一种基于固态纳米孔技术的多糖单分子结构解析方法与流程

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于固态纳米孔技术的多糖单分子结构解析方法。

背景技术：

寡糖和多糖是自然界中普遍存在的物质，对人体有着多种作用并且参与很多重要的生理过程。其中包括储存和提供能量(包括食物)、生物结构单元(例如纤维素)、治疗功能(例如抗凝肝素)以及生物识别过程中的关键部分。此外，植物细胞壁主要由多糖组成，既是植物直立生长、适应陆生环境的物质基础，又是自然界最丰富的生物质资源材料。多糖存在着高度异质性和多态性，与其在植物生长发育中的多样性功能相适配。

鉴于多糖分子复杂多变的结构，传统的化学分析工具比如质谱、核磁共振谱等手段往往达不到精细结构的分析需求，除了结构多样性之外，多糖样品还可能受到异质性和低丰度的影响，因此需要一种简单可行且灵敏度高的检测手段。

单分子纳米孔检测技术是一种检测灵敏度高、可实现快速检测、对检测样品特异性十分明显的检测技术。该技术在dna、rna以及蛋白质分子的结构、序列和相互作用等的检测中已经占据了重要位置。

目前尚无纳米孔检测多糖分子的技术相关的专利申请。

因此开发一种基于固态纳米孔技术的多糖单分子结构解析方法。以固态纳米孔作为检测工具，在固态纳米孔上进行化学修饰，通过记录的电流信号幅值和阻塞时间来分析过孔分子的结构信息。

技术实现要素：

本发明采用固态纳米孔作为检测工具，在固态纳米孔上进行化学修饰，通过多糖分子在电泳作用下通过纳米孔时与修饰物之间的相互作用所引起的电学参数的变化对糖分子进行分析。同时对比不同修饰物以及不同多糖样品检测的数据，以分析找出更优化的化学修饰物从而对比不同多糖分子间的结构差异。

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于固态纳米孔技术的多糖单分子结构解析方法，具有高灵敏度、高特异性、操作简单、快捷、成本低的优点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于固态纳米孔技术的多糖单分子结构解析方法，其特征在于，所述方法采用化学修饰的固态纳米孔作为检测工具，通过多糖分子在电泳作用下通过化学修饰的纳米孔时与修饰物之间的相互作用所引起的电学参数的变化对多糖分子进行分析。

本发明提出了一种利用化学修饰过的纳米孔对多糖分子进行检测的方法，创造性地将固态纳米孔单分子检测技术应用于多糖分子的检测之中，依照多糖分子通过纳米孔时与孔内修饰物相互作用产生的特征电流信号，建立一套高灵敏度、高特异性的多糖分子检测体系。原理示意图见图1。

优选的，所述固态纳米孔的尺寸为4-6nm。

优选的，所述固态纳米孔位于氮化硅薄膜、二氧化硅薄膜或石墨烯薄膜上，或其他功能性质类似的载体。

优选的，所述化学修饰为硅烷化处理后精氨酸修饰。

进一步，所述硅烷化处理使用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(gops)。

进一步，经过食人鱼溶液处理后，进行硅烷化处理；

本发明的目的还在于提供一种用于检测多糖结构的固态纳米孔芯片的制备方法，其制备操作简单、成本较低。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于检测多糖结构的固态纳米孔芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)固态纳米孔的制备：采用多级电流脉冲击穿法，通过调节脉冲电流和步长，在芯片上制备尺寸为4-6nm的纳米孔；

2)硅烷化修饰：步骤1)获得的芯片经过食人鱼溶液处理后，进行硅烷化处理；

3)精氨酸修饰：步骤2)硅烷化修饰的芯片浸泡于精氨酸溶液中进行精氨酸修饰，清洗后获得用于检测多糖的固态纳米孔芯片。

优选的，所述芯片可选为氮化硅薄膜、二氧化硅薄膜或石墨烯薄膜，或其他性质、功能类似的载体。

优选的，步骤1)所述多级电流脉冲击穿法具体为：所述芯片夹在流动池中，流动池被分隔为两个独立的储液腔：反式腔和顺式腔；在反式腔和顺式腔中分别注入电解液，将顺式腔端接地，通过插入两储液腔的电极连接数字源表，在反式腔端施加电流脉冲，通过调节脉冲电流和步长，在所述芯片上制备纳米孔。

进一步，所述数字源表型号为keithley2450。

进一步，所述电解液为1mol/l氯化钾、10mmol/ltris-hcl和1mmol/ledta的混合水溶液。

优选的，所述硅烷化处理使用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。

进一步，所述硅烷化处理在氮气保护下于干燥的甲苯中进行。

优选的，步骤2)所述食人鱼溶液处理具体为：将步骤1)获得的芯片用丙酮、异丙醇和去离子水分别浸泡，快速烘干，用中等功率的等离子体处理2-5min后，用食人鱼溶液处理，去离子水清洗，烘干。

优选的，所述中等功率的等离子体，其功率为20-30w。

优选的，所述食人鱼溶液为98％浓硫酸和30％过氧化氢溶液按照体积比为7-9:3混合制得。

进一步，为98％浓硫酸和30％过氧化氢溶液按照体积比为9:3混合制得。

优选的，所述精氨酸溶液为精氨酸溶于pbs溶液中获得，其浓度为10mmol/l。

本发明的目的还在于提供一种按照上述的方法制备得到的固态纳米孔芯片。

本发明的目的还在于提供一种上述固态纳米孔芯片用于检测多糖分子结构的方法，其具有操作快捷、灵敏性高、特异性强的特点。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的固态纳米孔芯片用于检测多糖单分子结构的方法：待检测的多糖分子电泳通过所述固态纳米孔芯片上的固态纳米孔，从而产生过孔阻塞电流信号，通过记录的电流信号幅值和阻塞时间来分析过孔分子的结构信息。

优选的，所述电泳过程为：固态纳米孔芯片夹在流动池中，流动池被分隔为两个独立的储液腔：反式腔和顺式腔；在反式腔和顺式腔中分别注入电解液，并在顺式腔中添加待检测多糖，将两储液腔的电极连接电源，通过施加一定的电压驱使多糖分子过孔。

优选的，所述电解液为1mol/l氯化钾、10mmol/ltris-hcl和1mmol/ledta的混合水溶液。

本发明的有益效果在于：本发明提供的采用固态纳米孔对多糖分子进行检测的方法：

1)创造性地将固态纳米孔单分子检测技术应用于多糖分子的检测之中，依照多糖分子通过纳米孔时与孔内修饰物相互作用产生的特征电流信号，建立一套高灵敏度、高特异性的多糖分子检测体系。

2)可同时对比不同修饰物以及不同多糖样品检测的数据，以分析找出更优化的化学修饰物从而对比不同多糖分子间的结构差异。

3)提供了一种化学修饰后的纳米孔芯片，利用gops和精氨酸对纳米孔进行修饰，通过对阻塞电流和过孔时间的分析得到多糖分子的结构相关信息。

附图说明

图1为原理示意图。

图2为利用实施例的精氨酸修饰的氮化硅纳米孔芯片在+100mv电压下检测长链多糖样品的离子电流及阻塞时间分布统计图；其中a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

图3为利用实施例的精氨酸修饰的氮化硅纳米孔芯片在+150mv电压下检测长链多糖样品的离子电流及阻塞时间分布统计图；其中a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

图4为利用实施例的精氨酸修饰的氮化硅纳米孔芯片在-200mv电压下检测长链多糖样品的离子电流及阻塞时间分布统计图；其中a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

图5为利用裸氮化硅纳米孔芯片在+100mv电压下检测多糖样品的离子电流及阻塞时间分布图，其中a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

图6为利用裸氮化硅纳米孔芯片在+150mv电压下检测多糖样品的离子电流及阻塞时间分布图，其中a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

第一步：固态纳米孔的制备

采用多级电流脉冲击穿法在氮化硅(sinx)薄膜芯片上制备6nm左右的纳米孔。

将sinx薄膜基片夹在一对flowcell(流动池)样品池中，样品池被分隔为两个独立的储液腔：反式腔(trans)和顺式腔(cis)。利用橡胶密封圈(o-ring)固定以防止两侧腔室漏液。在trans和cis腔中分别注入1mol/l氯化钾、10mmol/ltris-hcl和1mmol/ledta的混合液作为电解液，将cis端接地，通过插入两储液腔的ag电极连接计算机控制的源表keithley2450，形成一个闭合回路，在trans端施加电流脉冲。通过调节脉冲电流和步长，在sinx薄膜上制备不同尺寸的纳米孔。

第二步：纳米孔化学修饰

将制备好的固态纳米孔进行进一步的化学修饰。

化学修饰分为两步，第一步是将3-glycidyloxyproryltrimethoxy-silane(3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷)固定在孔内，第二步是末端带环氧乙烷的孔内壁进一步与精氨酸(arginine)反应。

首先将纳米孔载体芯片用丙酮、异丙醇和去离子水浸泡，然后快速烘干。接下来用功率20-30w的等离子体处理数分钟后再用食人鱼piranha溶液(v30％h2o2：v98％h2so4＝1：3)处理后，用去离子水清洗多次，烘干备用。在进行第一步修饰3-glycidyloxyproryltrimethoxy-silane(3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷)(gops)时，在氮气保护下于干燥的甲苯中进行，将带有纳米孔的芯片放入gops溶液浸泡数分钟。sinx薄膜经过食人鱼溶液处理过后会带有羟基可与硅烷上的甲氧基结合，对sinx薄膜表面进行硅烷化，以达到化学改性的目的。之后用甲苯、丙酮、异丙醇和去离子水进行清洗。第二步进行l型arginine(精氨酸)修饰。称取arginine溶于pbs溶液中，获得浓度为10mmol/l的arginine溶液，将芯片泡制一段时间，再用pbs溶液清洗后，装进flowcell中以便接下来做纳米孔检测。原理示意图见图1。

实验例1多糖分子的纳米孔检测

为了验证多糖分子在通过纳米孔时与孔内的修饰物之间有相互作用，设计了如下实验：

取实施例1获得的化学修饰的固态纳米孔载体作为实验组，并按照实施例1的第一步制备获得裸孔载体作为对照组，按如下步骤进行实验：

1)本实验检测的长链多糖分子由70多个单糖分子组成，将其用实施例1的电解液稀释为50nmol/l的长链多糖样品，并过滤后加入flowcell的cis端，插入银电极。

2)在同样的操作条件下利用裸孔和修饰孔对多糖分子进行测试，也对比了不同电压下的测试结果。记录电流信号幅值和阻塞时间来分析过孔分子的结构信息。结果见图2-图6。

图2-图4是利用本发明的精氨酸修饰的氮化硅纳米孔在+100mv、+150mv和-200mv电压下检测50nmol/l的长链多糖样品的离子电流及阻塞时间分布统计图，a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

图5、图6是利用裸氮化硅纳米孔在+100mv和+150mv电压下检测50nmol/l的同一多糖样品的离子电流及阻塞时间分布图，a是电流幅值和阻塞时间的统计散点图，a中小图为多糖分子过孔信号图，b是电流幅值与事件数的统计图，c是阻塞时间与事件数的统计柱状图。

从统计图看出，多糖分子在不同电压驱动下穿过纳米孔引起的离子电流变化及阻塞时间是有明显差异的。

对比实验组和对照组的结果，多糖分子通过纳米孔时与孔内修饰物发生相互作用，并产生了信号变化。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。