一种测定疏血通注射液中次黄嘌呤含量的方法与流程

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种定量分析方法，特别是涉及一种准确测定疏血通注射液中次黄嘌呤含量的方法。

背景技术：

疏血通注射液由水蛭和地龙组方而成，具有活血化瘀、通经活络的功效，用于瘀血阻络所致的缺血性中风病中经络急性期，症见半身不遂、口舌歪斜、语言謇涩。次黄嘌呤为生物体内嘌呤碱基代谢过程的主要中间产物之一，具有生物活性，能透过细胞膜进入细胞内，提高多种酶的活性，参与调节人体一些重要的生理机能，其中对心血管作用尤为明显，因此选择次黄嘌呤作为疏血通注射液的含量测定指标成分。

目前，疏血通注射液中次黄嘌呤的含量测定采用的是高效液相色谱-紫外法(hplc-uv)。经预实验发现，当疏血通注射液中的次黄嘌呤在色谱上如若未能与其他结构类似的核苷酸碱基完全分离时，由于干扰物的紫外最大吸收波长λmax与次黄嘌呤接近，因此含量测定结果将会与真实值有一定的偏差。而如果采用液质联用法(lc-ms/ms)测定，无需色谱完全分离即可利用质谱独特的质量分辨能力，采用多反应离子监测(mrm)模式对次黄嘌呤进行扫描，从而有效减小其他核苷酸碱基可能造成的干扰，快速、专属、灵敏地检测疏血通注射液中次黄嘌呤的含量。

但质谱作为一种质量型检测器，美中不足的是定量结果或多或少会受到基质效应的影响。为了消除样品基质的干扰，通常采用色谱法在线去除基质，或者采用液液萃取、固相萃取法等对样品进行除杂前处理。上述操作，要么对工作人员的色谱分离技能要求较高，要么操作步骤繁杂、工作量较大。因此，开发一种更加经济、有效，且适用于准确测定疏血通注射液中次黄嘌呤的检测方法尤为重要。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种测定疏血通注射液中次黄嘌呤含量的方法，以至少实现提高测定准确性和专属性的目的。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种测定疏血通注射液中次黄嘌呤含量的方法，包括：

步骤一，配制6-巯基嘌呤内标溶液和一系列次黄嘌呤标准品溶液；

步骤二，在待测疏血通注射液中加入6-巯基嘌呤内标溶液和次黄嘌呤标准品溶液配制成加标样品，采用液质联用法，进行多反应监测mrm扫描，以加标次黄嘌呤终浓度x为横坐标，目标分析物与内标的峰面积比值y为纵坐标，进行线性回归，获得回归方程；

步骤三，在待测疏血通注射液中加入6-巯基嘌呤内标溶液，采用液质联用法，进行多反应监测mrm扫描，获得目标分析物与内标的峰面积比值，根据上述回归方程获得疏血通注射液中次黄嘌呤含量；

步骤二和步骤三中，液相色谱条件为：分析柱为watersacquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7μm)，保护柱为watersacquityuplcbehc18(5mm×2.1mm,1.7μm)，流动相a相为甲醇，b相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样量为2μl；

质谱检测条件为：电喷雾负离子esi(-)检测模式；毛细管电压(capillary)：0.5kv；锥孔电压(cone)：30v；喷雾气压力(nebuliser)：7psi；脱溶剂气温度(desolvationtemp)：400℃；脱溶剂气流量(desolvationgasflow)：800l·h^-1；锥孔气流量(conegasflow)：150l·h^-1，碰撞气氩气流量(collisiongasflow)：0.25ml·min^-1；

多反应监测mrm扫描方法的参数如下：

次黄嘌呤：母离子质量数(q1)：134.9；子离子质量数(q3)：92.0；驻留时间(dewlltime)：0.129s；锥孔电压(conevoltage)：30v；碰撞能量(collisionenergy)：12v；

6-巯基嘌呤：母离子质量数(q1)：151.0；子离子质量数(q3)：92.1；驻留时间(dewlltime)：0.129s；锥孔电压(conevoltage)：56v；碰撞能量(collisionenergy)：16v。

进一步地，步骤一所述的配制6-巯基嘌呤内标溶液，包括步骤：称取6-巯基嘌呤，加甲醇溶解、稀释，制成250μg/ml的6-巯基嘌呤甲醇储备液；移取6-巯基嘌呤储备液，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)溶解、稀释，制成125μg/ml的6-巯基嘌呤内标溶液。

进一步地，步骤一所述的配制次黄嘌呤标准品溶液，包括步骤：称取次黄嘌呤，加甲醇后于60℃超声使其完全溶解，放冷，再加甲醇稀释制成100μg/ml次黄嘌呤甲醇储备液；移取次黄嘌呤储备液1.00ml，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释成50μg/ml的次黄嘌呤标准溶液。

进一步地，步骤二中，配制加标样品，包括步骤：移取疏血通注射液100μl共6份，各加入浓度为125μg/ml的6-巯基嘌呤内标溶液100μl，分别加入浓度为50μg/ml的次黄嘌呤标准品溶液0μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl；然后用稀释剂甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)补足体积至1.00ml，涡旋、混匀；各取100μl，再用适量稀释剂甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释10倍，涡旋、混匀；分别取200μl，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释5倍，制成含内标250ng/ml，含加有次黄嘌呤终浓度为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml的加标供试品溶液。

进一步地，梯度洗脱程序为：0～0.5min(15％a、85％b)；0.5～0.6min(95％a、5％b)，0.6～1.0min(95％a、5％b)；1.0～1.1min(5％a、95％b)；1.1～3.5min(5％a、95％b)。

标准加入法是将欲测组分的纯物质加入到待测样品中，测定加入欲测组分纯物质前后欲测组分的峰面积(或峰高)，从而计算欲测组分在样品中的含量的方法。本发明建立的检测方法，采用标准加入法，通过液质联用法，进行多反应监测mrm扫描，可快速、准确的检测疏血通注射液中次黄嘌呤的含量，有效减小基质效应的干扰，该方法专属性好、灵敏度高，精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稳定性均达到了药物分析的要求。

附图说明

图1为疏血通注射液中次黄嘌呤及内标的mrm色谱图。

图中，a为空白生理盐水，b为含内标的标准品溶液，c为含内标的疏血通供试品溶液。峰1为次黄嘌呤苷，峰2为6-巯基嘌呤。

具体实施方式

本发明一种典型的实施方式提供的测定疏血通注射液中次黄嘌呤含量的方法，包括：

步骤一，配制6-巯基嘌呤内标溶液和一系列次黄嘌呤标准品溶液；

步骤二，在待测疏血通注射液中加入6-巯基嘌呤内标溶液和次黄嘌呤标准品溶液配制成加标样品，采用液质联用法，进行多反应监测mrm扫描，以加标次黄嘌呤终浓度x为横坐标，目标分析物与内标的峰面积比值y为纵坐标，进行线性回归，获得回归方程；

步骤三，在待测疏血通注射液中加入6-巯基嘌呤内标溶液，采用液质联用法，进行多反应监测mrm扫描，获得目标分析物与内标的峰面积比值，根据上述回归方程获得疏血通注射液中次黄嘌呤含量；

步骤二和步骤三中，液相色谱条件、质谱检测条件及多反应监测mrm扫描方法的参数相同。

液相色谱条件为：分析柱为watersacquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7μm)，保护柱为watersacquityuplcbehc18(5mm×2.1mm,1.7μm)，流动相a相为甲醇，b相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样量为2μl；优选地，梯度洗脱程序为：0～0.5min(15％a、85％b)；0.5～0.6min(95％a、5％b)，0.6～1.0min(95％a、5％b)；1.0～1.1min(5％a、95％b)；1.1～3.5min(5％a、95％b)。

质谱检测条件为：电喷雾负离子esi(-)检测模式；毛细管电压(capillary)：0.5kv；锥孔电压(cone)：30v；喷雾气压力(nebuliser)：7psi；脱溶剂气温度(desolvationtemp)：400℃；脱溶剂气流量(desolvationgasflow)：800l·h^-1；锥孔气流量(conegasflow)：150l·h^-1，碰撞气氩气流量(collisiongasflow)：0.25ml·min^-1；

多反应监测mrm扫描方法的参数如下：

次黄嘌呤：母离子质量数(q1)：134.9；子离子质量数(q3)：92.0；驻留时间(dewlltime)：0.129s；锥孔电压(conevoltage)：30v；碰撞能量(collisionenergy)：12v；

6-巯基嘌呤：母离子质量数(q1)：151.0；子离子质量数(q3)：92.1；驻留时间(dewlltime)：0.129s；锥孔电压(conevoltage)：56v；碰撞能量(collisionenergy)：16v。

在一些相对具体的实施方式中，

步骤一所述的配制6-巯基嘌呤内标溶液，包括步骤：称取6-巯基嘌呤，加甲醇溶解、稀释，制成250μg/ml的6-巯基嘌呤甲醇储备液；移取6-巯基嘌呤储备液，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)溶解、稀释制成125μg/ml的6-巯基嘌呤内标溶液。

步骤一所述的配制次黄嘌呤标准品溶液，包括步骤：称取次黄嘌呤，加甲醇后于60℃超声使其完全溶解，放冷，再加甲醇稀释制成100μg/ml次黄嘌呤甲醇储备液；移取次黄嘌呤储备液1.00ml，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释成50μg/ml的次黄嘌呤标准溶液。

步骤二中，配制加标样品，包括步骤：移取疏血通注射液100μl共6份，各加入浓度为125μg/ml的6-巯基嘌呤内标溶液100μl，分别加入浓度为50μg/ml的次黄嘌呤标准品溶液0μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl；然后用稀释剂甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)补足体积至1.00ml，涡旋、混匀；各取100μl，再用适量稀释剂甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释10倍，涡旋、混匀；分别取200μl，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释5倍制成含内标250ng/ml、含加有次黄嘌呤终浓度为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml的加标疏血通供试品溶液。

下面通过一些实施例对本发明要求保护的技术方案作进一步说明。除非另作特殊说明，本发明中所用材料、试剂均可从本领域商业化产品中获得。

实施例1

样品的制备

储备液的制备：精密称取次黄嘌呤，加甲醇适量，于60℃超声30min，使其完全溶解，放冷，再加甲醇稀释制成100μg/ml次黄嘌呤甲醇储备液。另精密称取6-巯基嘌呤，加甲醇适量，涡旋2min，使其完全溶解，加甲醇稀释制成250μg/ml的6-巯基嘌呤甲醇储备液。

标准品溶液的制备：精密移取次黄嘌呤储备液1.00ml，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释成50μg/ml的次黄嘌呤标准溶液备用；另精密移取6-巯基嘌呤储备液，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释成125μg/ml的6-巯基嘌呤内标溶液备用。

加标样品的制备：精密移取疏血通注射液100μl共6份，各加入浓度为125μg/ml的6-巯基嘌呤内标溶液100μl，分别加入浓度为50μg/ml的次黄嘌呤标准品溶液0μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl；然后用稀释剂甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)补足体积至1.00ml，涡旋、混匀；各取100μl，再用适量稀释剂甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释10倍，涡旋、混匀；分别取200μl，用甲醇-0.2％甲酸水溶液(2:8)稀释5倍制成含内标250ng/ml、含加有次黄嘌呤终浓度为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml的疏血通供试品溶液。

采用液质联用法，进行多反应监测mrm扫描：

液相色谱条件为：分析柱为watersacquityuplcbehc18(100mm×2.1mm,1.7μm)，保护柱为watersacquityuplcbehc18(5mm×2.1mm,1.7μm)，流动相a相为甲醇，b相为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为0.3ml/min，柱温为40℃，进样量为2μl；

质谱检测条件为：电喷雾负离子esi(-)检测模式；毛细管电压(capillary)：0.5kv；锥孔电压(cone)：30v；喷雾气压力(nebuliser)：7psi；脱溶剂气温度(desolvationtemp)：400℃；脱溶剂气流量(desolvationgasflow)：800l·h^-1；锥孔气流量(conegasflow)：150l·h^-1，碰撞气氩气流量(collisiongasflow)：0.25ml·min^-1；

多反应监测mrm扫描方法的参数如下：

次黄嘌呤：母离子质量数(q1)：134.9；子离子质量数(q3)：92.0；驻留时间(dewlltime)：0.129s；锥孔电压(conevoltage)：30v；碰撞能量(collisionenergy)：12v；

6-巯基嘌呤：母离子质量数(q1)：151.0；子离子质量数(q3)：92.1；驻留时间(dewlltime)：0.129s；锥孔电压(conevoltage)：56v；碰撞能量(collisionenergy)：16v。

加标曲线的建立

取批号为17040811的疏血通注射液，分成6份，分别加入内标和不同体积的次黄嘌呤标准品，制得含加有次黄嘌呤终浓度为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml的加标疏血通注射液(含内标250ng/ml)，进样2μl测定。以加标次黄嘌呤终浓度(x)为横坐标，目标分析物与内标的峰面积比值(y)为纵坐标，权重1/x²，进行线性回归，得回归方程y＝5.664×10^-3x+1.447，r＝0.9998。同时测得最低检测浓度为0.3ng/ml，最低定量浓度为1ng/ml。

另取多个批号的待测疏血通注射液，加入6-巯基嘌呤内标溶液，根据上述回归方程求得疏血通注射液中次黄嘌呤含量。

标准加入法测定次黄嘌呤含量

取20个批次的疏血通注射液，进样测定，结果如下。

专属性

在本实施例条件下，取生理盐水、标准品溶液、供试品溶液分别进样测定，次黄嘌呤、6-巯基嘌呤色谱峰形良好，测定无干扰。

精密度考察

取批号为17040811的疏血通注射液，加入次黄嘌呤标准品和内标，制得终浓度为低(100ng/ml)、中(300ng/ml)、高(500ng/ml)的加标疏血通注射液(含内标250ng/ml)，分别于同日内测定6次，并取上述低、中、高三种浓度的加标疏血通注射液，分别于1d、2d、3d进样分析，记录分析物与内标峰面积，计算其峰面积比值(a分析物/a内标)及rsd。结果表明，低、中、高三种浓度的日内和日间精密度rsd值均小于1％。

表1日内精密度试验结果

表2日间内精密度试验结果

稳定性试验

取批号为17040811的疏血通注射液，加入次黄嘌呤标准品和内标，制得含加有次黄嘌呤终浓度为0、低(100ng/ml)、中(300ng/ml)、高(500ng/ml)的加标疏血通注射液(含内标250ng/ml)，分别于室温放置0、2、4、8、12、24、48h后进样分析，记录分析物与内标峰面积，计算其峰面积比值(a分析物/a内标)及rsd。结果表明其rsd值均小于1％，说明溶液在室温放置48h内稳定。

表3疏血通注射液溶液的稳定性

加样回收率

取批号为17040811的疏血通注射液，加入次黄嘌呤标准品和内标，制得含加有次黄嘌呤终浓度为低(100ng/ml)、中(300ng/ml)、高(500ng/ml)的加标疏血通注射液(含内标250ng/ml)各6份，进样测定，以测得值/加标值×100％计算回收率，结果表明，其平均回收率为99.2％。

表4加样回收率试验结果

重现性考察

取批号为17040811的疏血通注射液，加入次黄嘌呤标准品和内标，分别制备6份供试品溶液，进样测定。结果表明，重复性rsd小于3％。

表5重复性试验结果

综上所述，本发明所建立的检测方法可快速、准确的检测疏血通注射液中次黄嘌呤的含量，该方法专属性好、灵敏度高，精密度、准确度、提取回收率、基质效应和稳定性均达到了药物分析的要求。以上实施例是用于解释本发明实施方案，并不超出本发明主题的范围，本发明保护范围不受所述实施例的限定。