一种浮游动物样品鉴定前的机体复原预处理方法与流程

本发明属于样品保存技术领域，特别涉及一种浮游动物样品鉴定前的预处理方法。

背景技术：

桡足类，隶属于节肢动物门、甲壳纲、桡足亚纲。为小型甲壳动物，体长<3mm，营浮游与寄生生活，分布于海洋、淡水或半咸水中。具统计，全世界桡足类共有7500种，其中海洋桡足类已鉴定的约4500种。桡足类因具有数量较多、分布广、生长周期短、个体小、对环境变化敏感等特点常作为环境监测指标。浮游桡足类作为食物链的关键环节，在水生态系统中起到承上启下的作用。随着国家大力推进水生态文明建设，客观评价水体水质情况，桡足类鉴定工作显得尤为重要。并且，保存较好的桡足类样品是物种鉴定的基础，对研究浮游动物种类组成、群落结结构、生物多样性分析，甚至水生生物学学科发展具有重要意义。因此，桡足类样品的保存质量以及标本制作具有极其重要的现实意义。

目前，固定和保存浮游动物桡足类样品最为普遍的是利用甲醛溶液和鲁戈试剂。例如《水库渔业资源调查规范》保存浮游动物是加入40％的甲醛溶液，体积比是4％；《渔业生态监测规范》是直接加入样品体积4％甲醛；《近岸海域环境监测规范》、《海洋调查规范》、《海洋监测规范》是加入样品体积5％的甲醛溶液，只有《水环境监测规范》是加入样品体积1％的鲁戈试剂。

甲醛固定原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定，终止或减少分解酶的作用，防止自溶。其缺点是甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液ph降低，影响机体结构稳定性性。优点是形态结构保存好，且穿透能力强，组织收缩少。但是利用甲醛溶液固定浮游动物样品，尤其是已经保存较长时间的样品存在诸多不足，桡足类问题尤为突出，最主要的问题如下：多数情况下甲醛溶液固定的桡足类样品，其11对附肢主要包括第一触角、第二触角、大颚、第一小颚、第二小颚、颚足、五对胸足可能会不同程度的蜷缩在体节下面，这导致在显微镜下观察到的桡足类大多是桡足类的侧面观，而非正面观。同时蜷缩的附肢中，第一触角节数、第二触角内、外肢结构及其长短比例、第五胸足等是桡足类鉴定的主要依据，这样给桡足类形态的观察以及物种的鉴定带来了很大的麻烦。但是目前我国国家标准中，浮游动物样品的固定，仍然以加入甲醛溶液为主。

目前已有相关方法针对以上问题尝试进行解决，包括有相关专利选择新的固定剂对样品进行保存。例如专利98108129.0公开了一种动物保存液，该保存液至少由一种钠盐或钾盐类的防腐剂、至少一种多羟基类保色剂和水组成；专利申请cn108207929a公开了一种底栖动物标本的保存方法，先将底栖动物用甲醛溶液浸泡杀菌，然后在双蒸水中浸泡，然后用酒精溶液洗涤后再用双蒸水进行洗涤；cn88105221a公开了一种生物标本保色防腐液，该防腐剂能够保持原色不变，机体柔软新鲜、不萎缩、不变形等特点。但上述专利均是研制了新的固定液，虽然具有较好的效果，由于与国标方法相差甚远，从而无法推广使用。因此，仍需寻求一种在并未改变国标固定方法的基础上，使浮游动物尤其是桡足类鉴定更为方便准确的预处理方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种浮游动物样品鉴定前的机体复原预处理方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种浮游动物样品鉴定前的机体复原预处理方法，包括如下步骤：

(1)将用甲醛固定保存的浮游动物样品过滤，得到浮游动物和固定滤液；

(2)向步骤(1)中得到的固定滤液中加入ph调节剂，调节ph至6.8～7.2，得到机体复原液；

(3)将步骤(1)中得到的浮游动物加入到步骤(2)中得到的机体复原液中，得到浮游动物样品a；

(4)①将步骤(3)中得到的浮游动物样品a在水浴条件下升温至45～55℃保温15～20min，使浮游动物的机体复原；

或：

②将步骤(3)中得到的浮游动物样品a在水浴条件下升温至45～55℃保温15～20min；然后放入摇床中，于45～55℃、50～100r/min条件下震荡15～20min，使浮游动物的机体复原；

(5)自然冷却至室温，得到预处理后的浮游动物样品。

步骤(1)中所述的浮游动物样品优选为桡足类样品；优选为通过13#浮游动物网采集得到的桡足类样品。

步骤(1)中所述的甲醛为符合国标规定的用于固定保存浮游动物样品的甲醛。

步骤(1)中所述的甲醛的添加量为按浮游动物样品体积的3％～6％添加；优选为按浮游动物样品体积的5％添加。

步骤(1)中所述的固定保存的时间为1年以上。

步骤(1)中所述的过滤为采用筛绢进行过滤；优选为采用13#网或同等孔径的筛绢进行过滤。

步骤(2)中所述的ph调节剂优选为tris-hcl缓冲液。

步骤(2)中所述的调节ph优选为将ph值调节至7.0。

步骤(4)①和②中所述的水浴的条件优选为：升温至50℃保温20min。

步骤(4)①和②中所述的水浴为在水浴锅中进行水浴；优选为在hws28型带热恒温水浴锅进行水浴。

步骤(4)②中所述的摇床的条件优选为：50℃，50～100r/min条件下震荡15～20min；更优选为：50℃，80r/min条件下震荡20min。

步骤(4)②中所述的摇床优选为上海申贸恒温设备厂生产的摇床fly-100b。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明针对甲醛溶液固定桡足类浮游动物样品致使附肢蜷缩在体节下面，仅能在显微镜下观察到的桡足类侧面观，蜷缩的附肢中的第五胸足等作为桡足类鉴定的主要依据无法快速准确观察，为此研制已固定机体复原溶液，再利用缓慢升高温度的方法使机体膨胀，利用摇床加快水分子运动，形成一套桡足类样品鉴定前的机体复原预处理方法。

2、本发明根据现有的摇床以及水浴锅设计了一种样品固定架，此样品固定架既可以在水浴的情况下固定浮游动物样品瓶，也可以在摇床上固定浮游动物样品瓶，方便桡足类样品鉴定前的机体复原。

附图说明

图1是采用5％甲醛溶液固定剂保存一年后的桡足类样品的显微镜观察结果图。

图2是采用5％甲醛溶液固定剂保存一年后的桡足类样品经本发明前处理方法处理后的显微镜观察结果图；其中，图a为显微镜下观察到的桡足类样品的背面；图b为显微镜下观察到的桡足类样品的腹面。

图3是在不同温度条件下处理后的桡足类样品的显微镜观察结果图；其中，图a为30℃；图b为40℃；图c为50℃；图d为70℃；图e为80℃。

图4是在不同转速条件下处理后的桡足类样品的显微镜观察结果图；其中，图a为对照(不用摇床)；图b为20r/min；图c为50r/min；图d为100r/min；图e为200r/min；图f为500r/min。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。

实施例1浮游动物样品前处理方法

1、已固定机体复原溶液，包括三部分：

(1)将采集到的浮游动物桡足类(采集地点为西江梧州段，利用13#浮游动物网采集多得)样品，固定剂采用加入样品体积5％的甲醛，贴上标签，放在阴凉干燥的样品间进行保存；保存一年后，用13#网或同等孔径的筛绢将浮游动物桡足类样品过滤，让浮游动物和固定溶液(甲醛溶液)分离；

(2)在过滤的固定溶液中加入tris-hcl缓冲溶液，调节ph至7.0左右(主要是为了中和甲醛氧化成为甲酸引起的ph降低)，得到机体复原液；

(3)将步骤(1)中分离得到的浮游动物加入到步骤(2)中调好ph的机体复原液中，防止加热温度升高引起ph变化对机体造成进一步损伤。

2、利用缓慢升高温度的方法使机体组织膨胀：

(4)将步骤(3)中加入机体复原液的浮游动物桡足类样品固定在水浴锅(hws28型带热恒温水浴锅)中；

(5)缓慢升高水浴的温度，当水浴锅的水温升高到50℃时则停留20min；

(6)停止加热，使样品自然冷却(注意加热时间：加热时若温度过高则破坏细胞，细胞吸水不完全，影响复原效果；若用常温水则复原时间较长)。

3、利用摇床加快水分子运动：

为了加快复原，将步骤(5)中加入了机体复原液的浮游动物桡足类样品经过水浴之后，再放在摇床(摇床fly-100b，上海申贸恒温设备厂)中，50℃，80r/min震荡20min。使水分子快速进入浮游动物机体组织的缝隙内，从而加速其复原。

4、结果：

将采集到的浮游动物桡足类样品，采用5％甲醛溶液固定剂固定保存一年后，经过显微镜镜检，结果如图1所示，从图中可以看到，保存一年后，样品中桡足类附肢蜷缩非常明显。将保存一年后的浮游动物桡足类样品，经上述前处理方法处理后，经过显微镜镜检，结果如图2所示，从图中可以看到，脱水的桡足类附肢已经伸展，肢体柔软，十分有利用于物种鉴定。

实施例2不同温度对比实验

(1)浮游动物样品前处理方法同实施例1，不同之处在于：步骤1(5)中设置的水浴的温度不同，为30℃、40℃、50℃、70℃、80℃五个温度梯度。

(2)结果如图3所示：温度为50℃效果最好；温度为30℃与样品本身相比无变化；温度为80℃则样品过度膨胀，无法作为鉴定使用。

实施例3不同转速对比实验

(1)浮游动物样品前处理方法同实施例1，不同之处在于：步骤3利用摇床加快水分子运动时设置了不同转速下对机体加速复原的效果对比，分别设置对照(不用摇床)，20r/min、50r/min、100r/min、200r/min和500r/min六组实验。

(2)结果如图4所示：对照组有一定的效果，但不明显；50r/min和100r/min处理组效果较好，机体舒展；500r/min机体有一定的脱水效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。