基于石墨烯生物传感器检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的方法与流程

本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种基于石墨烯生物传感器检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的方法。

背景技术：

这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然构成现有技术。

核糖开关(riboswitch)是一类位于非编码mrna特定区域上的能够直接结合小分子代谢物并通过构象变化以调控基因表达的rna结构元件。核糖开关具有高度保守性，可以折叠成带有口袋的复杂的三维结构，与配体结合的相互作用具有高特异性和选择性，使其成为新一类核酸药物和新型抗生素的靶标。对于核糖开关检测可为分子生物学研究和遗传病诊断提供非常有用的信息，这也对生命科学具有重要意义。

目前，传统的生物分子相互作用检测技术主要包括荧光标记，等温滴定，表面等离子体共振和石英晶体微量天平。然而，这些方法比较耗时，步骤复杂，灵敏度低和检测范围有限。因此，迫切需要找到一种有效而简单的检测生物分子相互作用的方法，用于鸟嘌呤核糖开关和配体之间的识别。近年来，采用碳纳米管(cnts)，硅纳米线和石墨烯制备的场效应晶体管纳米生物传感器在灵敏度，选择性和检测范围方面表现出了高性能。其中，石墨烯场效应晶体管(g-fet)因其石墨烯的优异性能而在生物传感器中引起了广泛关注。在纳米材料中，石墨烯是一种二维平面薄膜，具有许多独特的性质，如高载流子迁移率，高透明度，化学稳定性和易于官能化等。石墨烯的这些独特性质在检测生物分子的场效应晶体管生物传感器应用上具有广阔的发展空间。

技术实现要素：

本发明的一方面是提供一种检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的石墨烯生物传感器，该石墨烯生物无需标记，操作简单，使用方便，并且在较低的使用电压下具有较高的选择性和特异性，安全性好。

本发明关于这方面检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的石墨烯生物传感器的技术方案为：

一种检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的石墨烯生物传感器，由玻璃基底和石墨烯层组成，所述玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡(ito)，两侧氧化铟锡的部分上表面被石墨烯层覆盖，一侧未被石墨烯覆盖的部分作为源级，另一侧未被石墨烯覆盖的部分作为漏级。

本发明的另一方面提供了一种上述石墨烯生物传感器的制备方法，在金属基底上制备石墨烯层，在石墨烯层的上表面涂胶，再将金属基底刻蚀去除使石墨烯层的下表面露出，然后将涂胶的石墨烯层转移到玻璃基底上，使石墨烯的下表面覆盖玻璃基底上表面两侧的氧化铟锡，再放置到有机溶剂中将胶溶解去除，即可获得。

本发明的第三方面提供了一种基于石墨烯生物传感器检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的方法，将上述石墨烯生物传感器接入检测电路，鸟嘌呤核糖开关通过1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯连接到石墨烯上表面，然后向固定有鸟嘌呤核糖开关的石墨烯层上添加含有嘌呤配体的不同浓度的溶液，通过检测栅极电压变化即可获得嘌呤配体与鸟嘌呤核糖开关的亲和力。

本发明的原理为：选用石墨烯为导电层制备生物传感器，以鸟嘌呤核糖开关为探针将其固定在生物传感器件导电沟道，让配体溶液在导电沟道表面流过，由于碱基互补配对原则，配体通过探针吸附在导电沟道表面，使导电材料表面电势发生变化，通过电路系统记录电势变化，从而传输探针与配体相互作用的电化学信号。

本发明的有益效果为：

1.传统的检测技术比较耗时，步骤复杂，灵敏度低和检测范围有限，本发明技术无需标记，操作简单，周期短，检测灵敏度高。

2.本发明能够准确检测出鸟嘌呤核糖开关与嘌呤配体的亲和力，尤其能够准确排列出鸟嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基嘌呤、黄嘌呤与鸟嘌呤核糖开关的结合自由能的顺序。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为石墨烯生物传感器的制作过程示意图；

图2为空石墨烯生物传感器传输特性曲线示意图；

图3为pbase修饰的生物传感器件和鸟嘌呤核糖开关功能化后的传输特性曲线示意图；

图4为四种配体浓度与石墨烯生物传感器△vcnp变化的示意图；

图5为石墨烯生物传感器件的实物图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中存在检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的时间长、步骤复杂、灵敏度低、检测范围有限的不足，为了解决如上的技术问题，本公开提出了基于石墨烯生物传感器检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的方法。

本公开的一种典型实施方式，提供了一种检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的石墨烯生物传感器，由玻璃基底和石墨烯层组成，所述玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡(ito)，两侧氧化铟锡的部分上表面被石墨烯层覆盖，一侧未被石墨烯覆盖的部分作为源级，另一侧未被石墨烯覆盖的部分作为漏级。

该实施方式的一种或多种实施例中，石墨烯层的上表面设有样品池，所述样品池的池底即为石墨烯层。所述样品池内设有栅极。

该实施方式的一种或多种实施例中，玻璃基底的上表面两侧设有氧化铟锡的电阻均为0.9～1.1kω。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述石墨烯层为单层石墨烯。单层石墨烯对于检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的效果更好。

本公开的另一种实施方式，提供了一种上述石墨烯生物传感器的制备方法，在金属基底上制备石墨烯层，在石墨烯层的上表面涂胶，再将金属基底刻蚀去除使石墨烯层的下表面露出，然后将涂胶的石墨烯层转移到玻璃基底上，使石墨烯的下表面覆盖玻璃基底上表面两侧的氧化铟锡，再放置到有机溶剂中将胶溶解去除，即可获得。

该实施方式的一种或多种实施例中，采用化学气相沉积法在金属基底表面制备石墨烯层。

该实施方式的一种或多种实施例中，在金属基底的材质为铜，以甲烷为碳源生长石墨烯层。刻蚀该金属基底的溶液为三氯化铁溶液。

该实施方式的一种或多种实施例中，涂胶的胶体溶液为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)溶液。使用匀胶机旋胶。以使涂胶更加均匀。

该实施方式的一种或多种实施例中，涂胶后放入加热板烘烤后再进行刻蚀。保证胶体凝固，从而保证石墨烯层不发生形变。烘烤温度为145～155℃，时间为25～35min。

该实施方式的一种或多种实施例中，将涂胶的石墨烯层转移到玻璃基底上在水中进行。更容易使涂胶的石墨烯层转移。转移之后，加热去除水分。加热温度为175～185℃，时间为25～35min。该条件小能够更好的去除水分。

该实施方式的一种或多种实施例中，去除胶的有机溶剂为丙酮。

该实施方式的一种或多种实施例中，溶解去胶后在石墨烯层的上表面安装样品池。然后向样品池中插入栅极。所述栅极为ag/agcl栅极。为了防止样品池的材质对传感器的影响，所述样品池的材质与胶的材质一致。

本公开的第三种实施方式，提供了一种基于石墨烯生物传感器检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的方法，将上述石墨烯生物传感器接入检测电路，鸟嘌呤核糖开关通过1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯连接到石墨烯上表面，然后向固定有鸟嘌呤核糖开关的石墨烯层上添加含有嘌呤配体的不同浓度的溶液，通过检测栅极电压变化即可获得嘌呤配体与鸟嘌呤核糖开关的亲和力。

该实施方式的一种或多种实施例中，具体步骤为：

(1)将石墨烯生物传感器件放在探针台上接入检测电路；

(2)加入磷酸盐缓冲液(pbs)，检测一下空器件的传输特性以及调节检测电路中栅极电压范围和源-漏电极的恒电压；

(3)将pbs吸出样品池，清洗干净，加入100mm1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(pbase)孵育1h，测量传输特性；

(4)将pbase吸出样品池，清洗干净，加入鸟嘌呤核糖开关溶液进行检测，测量传输特性；

(5)吸出样品池中的鸟嘌呤核糖开关，清洗干净，再分别加入不同浓度的配体分子与鸟嘌呤核糖开关相互作用，测量在不同浓度下的传输特性；

(6)通过计算、分析获得鸟嘌呤与四种配体分子的结合情况。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(2)中pbs的ph值为7.0，栅极电压范围为-1v～1v，源-漏电极的恒电压为0.5v。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(4)中鸟嘌呤核糖开关用pbs溶解，再将其稀释后进行检测。鸟嘌呤核糖开关序列为：

5’-h2n-gaucauauaaucgcguggauauggcacgcaaguuucuaccgggcaccguaaauguccgacuaugguc-3’。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(5)中配体分子有四种，分别是鸟嘌呤(gua)、2-氨基-6-氯嘌呤(6gu)、2-氨基嘌呤(2bp)、黄嘌呤(xan)。每个配体分子配制的浓度分别为100nm、300nm、500nm、700nm、900nm。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(3)(4)(5)中清洗样品池用的溶液是0.1xpbs。

该实施方式的一种或多种实施例中，所述步骤(6)计算kd和结合自由能δg，计算公式分别为：

δg＝rtlnkd②

其中，指的是当所有结合位点都被配体占据时，对应于栅极电压的有效变化，kd是鸟嘌呤核糖开关与配体之间结合反应的解离常数，c代表配体浓度，r代表构象改变后的鸟嘌呤核糖开关，t是模拟环境中的温度。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1石墨烯生物传感器的制备

如图1所示，一种石墨烯生物传感器件制成需要经过匀胶、加热固化、刻蚀基底、转移、除胶、粘贴样品池过程。

一种石墨烯生物传感器件的制备方法，包括步骤如下：

(1)选用覆有氧化铟锡(ito)导电膜的玻璃作为基底。氧化铟锡设于玻璃基底的两侧，一侧为源极，一侧为漏极。源极与漏极的电阻均为1kω。玻璃基底的尺寸为30×30mm，氧化铟锡导电膜的尺寸分别为30×12mm，厚度为185nm。基底依次采用丙酮、乙醇和去离子水进行超声清洗，每次清洗时间为20min，以使基底表面更加干净。

(2)将采用化学气相沉积法，以铜为基体，甲烷为碳源来生长石墨烯，生产的石墨烯裁剪为1×1cm大小，然后进行涂胶使用匀胶机在石墨烯上表面旋胶，使用的胶为聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)溶液，以使涂胶更加均匀，获得涂好胶的石墨烯/铜。

(3)将涂好胶的石墨烯/铜放在加热板上，加热至150℃烘烤30min。

(4)晾凉后，将pmma/石墨烯/铜放入1m的三氯化铁溶液中进行刻蚀。

(5)待将铜基底刻蚀掉，将pmma/石墨烯薄膜采用去离子水清洗，直至无三氯化铁，然后在去离子水中将pmma/石墨烯薄膜转移到覆有ito玻璃基底上，无pmma的一面与玻璃基底接触且薄膜覆在源-漏极之上。

(6)待转移后，将pmma/石墨烯/玻璃放在加热板上，加热至180℃烘烤30min，这样能更好的去除水分。

(7)待晾凉后，放到丙酮中进行除胶；然后依次采用乙醇、去离子水进行清洗。

(8)在石墨烯/玻璃基底上粘贴样品池，然后将样品溶液加入样品池并将ag/agcl栅极插入样品池形成石墨烯生物传感器。样品池的材质为固体pmma板，尺寸为25×20×10mm固体pmma板开设φ＝0.5mm的通孔作为样品池，石墨烯作为样品池的池底。制备好的石墨烯生物传感器如图5所示。

实施例2鸟嘌呤核糖开关亲和力的检测

基于石墨烯生物传感器检测鸟嘌呤核糖开关亲和力的方法，步骤如下：

(1)将石墨烯生物传感器件放在探针台上接入检测电路；

(2)加入0.1x磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.0)，检测一下空器件的传输特性，结果如图2所示，以及调节检测电路中栅极电压范围为-1v～1v，调节检测电路中源-漏电极的恒电压为0.5v。

(3)将pbs吸出样品池，用0.1xpbs清洗干净，加入100mm1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯(pbase)孵育1h，测量传输特性，检测结果如图3所示。

(4)将pbase吸出样品池，用0.1xpbs清洗干净，鸟嘌呤核糖开关用0.1xpbs溶解，再将其稀释为100nm，加入至样品池进行检测，测量传输特性，检测结果如图3所示。

鸟嘌呤核糖开关序列为：

5’-h2n-gaucauauaaucgcguggauauggcacgcaaguuucuaccgggcaccguaaauguccgacuaugguc-3’(seqidno.1)。

(5)吸出样品池中的鸟嘌呤核糖开关，用0.1xpbs清洗干净，再分别加入不同浓度的配体分子与鸟嘌呤核糖开关相互作用，测量在不同浓度下的传输特性，检测结果如图4所示。

配体分子有四种，分别是鸟嘌呤(gua)、2-氨基-6-氯嘌呤(6gu)、2-氨基嘌呤(2bp)、黄嘌呤(xan)。每个配体分子配制的浓度分别为100nm、300nm、500nm、700nm、900nm。

(6)计算kd和结合自由能δg，分析鸟嘌呤与四种配体分子的结合情况。

计算kd和结合自由能δg的公式分别为：

δg＝rtlnkd②

其中，指的是当所有结合位点都被配体占据时，对应于栅极电压的有效变化。kd是鸟嘌呤核糖开关与配体之间结合反应的解离常数。c代表配体浓度。r代表构象改变后的鸟嘌呤核糖开关。t是模拟环境中的温度，设定为300k。

图2中石墨烯的导电性质随栅电压的变化呈现了“v”型的特征。其中，沟道中的载流子密度和类型(电子/空穴)由栅极电压决定。石墨烯转移特性是由电子和空穴浓度决定的，并由电中性点电压(vcnp)分开。

图3中在通过pbase在石墨烯生物传感器件修饰探针鸟嘌呤核糖开关之后，vcnp向正栅极电压方向偏移。石墨烯的电位变化可以用负静电门控效应来解释。由于鸟嘌呤核糖开关具有带负电荷的三磷酸基团，它可以通过诱导过量的空穴载流子调节石墨烯的费米能级，进而导致vcnp向正栅极电压方向偏移。

图4中随着四种配体的加入，通过公式①的拟合石墨烯生物传感器显示出了四种不同的响应曲线，并获得gr-gua，gr-6gu，gr-2bp，gr-xan的平衡解离常数kd，同时通过公式②计算了结合自由能。发现鸟嘌呤核糖开关与四种配体的kd和结合自由能在△ggr-gua>△ggr-6gu>△ggr-2bp>△ggr-xan的排列顺序与本公开发明人所知的顺序一致。该结果表明该生物传感器可用作亲和生物传感器以量化生物分子结合亲和力。

以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

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