一种针对产苯唑西林酶OXA-48细菌的特异性检测方法与流程

本发明涉及生化分析和耐药细菌检测技术领域，尤其涉及一种针对产苯唑西林酶oxa-48细菌的特异性检测方法以及其在生物医学中的应用，具体涉及采用等温滴定微量热仪记录苯唑西林酶oxa-48在特定条件下催化碳青霉烯类底物时出现的“双相热谱曲线”特征，并根据该特征的出现与否快速判断待测样品是否产oxa-48酶的特异性分析方法。

背景技术：

碳青霉烯类抗生素自1976年被发现以来，一直是抗菌谱最广、抗菌活性最强的非典型β-内酰胺抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。然而，随着临床的大量使用，这类抗生素的疗效正在丧失，许多细菌已经能够通过产碳青霉烯酶水解碳青霉烯类抗生素而使其失活。

基于氨基酸序列相似性，碳青霉烯酶被分为两个超家族：以丝氨酸为活性中心的a和d类，以及活性中心需要金属离子辅助的b类。苯唑西林酶oxa-48是近年来发现的一种新的d类碳青霉烯酶，具有一定的碳青霉烯类药物水解活性，该酶在肠杆菌科中报道较多，其活性不能被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，因此产此类酶的细菌几乎对所有β-内酰胺类抗生素耐药。另外，由于编码该酶的基因位于质粒等可移动遗传因子上，使得该类酶基因可在细菌间广泛传播，从而增大了耐药性蔓延的速度和范围。近期研究表明，产oxa-48细菌已经开始在我国传播，未来极有可能像产kpc和ndm细菌一样爆发流行，更为棘手的是，由于苯唑西林酶oxa-48往往呈现低水平耐药，不容易被美国临床和实验室标准协会推荐的carbanp方法检出，严重影响了对携带oxa-48细菌的监测与防控。由此可见，开发新型、高特异性检测产oxa-48细菌的实验方法已迫在眉睫。

本发明人在前期研究中开发出了一种β-内酰胺类抗生素敏感性的快速检测方法，然而该方法是针对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类等各类β-内酰胺类抗生素的通用型检测方法，因此其选择性和特异性较低，只能提供待测样品对某类β-内酰胺类抗生素是否敏感的信息，而无法提供β-内酰胺酶的具体类别信息，因此其在科学研究及临床实践中的应用价值受到了削弱，另外，作为一种通用型检测方法，虽然它能够提供给我们一些有关β-内酰胺类抗生素耐药性和敏感性方面的有用信息，但其检测灵敏度仍有待提高，我们发现，该方法对耐药水平较低的β-内酰胺酶检测灵敏度及准确性并不理想。

综上，如何在上千种现有β-内酰胺酶中针对特定类别的β-内酰胺酶开发出特异性高的检测方法，为科研及临床提供准确可靠的参考信息，已成为本领域中一个亟待解决的问题，尤其是针对碳青霉烯酶中活性最低、最难检测的oxa-48酶，如何在提高其检测特异性的同时提高检测灵敏性也是一个严峻的挑战。目前为止，检测特异性和灵敏性均理想的oxa-48酶检测方法还少见报道。

技术实现要素：

为了克服现有β-内酰胺类抗生素敏感性检测方法特异性和灵敏性不佳的缺陷，并为活性很低的oxa-48酶提供适宜的检测手段，本发明在反复实验的基础上，通过对各项检测条件进行筛选和优化，建立了一种新的针对产苯唑西林酶oxa-48细菌的高特异性检测方法，以满足医学研究及临床应用的需要。

具体地说，本发明提供了利用等温滴定微量热仪记录碳青霉烯酶中d类苯唑西林酶oxa-48在特定条件下催化碳青霉烯类底物时的实时热谱曲线，并根据该曲线是否具有“双相热谱曲线”特征，快速准确地判断待测细菌样品是否携带oxa-48酶的信息，即待测细菌样品是否为产oxa-48酶细菌。

本发明针对产苯唑西林酶oxa-48细菌的特异性检测方法，包括下述步骤：

(1)将待测细菌样品用包含100mm磷酸、20-320mm氯离子，ph为7.5的缓冲液配制成浓度为od600＝4-20的细菌悬液，然后将该细菌悬液加入等温滴定微量热仪样品池中；

(2)向滴定针中加入由上述相同缓冲液溶解配制的碳青霉烯类抗生素溶液；

(3)将滴定针中的碳青霉烯类抗生素溶液加入等温滴定微量热仪样品池，检测温度为37℃，抗生素终浓度为20-800μm，记录样品池中实时热量变化，直至热量变化回到基线，即所有碳青霉烯类抗生素被水解完全，得到实时热谱曲线；

(4)根据所得到的实时热谱曲线是否具有“双相热谱曲线”特征，判断待测细菌样品是否携带oxa-48酶的信息；如待测细菌样品对碳青霉烯类抗生素具有水解活性，则可通过实时热谱曲线观察到特异性的双相催化过程，从而说明该待测细菌样品中含有苯唑西林酶oxa-48。

优选地，上述检测方法第(1)步骤中所述缓冲液中包含的氯离子浓度为100mm。

优选地，上述检测方法第(1)步骤中所述细菌悬液的浓度为od600＝8。

优选地，上述检测方法中所述待测细菌样品为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。

优选地，上述检测方法中所述碳青霉烯类抗生素为亚胺培南、美罗培南、厄他培南、比阿培南、多尼培南、帕尼培南中的至少一种。

优选地，上述检测方法第(3)步骤中滴定完成时碳青霉烯类抗生素的终浓度为690-720μm。

进一步优选地，上述检测方法第(3)步骤中滴定完成时碳青霉烯类抗生素的终浓度为700μm。

此外，本发明还涉及上述检测方法在制备细菌耐药性检测试剂盒中的应用。

本发明还涉及上述检测方法在制备体外耐药细菌筛选系统中的应用。

综上，本发明为了有效地针对产苯唑西林酶oxa-48细菌进行检测，在检测条件、检测灵敏度、特异性及普适性方面进行了大量实验，并在此基础上建立了上述检测方法。经实验证实，本检测方法具有良好的特异性，我们发现，“双相热谱曲线”是oxa-48酶在特定缓冲液中的催化特性，在能水解碳青霉烯类抗生素的碳青霉烯酶中只有oxa-48采用该水解机理，利用此特点可以将其与a类、b类碳青霉烯酶区分开，因此具有高度特异性。另外，本发明方法检测的信号是催化速率，因此灵敏度高，而且本发明方法操作简单快速，可在20分钟内快速准确地获得样本检测结果，大大简化了检测步骤、节省了检测时间、提高了检测效率。鉴于此，本发明方法的推广应用可满足针对苯唑西林酶oxa-48的医学研究及临床应用需要。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度的纯化苯唑西林酶oxa-48与亚胺培南进行检测灵敏度分析的itc图谱；

图2为实施例2中不同类的碳青霉烯酶oxa-48(d类)、kpc(a类)、ndm(b类)与亚胺培南进行特异性检测实验的itc图谱；

图3为实施例3中标准菌株(nctc-13442)、临床鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌与亚胺培南进行方法普适性测试的itc图谱。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实例中所用等温滴定微量热仪型号为马尔文公司生产的itc200量热仪。

实施例1：苯唑西林酶oxa-48蛋白检测灵敏度分析

本发明提供的检测方法可用于针对苯唑西林酶oxa-48的特异性检测，我们使用纯化的苯唑西林酶oxa-48蛋白与亚胺培南进行检测灵敏度分析。

具体检测步骤如下：

(1)将纯化苯唑西林酶oxa-48蛋白配制在缓冲液(包含100mm磷酸，100mm氯离子，ph7.5)中，用注射器吸取210μl上样至等温滴定微量热仪样品池中；实验中蛋白浓度为10nm、50nm、100nm、200nm、400nm；

(2)用上述缓冲液配制5mm亚胺培南抗生素溶液，上样至滴定针；

(3)设置电脑程序，滴加33μl亚胺培南抗生素溶液至样品池中，实时记录样品池中的热量变化曲线，滴定针转速优选750rpm，检测温度为37℃；

(4)如附图1所示，本方法中纯化的苯唑西林酶oxa-48蛋白检测灵敏度分析结果明显展示了特异性的双相催化过程，说明该方法适用于纯化的oxa-48蛋白质特异性检测；在对梯度浓度蛋白检测的实验中，本方法可以达到的最小检测浓度为10nm，具有优异的灵敏度。

实施例2：对苯唑西林酶oxa-48特异性检测分析

本发明检测方法可以明显区分产oxa-48酶细菌与其他细菌，其中包括其他类型的对碳青霉烯类抗生素有抗性的细菌。本实施例中使用的样品分别是已知产oxa-48酶(碳青霉烯酶d类)菌株、产kpc酶(碳青霉烯酶a类)菌株、产ndm酶(碳青霉烯酶b类)菌株、产esbl类酶(β-内酰胺酶；可水解β-内酰胺酶类抗生素但不能水解碳青霉烯类抗生素)菌株和阴性参照(标准菌株e.coliatcc25922)菌株。

具体检测步骤如下：

(1)用接种环在新鲜血培养板上直接刮取细菌菌落，用缓冲液(包含100mm磷酸，100mm氯离子，ph7.5)配制成od600＝8的细菌悬液，用注射器吸取210μl上样至等温滴定微量热仪样品池中；

(2)用上述缓冲液配制5mm亚胺培南抗生素溶液，上样至滴定针；

(3)设置电脑程序，滴加35μl亚胺培南抗生素溶液至样品池中，实时记录样品池中的热量变化曲线，滴定针转速优选750rpm，检测温度为37℃；

(4)附图2所示依次为亚胺培南溶液滴定产oxa-48酶细菌、产kpc酶细菌、产ndm酶细菌、产esbl类酶细菌和阴性参照细菌的热量变化itc图。结果显示：亚胺培南溶液滴定过程中仅有产oxa-48酶菌株产生热量变化，且明显展示了特异性的双相催化过程；产kpc酶菌株、产ndm酶菌株也可水解亚胺培南，有热量变化但仅展现了单相催化过程，而产esbl类酶菌株和阴性参照菌株均不能水解碳青霉烯类抗生素亚胺培南，没有引起热量变化，符合该菌株对抗生素敏感的特征。

实施例3：对苯唑西林酶oxa-48进行方法普适性测试

附图3为本发明检测方法对标准菌株及临床菌株普适性测试结果。该实施例中使用的产oxa-48标准菌株(nctc-13442)购自atcc细胞库，临床样品是医院分离得到的经分子鉴定携带有oxa-48基因的一株鲍曼不动杆菌和一株肺炎克雷伯菌菌株。

具体检测步骤如下：

(1)用接种环在新鲜血培养板上直接刮取细菌菌落，用缓冲液(包含100mm磷酸，100mm氯离子，ph7.5)配制成od600＝8的细菌悬液，用注射器吸取210μl上样至等温滴定微量热仪样品池中；

(2)用上述缓冲液配制5mm亚胺培南抗生素溶液，上样至滴定针；

(3)设置电脑程序，滴加35μl亚胺培南抗生素溶液至样品池中，实时记录样品池中的热量变化曲线，滴定针转速优选750rpm，检测温度为37℃；

(4)附图3所示依次为亚胺培南溶液滴定产oxa-48标准菌株、临床鲍曼不动杆菌和临床肺炎克雷伯菌的热量变化itc图。结果显示：亚胺培南溶液滴定产oxa-48标准菌株、临床鲍曼不动杆菌和临床肺炎克雷伯菌均产生明显的热量变化，且都具有特异性的双相催化过程，表明本发明方法适用于各种产oxa-48病原细菌的检测。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。