一种通络化痰胶囊的检测方法与流程

本发明属于药品检测技术领域，特别涉及一种通络化痰胶囊中大黄的薄层色谱检测方法。

背景技术：

通络化痰胶囊是在“化痰通络汤”的基础上，加上对脑损伤具有特殊保护作用的熊胆、大黄、天麻、三七、丹参、天竺黄等名贵药材，以现代制药工艺精心研制而成，具有活血通络、化痰熄风的功效。目前，国内外还没有以熊胆单独或复方配制治疗脑血管病的新药或专利，该产品的问世属国内首创。方中大黄是蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的根茎，功能主治为：泻热毒，破积滞，行瘀血，在通络化痰胶囊方中主要发挥活血行瘀、祛除痰湿等作用，是通络化痰胶囊中的重要成分。

中华人民共和国国家药品监督管理局发布的“国家食品药品监督管理局标准(试行)ybz00492009“通络化痰胶囊”中规定了大黄的薄层色谱鉴别方法：取本品2g，研细，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水2ml使溶解，通过d101大孔吸附树脂柱(内径1.7cm，长12cm)，用95％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g，加甲醇20ml超声15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加水2ml溶解，同供试品制备方法相同收集95％乙醇洗脱液，制成对照药材溶液。另取大黄素对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液8μl、对照品溶液2μl分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上层液为展开剂，展开8cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点。在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。

但在实际检验操作过程中发现该薄层色谱检测方法存在供试品及对照药材中大黄酚、大黄素甲醚两种成分所对应的斑点分离度不高的问题，出现念珠状斑点或斑点重合，造成检测结果无法判断或假阴性，不能及时、准确地鉴别出通络化痰胶囊样品中大黄成分，从而导致通络化痰胶囊成品出库滞后，产生巨大的经济损失。

此外标准中大黄薄层色谱鉴别方法使用大孔树脂吸附洗脱工艺处理样品，存在以下几个问题：(1)吸附洗脱过程时间较长，通常需4-6小时，无法快速得到检测结果；(2)样品超声提取后的滤液中含较多复杂成分，难以通过预处理去除，常造成树脂柱出现堵塞现象；(3)树脂中常含有分散剂、致孔剂、惰性溶剂等化学残留，对试验人员身体有一定危害。因此迫切需要一种更准确、高效、安全的大黄检测方法来保证通络化痰胶囊产品的质量。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种专属性强、分离度好、安全性与准确性高的通络化痰胶囊中大黄的薄层色谱检测方法，以使所得图谱达到清晰度高、分离完全、斑点明显、重现性好的要求。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)供试品溶液的制备：取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

(4)薄层色谱展开：吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(10～20∶4～6∶1)的上层溶液为展开剂，展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

(5)结果判定：如果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显5个相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气熏后，日光下检视，斑点变为红色，则说明通络化痰胶囊成品中含有大黄成分；而如果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，若未显示相同颜色的主斑点，则说明通络化痰胶囊成品中不含有大黄成分。

优选的方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；

(2)对照药材溶液的制备：取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；

(3)对照品溶液的制备：取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。

(4)薄层色谱展开：吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液(在-5℃下分层)为展开剂，在-5℃下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

(5)结果判定：如果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显5个相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气熏后，日光下检视，斑点变为红色，则说明通络化痰胶囊成品中含有大黄成分；而如果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，若未显示相同颜色的主斑点，则说明通络化痰胶囊成品中不含有大黄成分。

本发明的有益效果在于：(1)显色结果准确：供试品及对照药材中各主要成分的斑点清晰、重现性好、准确性高，特别是大黄酚、大黄素甲醚的对应斑点实现了有效分离，可作出准确判断；(2)使用乙醚处理样品代替了使用大孔树脂洗脱处理样品，一方面处理时间由4-6小时缩短至40min，大幅节约了时间，提高了效率，可快速得到检测结果，另一方面还减少了对人体健康的潜在危害。

附图说明

图1是对比例1的薄层展开图。

图2是对比例2的薄层展开图。

图3是对比例3的薄层展开图。

图4是对比例4的薄层展开图。

图5是对比例5的薄层展开图。

图6是对比例6的薄层展开图。

图7是实施例1的薄层展开图。

图8是实施例2的薄层展开图。

具体实施方式

下面结合附图并通过对比例和具体实施例来进一步详细说明本发明。

下述对比例、实施例中所涉及的通络化痰胶囊的生产厂家均为山东沃华医药科技股份有限公司，对照药材大黄、大黄素标准品、大黄酚标准品、大黄素甲醚标准品、大黄酸标准品、芦荟大黄素标准品均由中国食品药品检定研究院提供；薄层板：预制硅胶g薄层板，规格为20cm×10cm，未特别注明均由默克化工技术(上海)有限公司提供。其他仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述对比例、实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

对比例1：现行标准大黄薄层色谱鉴别方法。

取通络化痰胶囊2g，研细，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水2ml使溶解，通过d101大孔吸附树脂柱(内径1.7cm，长12cm)，用95％乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g，加甲醇20ml超声15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加水2ml溶解，同供试品制备方法相同收集95％乙醇洗脱液，制成对照药材溶液。另取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录vib)试验，吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液8μl、对照品溶液2μl分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)上层液为展开剂，展开8cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图1所示：左侧①号的大黄酚、②号的大黄素甲醚两种对照品所对应的斑点基本平行，④、⑤、⑥号的三批通络化痰胶囊样品及⑦号对照药材中对应位置的斑点重合严重，无法区分，且除③号大黄素对照品外，多数斑点清晰度较差。

对比例2：常温下采用乙醚处理样品。

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，在25℃下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图2所示：左侧①号的大黄酚、②号的大黄素甲醚两种对照品所对应的斑点基本平行，⑥号的对照药材及⑦号通络化痰胶囊样品中对应位置的斑点重合严重，无法区分，但多数斑点清晰度较对比例1有明显改善。

对比例3：4℃下采用乙醚处理样品。

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液(在4℃下分层)为展开剂，在4℃(冰箱冷藏室)下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图3所示：左侧①号的大黄酚、②号的大黄素甲醚两种对照品所对应的斑点明显不再平行，但④、⑤号的通络化痰胶囊样品及③号对照药材中对应位置的斑点部分重合，呈现念珠状斑点，无法完全区分，且多数斑点清晰度较差。

对比例4：0℃下采用乙醚处理样品。

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液(在0℃下分层)为展开剂，在0℃(冰箱冷藏室)下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图4所示：左侧①号的大黄酚、②号的大黄素甲醚两种对照品所对应的斑点明显不再平行，④号的对照药材及⑤、⑥号通络化痰胶囊样品中对应位置的斑点已基本分离，但多数斑点清晰度较差。

对比例5：-5℃下采用乙醚处理样品。

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液(在-5℃下分层)为展开剂，在-5℃(冰箱冷藏室)下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图5所示：各对照品(①～⑤号)、⑥号对照药材及⑦号通络化痰胶囊样品中各主要成分的斑点清晰，特别是通络化痰胶囊样品中大黄酚、大黄素甲醚的对应斑点实现了有效分离。

对比例6：-10℃下采用乙醚处理样品。

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素0.1g，分别加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液(在-10℃下分层)为展开剂，在-10℃(冰箱冷藏室)下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图6所示：各对照品(①～③号)斑点散大，不清晰，④号的对照药材及⑤号通络化痰胶囊样品中大部分成分未显现斑点。

相对于原标准大黄薄层色谱鉴别方法，对比例5的方法的薄层色谱鉴别结果大有改善，对照品和供试品的色谱斑点可以完全显现出来，相比较清晰度也有一定地提高，特别是通络化痰胶囊样品中大黄酚、大黄素甲醚的对应斑点实现了有效分离。

实施例1：

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品0.1g，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上层溶液(在-5℃下分层)为展开剂，在-5℃(冰箱冷藏室)下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图7所示：①号对照品、②号对照药材及三批通络化痰胶囊样品(③～⑤)号中各主要成分的斑点清晰，通络化痰胶囊样品在与对照品、对照药材相应的位置上，显示相同颜色的主斑点。

实施例2：

取通络化痰胶囊成品2g，研细，加甲醇20ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液10ml，蒸干，残渣加水10ml使溶解，再加盐酸1ml，置水浴中加热回流30分钟，立即冷却，用乙醚分4次振摇提取，每次20ml、10min，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.2g，同供试品溶液的制备方法制成每1ml含0.1g的溶液，作为对照药材溶液；取大黄素对照品0.1g，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；吸取供试品溶液4μl、对照药材溶液4μl、对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以石油醚(30-60℃)-甲酸乙酯-甲酸(10∶6∶1)的上层溶液(在-5℃下分层)为展开剂，在-5℃(冰箱冷藏室)下展开10cm以上，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。

薄层色谱鉴别结果如图7所示：①号对照品、②号对照药材及三批通络化痰胶囊样品(③～⑤)号中各主要成分的斑点清晰，通络化痰胶囊样品在与对照品、对照药材相应的位置上，显示相同颜色的主斑点。

以上所述实施例仅为本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。