成分的特征，特征峰信息量丰富，该方法重现性良好，准确可靠，通过所建立的特征图谱可以实现对吴茱萸药材及相关伪品全面而有效的鉴别，能有效地监控吴茱萸药材的质量，为吴茱萸药材质量的全面、有效控制提供了理论和实践基础。

3、本发明吴茱萸药材特征图谱检测方法对各供试品的前处理方法简单，特征性成分保留完整，且供试品溶液稳定。

4、本发明的高效液相色谱方法精密度较高、重现性良好，具有一定的专属性。

附图说明

图1为不同流动相的吴茱萸药材hplc图，其中a为流动相乙腈-0.2％甲酸溶液，b为流动相乙腈-0.1％甲酸溶液。

图2为检测波长为245nm的吴茱萸药材特征图。

图3为检测波长为210nm的吴茱萸药材hplc图。

图4为最优色谱条件的吴茱萸药材特征图谱。

图5为现有技术中的流动性梯度条件下的吴茱萸药材特征图谱。

图6为吴茱萸药材对照特征图谱。

图7为25批吴茱萸药材特征图谱。

图8为吴茱萸药材供试品溶液正负离子模式下总离子流图，其中a为负离子模式，b为

正离子模式。

图9为两种不同的提取溶剂提取供试品的特征图谱。a为乙醇-甲醇--氯化钠溶液-丙酮(重量配比为14:1:5)的混合溶剂提取供试品的hplc图，b为70％乙醇提取供试品的hplc图。

图10为吴茱萸正品和伪品的特征图谱。a为吴茱萸正品hplc图；b为吴茱萸伪品hplc图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围内。

实施例1

吴茱萸药材特征图谱的建立

为使药材有足够的代表性，收集不同产地的药材或不同商品规格等级的药材作为供试品。

仪器与材料

agilent1200series高效液相色谱系统，ae240型电子分析天平(mettlertoledo)，kq2200b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。甲酸(分析纯，科密欧化学试剂有限公司)，乙腈为色谱纯(美国tedia公司)，水为怡宝纯净水，其他试剂均为分析纯。

色谱条件的选择

(1)流动相的选择：选择乙腈和甲酸溶液做流动相，考察了乙腈-0.1％甲酸溶液、乙腈-0.2％甲酸溶液对色谱峰的影响，结果见图1，乙腈-0.2％甲酸溶液作为流动相的色谱峰峰形及分离度较乙腈-0.1％甲酸溶液体系好，故选择乙腈-0.2％甲酸溶液作为流动相。

(2)检测波长的选择：吴茱萸药材的检测波长多见210nm和245nm，选择210nm和245nm进行试验，结果见图2和图3，发现245nm条件下吴茱萸药材色谱图峰形较210nm下色谱峰数量多、峰形好，基线较平，故最终确定245nm波长下检测。

(3)梯度选择：根据峰形及分离度筛选最优色谱条件为inertsustaincl8色谱柱(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为245nm。梯度洗脱程序见表1，色谱峰参数见表3，色谱图见图4。

表1梯度洗脱程序表

表3色谱峰参数

从表3中的数据可知，此条件能较好实现主要色谱峰的分离(分离度均大于1.5)，峰形较好，理论塔板数也较高。因此初步选择该条件为吴茱萸特征特征图谱建立的色谱条件。

具体步骤为：

1)供试品溶液的制备：称取吴茱萸药材粉末，精密称定，加入体积浓度70％的乙醇和30％的甲醇混合溶液，称重，浸泡，超声提取，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得吴茱萸药材供试品溶液。

2)对照品溶液的制备：取绿原酸、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱对照品，加甲醇制成每1ml含绿原酸0.2mg,去氢吴茱萸碱0.1mg，含吴茱萸碱0.5mg，吴茱萸次碱80μg，吴茱萸卡品碱0.5mg的混合溶液。

3)高效液相色谱检测：以步骤3)选定的色谱条件进行高效液相色谱检测。

4)吴茱萸药材对照特征图谱建立：吸取吴茱萸药材供试品溶液、对照品溶液进样体积各5μl，注入高效液相色谱仪中，用步骤3)的高效液相色谱检测，匹配20个共有峰，确定9个特征峰，建立吴茱萸药材特征图谱。

方法学验证

1、精密度试验

精密吸取同一份吴茱萸供试品溶液，在上述液相色谱条件下，重复进样6次，每次进样10μl，以12号峰为参照峰(s)，各特征峰相对保留时间的rsd＜5.0％，相对峰面积的rsd＜3.0％，表明仪器精密度良好。

2、稳定性试验

精密吸取同一批次吴茱萸供试品溶液，分别于供试品溶液制备后第0，2，6，12，18，24h进样，以12号峰为参照峰(s)，各特征峰相对保留时间的rsd＜3.0％，相对峰面积的rsd＜3.0％，表明供试品溶液在制备后24h内稳定。

3、重复性试验

取同一批次吴茱萸药材粉末，按供试品制备方法制备6份供试品溶液，在上述液相色谱条件下，分别进样，记录特征图谱，以12号峰为参照峰(s)，各特征峰相对保留时间的rsd＜3.0％，相对峰面积的rsd＜3.0％，表明该方法的重复性良好。

4、吴茱萸药材对照特征图谱建立

吸取步骤1)、2)所得的吴茱萸药材供试品溶液、对照品溶液进样体积各5μl，注入高效液相色谱仪中，用高效液相色谱法测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立吴茱萸对照特征图谱，见图6，确定具有9个特征峰，其中8号峰、12号峰、14号峰、15号峰和18号峰分别为绿原酸、去氢吴茱萸碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸卡品碱。图5为现有技术中能做到的最好的流动性梯度条件下的吴茱萸药材特征图谱，说明最优流动相梯度下的效果更好。

本发明按照上述吴茱萸药材特征图谱的检测方法，通过对25批吴茱萸药材样品构建特征图谱并进行分析比较，找出其共有特征峰，共有20个共有峰，得到吴茱萸药材的特征图谱，见图7。

实施例2

供试品溶液的制备方法为：称取吴茱萸药材粉末，精密称定，加入体积浓度70％的乙醇水溶液、30％的甲醇水溶液、0.5mol/l的氯化钠溶液和丙酮，称重，浸泡，超声提取，放冷，再称定重量，用同种溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得吴茱萸药材供试品溶液。

其他步骤和实施例1相同。

实施例3

吴茱萸药材的质量检测方法

按照步骤1)的方法制备吴茱萸药材待检品溶液，按照步骤3)的方法对吴茱萸药材待检品溶液；按照步骤4)的方法构建吴茱萸药材待检品溶液的特征图谱，将其和吴茱萸药材特征图谱进行比较，根据比较结果，检测吴茱萸药材待检品真伪。

将25批吴茱萸药材特征图谱与批吴茱萸药材对照特征图谱进行比较，该待测样品能检出9个特征峰，与对照特征图谱的相似度为0.989，判定该待测样品符合质量要求，为合格产品。

25批不同产地吴茱萸药材特征图谱有9个特征峰，其中12号峰，峰面积相对较大，重复性好，作为参照峰(s)，将相对保留时间的平均值作为规定值，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％。将其中4个相对保留时间的平均值作为规定值，分别为：0.56(8号峰)，1.00(12号峰)，1.24(14号峰)，1.28(15号峰)，1.35(16号峰)，1.50(17号峰)，1.53(18号峰)，1.58(19号峰)，1.64(20号峰)。9个特征峰相对保留时间见表4。

表4特征图谱4个特征峰的相对保留时间及相对标准偏差

8)吴茱萸药材特征图谱特征峰的指认

(1)色谱条件和质谱条件

利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术(uplc-q-tof-ms/ms)进行测定。

色谱条件：同上述确定的最佳色谱条件。

质谱条件：液质分析采用分流设置，分流比1:4，离子化模式:esi–&esi+；毛细管电压3500v；离子源温度320℃；雾化器压力35psi；干燥器体积流量8l/min；锥孔电压65v；干燥器温度350℃；碎片电压130v；质量数扫描范围m/z100～1500；采样频率0.1s，间隔0.02s；碰撞能量分别采用5～50ev。

(2)供试品溶液的制备：同实施例项下“供试品溶液的制备”。

(3)对照品溶液的制备：同实施例项下“对照品溶液的制备”。

(4)测定方法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入uplc-q-tof-ms/ms高分辨质谱仪，测定，即得。

(5)结果分析

对供试品中化学成分进行定性分析，得到的正、负离子模式的质谱总离子流图，见图8。

使用masshunter质谱工作站进行质谱数据处理，对照品比对，并根据各化学成分的保留时间、紫外吸收及一、二级质谱信息，结合考文献数据进行化合物分析鉴定。从吴茱萸供试品中初步指认了9个化合物，结果见表5。

表5吴茱萸药材uplc-q-tof-ms/ms鉴定结果

实施例4

为了说明本发明的洗脱梯度等条件对结果的影响，本发明人比较了本发明的方法和现有技术中的方法，对化合物的辨识数量上的区别。现有技术选取为：苏秀丽,印敏,徐曙,等.uplc-q-tof-ms法分析吴茱萸化学成分[j].中成药,2017,39(6):1223-1227.本发明能辨别出更多的化合物。对比例只能辨识25种，本方法辨识35种，对化合物的辨识数量上提高了1.4倍；并且4种化合物(化合物26、28、31、34)首次在吴茱萸药材中发现，从侧面说明了本方法的有效性。具体见表6。

表6吴茱萸hplc-q-tof-ms/ms分析结果

实施例5

为了说明不同的提取溶剂对吴茱萸特征图谱构建的影响，本发明比较了两种不同的提取溶剂的提取效果，结果如图9所示。a为乙醇-甲醇--氯化钠溶液-丙酮(重量配比为14:1:5)的混合溶剂提取供试品的hplc图，b为70％乙醇提取供试品的hplc图。

实施例6

在判断吴茱萸伪品时，只需要比对正品和伪品的特征图谱，即可判断其是否为伪品。如图10所示。a为正品吴茱萸药材hplc图，b为伪品hplc图。