一种乙酰胆碱检测试纸条及其应用的制作方法

本发明涉及分析化学领域及生物医学领域，具体包括一种乙酰胆碱检测试纸条及其应用。

背景技术：

乙酰胆碱（acetylcholine，简称ach）作为一种神经递质，在神经细胞中是由胆碱和乙酰辅酶a在胆碱乙酰移位酶的催化作用下合成的。ach能特异性地作用于各类胆碱受体，在组织内能被胆碱酯酶水解破坏。ach作用广泛，对神经系统、心血管系统及胃肠道都有明显作用。脑内的ach与认知活动、神经信号的传递密切相关。有研究表明人体内该物质含量与阿尔兹海默病的症状改善相关。ach的传统检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法，虽然这些方法结果较为准确，但是存在检测所需的仪器设备体积笨重、所需物品价格昂贵、样品处理过程复杂、检测过程需要专业人员进行等缺点。为克服上述缺点，基于生物酶的光学测定法出现了，该方法主要是利用乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，简称ache）可以选择性催化ach水解成胆碱和乙酸，再通过胆碱氧化酶（cholineoxidase，简称chox）催化胆碱而生成过氧化氢（h2o2），过氧化物酶或具有过氧化物酶活性的纳米酶可催化h2o2氧化有机底物产生荧光或颜色产物，从而实现ach的荧光检测（c.i.wang,w.t.chen,h.t.chang.analyticalchemistry,2012,84:9706）与紫外检测（s.b.he,g.w.wu,h.h.deng,a.l.liu,g.w.li,x.h.lin,x.h.xia,w.chen.biosensorsandbioelectronics,2014,6（6）：1543）。但是这两种方法也分别具有检测仪器笨重、检测样品需提纯处理麻烦，需分步反应不能实时检测等缺点。

ache能选择性水解ach，参与细胞的发育和成熟、促进神经元眼、老年痴呆、重症肌无力等）的参考指标。chox可以水解由ach水解产生的胆碱生成h2o2，从而可以通过检测h2o2来间接证明ach的存在。

纳米酶是一种新型的模拟酶，由于其优异的催化活性和在生物传感、食品工艺、环境保护等方面有潜在应用价值而成为人们关注的焦点。纳米酶克服了天然酶的许多缺点，如价格昂贵、易失活和储存条件要求苛刻等，对生物传感、免疫分析、癌症诊断和治疗等领域产生了巨大影响。目前已报道四氧化三铁（fe3o4）纳米酶具有仿过氧化物酶活性，可催化氧化h2o2氧化有机显色底物而产生颜色变化。目前，关于纸上原位生成纳米酶的报道还很少见。

检测试纸条因其体积较小，储存方便，测试简单而广受欢迎。目前，已报道的试纸有尿糖试纸、hiv试纸、毒品检测试纸等。但尚未见关于ach试纸条及智能手机定量检测的报道。虽然有纳米酶用于免疫试纸条的报道，但未见纳米酶用于小分子检测的试纸条的报道，并且两者机理完全不明。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测ach的试纸条。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种检测ach的试纸条及其应用，所述的以滤膜为基底的试纸条可定性定量检测ach。

优选的是，所述试纸条包括样品垫、滤膜、测试条带、控制条带、吸收垫、塑料基底六部分。

进一步优选的是，所述ach检测试纸条的制备过程如下：

（1）将10%的牛血清蛋白（bsa）溶液、1mmol/l的羟基丁二酰亚胺（nhs）、0.5mmol/l的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）混合液滴加到滤膜上，室温下孵育30min后，水洗并干燥；

（2）将4mmol/l的氯化铁溶液（fecl3）、2mmol/l的氯化亚铁溶液（fecl2）和16mmol/l的氨水等体积按顺序依次均匀分散到上步中所得到的滤膜上，室温下孵育1h后，水洗并干燥；

（3）将一定浓度的ache和chox分别滴加到上述的滤膜上，孵育1h后，室温下水洗并干燥；

（4）将上步所得滤膜用裁纸机剪为0.2×0.5cm的试纸带作为检测条带；

（5）将步骤（2）中所得的滤膜使用裁纸机裁剪为0.2×0.5cm的试纸条带作为控制条带；

（6）将样品垫、滤膜、测试条带、控制条带和吸收垫按顺序从右到左彼此接触并粘贴到塑料基底上。

再一步优选的是，所述样品垫为玻璃纤维，所述纤维素膜可以为硝酸纤维素滤膜、尼龙滤膜、吸水纸，所述吸收垫为吸水纸。

所述试纸条可在室温，弱酸性条件下对ach进行定性/定量检测，定性定量检测过程如下：

（1）对含有ach的样品溶液，加入0.5mmol/l的有机显色剂（显色剂为3，3'-二氨基联苯胺（dab）或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（tmb））并调节ph至弱酸性（ph4.0），将15μl待测溶液滴加到ach检测试纸条的样品垫上；

（2）2-5min后观测试纸条上的检测条带与控制条带，若检测条带颜色比控制条带颜色深，则说明样品中含有ach，从而进行定性检测；

（3）将加有样品与显色剂的试纸条，在led灯的照射下用智能手机拍照，使用颜色识别器读取具体检测条带的rgb值，并令bn=b/(r+g+b)，带入bn-浓度曲线方程以计算ach含量，从而实现对ach的定量检测。

本发明的效果是：

1.本发明制备了可快速、现场检测ach的定性定量试纸条；

2.本发明通过在纸上原位生成fe3o4仿酶材料，而简化试纸条制备步骤；

3.本发明利用原位生成fe3o4仿酶材料上的bsa实现两种生物酶的快速固定，提高了天然酶的稳定性，并可改变天然酶的活性ph范围，使两种生物酶与仿酶材料同时发挥活性；

4.本发明所制备的试纸条可通过层析策略排除真实样品中血细胞、有色蛋白等杂质的干扰。

附图说明：

图1为本发明所制备的ach检测试纸条控制条带和检测条带的示意图；

图2为本发明所制备的ach检测试纸条构造图；

图3为本发明实施例提供的ach检测示意图；

图4为本发明实施例提供的检测条带的活性效果图；

图5为本发明实施例提供的ph优化效果图；

图6为本发明实施例提供的试纸条检测照片；

图7为本发明实施例提供的ach检测工作曲线。

具体实施方式

为了更清楚更深入地说明本发明的内容，下面将进一步列举一些实施例，但本发明不局限于所列举的实施例。下列实施例中具体实验条件或方法如未注明，均按本领域的常规条件或方法进行。

实施例1

试纸条的制备：

（1）将10%的bsa、1mmol/l的nhs、0.5mmol/l的edc混合液滴加到尼龙滤膜上（bsa用于提高尼龙滤膜的吸附能力并作为下一步反应的模板，edc/nhs则是为了活化bsa是上的羧基），室温下孵育30min后，水洗并干燥；

（2）将4mmol/l的fecl3溶液、2mmol/l的fecl2溶液和16mmol/l的氨水等体积按顺序先后分散到步骤（1）中所得到的吸附有bsa模板的尼龙滤膜上孵育1h并在室温下干燥，从而在滤膜上原位生成以bsa为模板的四氧化三铁纳米粒子（fe3o4nps），冲洗掉未反应的fecl3、fecl2和氨水，然后在室温下晾干；

（3）将一定浓度的ache和chox滴加到第（2）步中生成fe3o4@bsanps的尼龙滤膜上室温下孵育1h，将fe3o4nps上的羧基与酶上的氨基通过酰胺反应连接到一起，水洗掉未连接的酶后在室温下晾干；

（4）将上述连接有酶的尼龙滤膜用裁纸机剪为0.2×0.5cm的试纸带作为检测条带，具体示意图见说明书附图1（b）所示；

（5）将步骤（2）中所得的滤膜使用裁纸机裁剪为0.2×0.5cm的试纸条带作为控制条带，具体示意图见说明书附图1（a）所示；

（6）将样品垫、尼龙滤膜、测试条带、控制条带和吸收垫从右到左依次叠加并粘贴到塑料基底上，具体示意图见说明书附图2。

实施例2

该试纸条中的检测条带在弱酸性条件下具有ache、chox与仿过氧化物酶的活性，ache可催化ach生成胆碱，chox则可催化胆碱生成h2o2，仿过氧化物酶则催化h2o2和有机显色剂发生显色反应，检测示意图见说明书附图3。

检测条带活性验证：

实验体系a：催化反应体系为包含ach的样品溶液（0.1mmol/l）、上述实施例获得的检测条带（0.2×0.5cm）、有机显色剂tmb（0.5mmol/l）和醋酸盐缓冲液（ph4.0，100mmol/l）。在室温（25℃）下将检测条带浸入含ach和tmb的缓冲溶液中反应5min后，将检测试纸条移除，利用紫外分光光度计检测其在500-800nm内的吸光值，（反应所用有机显色剂还可为dab）。

另做两个对照试验：其中一个对照实验b的催化反应体系中不加检测条带，在与上述实验体系同样条件下反应5分钟后检测吸光值；另一份对照实验c的催化反应体系为检测条带（0.2×0.5cm）浸入醋酸盐缓冲液（ph4.0，100mmol/l）中，在与上述实验体系同样条件下静置5分钟后检测吸光值。

如说明书附图4所示，实验体系a显示出明显的峰，说明检测条带在ph4.0处具有明显的三酶的活性；对照试验b在650nm附近无明显的峰，说明若无检测条带作催化剂将无明显反应；对照试验c在650nm附近无明显的峰，说明实验体系a的峰不是检测试纸条自身的响应峰。

实施例3

检测条带的ph优化：

催化反应体系为：含有ach的样品溶液（100µmol/l）、检测条带（0.2×0.5cm）、有机显色剂tmb（0.5mmol/l）和不同ph的缓冲液（ph1.0−2.0，甘氨酸-盐酸缓冲液；ph3.0−6.0，醋酸-醋酸钠缓冲液；ph6.5−8.0，磷酸盐缓冲液；ph9.0−10.0，tris−盐酸缓冲液；ph11.0−12.0，碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液）。在室温（25℃）下反应5分钟后，将检测条带取出，利用酶标仪检测反应液在650nm处的吸光值。如说明书附图5所示，检测条带在酸性ph下（ph3.0−6.0）表现出三酶活性的活性，并且最适ph在4.0左右。

实施例4

ach的定性分析

具体体系：未知成分的血清溶液，溶液调节ph至弱酸性，并加入0.5mmol/ltmb，将15μl混合溶液滴加到检测试纸条上，5min后观测检测条带与控制条带的颜色，若检测条带颜色比控制条带颜色深，则血清中含有ach，若检测条带与控制条带无颜色差，则血清中无ach。具体检测照片如说明书附图6所示。说明本发明所制备的ach检测试纸条可以定性检测ach。

实施例5

ach的定量检测

检测体系为：包含不同浓度ach的血清溶液（0-10μmol/l），调节ph至弱酸性，分别将含有血清样品滴加到所制备的试纸条上，5min后，按检测浓度从小到大的顺序将试纸条进行排序，在led灯的照射下用智能手机拍照，使用颜色识别器读取具体的rgb值，并由rgb值计算其标准工作曲线，令bn=b/(r+g+b)。具体工作曲线如说明书附图7所示，线性范围为0-500nmol/l，方程为y=0.0024x+0.67，（r²=0.9908）。说明本发明所制备的ach检测试纸条可定量检测ach。