一种检测单硝酸异山梨酯及其组合物中异山梨醇的方法与流程

本发明涉及化学分析
技术领域：
，更具体涉及单硝酸异山梨酯及其组合物中异山梨醇的分析方法。
背景技术：
：单硝酸异山梨酯(isosorbidemononitrate，5-ismn)为硝酸异山梨酯的主要生物活性代谢物，主要药理作用是松弛血管平滑肌。单硝酸异山梨酯释放氧化氮，氧化氮与内皮舒张因子相同，激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌细胞内的环鸟苷酸增多，从而松弛血管平滑肌，使外周动脉和静脉扩张，对静脉的扩张作用更强。静脉扩张使血液潴留在外周，回心血量减少，左室舒张末压和肺毛细血管楔嵌压(前负荷)减低。动脉扩张使外周血管阻力、收缩期动脉压和平均动脉压(后负荷)减低。冠状动脉扩张，使冠脉灌注量增加。总的效应是使心肌耗氧量减少，供氧量增多，心绞痛得以缓解。同时还可以通过促进心肌血流重新分布，改善缺血区血液供应。单硝酸异山梨酯临床适应症为：冠心病的长期治疗；心绞痛(包括心肌梗塞后)的长期治疗和预防；与洋地黄及/或利尿剂合用治疗慢性充血性心力衰竭。单硝酸异山梨酯生产和储藏过程会产生杂质异山梨醇。单硝酸异山梨酯和异山梨醇结构如表1。表1单硝酸异山梨酯和异山梨醇结构本领域对单硝酸异山梨酯及其组合物的质量控制包括含量、有关物质(杂质)等，见于国内外药典及药品标准。单硝酸异山梨酯有一定的紫外末端吸收，有许多文献采用紫外检测器对其检测。对于其中主要降解杂质异山梨醇的分析方法鲜见报道与收载，因为异山梨醇无紫外吸收，在反向高效液相色谱系统中保留弱。其中美国药典第35版(usp35-nf30)和ws1-(x-116)-2006z对单硝酸异山梨酯组合物(缓释片和缓释胶囊制剂)中的异山梨醇采用了薄层色谱(tlc)方法控制，限度为1.0％。表2药品标准异山梨醇限度对比tlc方法的缺点是，1)无法检出。ws1-(x-116)-2006z标准方法，异山梨醇对照溶液不论多大浓度均不显斑点(黄雷,李壮,闵奇,张春宏.单硝酸异山梨酯缓释胶囊(ⅳ)中异山梨醇的薄层色谱杂质检查[j].中国医药指南,2011,(33):284-285.)，即无法检查异山梨醇。2)灵敏度低。即使改进后，异山梨醇对照品点样量(浓度)增至原来4倍以上，使供试品浓度(以单硝酸异山梨酯计)从标准的5mg/ml，需提高的20mg/ml(该文献中也未指出如何配制浓度为20mg/ml的供试品溶液)，检测限也仅仅达到1％。3)无法定量。由于检测限1％，一般定量限度约为检测的3倍或以上，则供试品中需要达到3％的异山梨醇才可能定量。另一方面tlc尚无准确度较好的定量方法。有必要开发一种灵敏准确的定量分析方法用于分析单硝酸异山梨酯及其组合物中降解杂质异山梨醇，但尚无文献报道其分析的方法。技术实现要素：本发明公开了一种检测单硝酸异山梨酯及其组合物中异山梨醇的方法。该方法，包括：先将单硝酸异山梨酯或组合物在溶剂溶解，然后采用液相色谱法分离，然后采用示差折光检测器(differentialrefractiveindexdetector，rid)检测。示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折射率的变化而对样品浓度进行检测的。检测器的灵敏度与溶剂和溶质的性质都有关系，溶有样品的流动相和流动相本身之间折射率之差反映了样品在流动相中的浓度。示差折光检测器的响应信号与溶质的浓度成正比，说明它属于浓度型检测器。我惊奇的发现，采用示差折光检测器可检测出异山梨醇。该方法不仅适用于单硝酸异山梨酯，也适用于含单硝酸异山梨酯的组合物。单硝酸异山梨酯组合物常见为单硝酸异山梨酯的制剂产品或制剂中间体，《中国药典》2015年版收载了单硝酸异山梨酯片、单硝酸异山梨酯缓释片、单硝酸异山梨酯胶囊、单硝酸异山梨酯注射液、单硝酸异山梨酯氯化钠注射液、单硝酸异山梨酯葡萄糖注射液。上市的药品还有各种单硝酸异山梨酯缓释胶囊。适用于单硝酸异山梨酯注射液、单硝酸异山梨酯氯化钠注射液、单硝酸异山梨酯葡萄糖注射液等仅含水溶性辅料的单硝酸异山梨酯组合物的分析方法与单硝酸异山梨酯(原料)基本一致。可以采用流动相作为溶剂溶解、稀释，注射液也可以直接进样。必要时也可以增加浓缩或过滤步骤。单硝酸异山梨酯缓释制剂的处方和制备方法可参见相关文献。如cn101143140a公开了一种单硝酸异山梨酯的定时速释缓释制剂，其各结构层由内至外依次排列为：丸芯母核、第二剂量药物层、隔离层、缓释包衣层、第一剂量药物层、膨胀层、控释层；cn103610650a公开了一种单硝酸异山梨酯缓释微丸，由空白丸芯、载药层、缓释层和速释层组成；cn106138012a公开了一种由速释丸和缓释丸组合的单硝酸异山梨酯缓释胶囊；cn1679536a公开了一种单硝酸异山梨酯缓释片，包括：单硝酸异山梨酯、缓释剂、粘合剂、填充剂、润滑剂。单硝酸异山梨酯的固体组合物，一般纤维素衍生物、淀粉、聚乙二醇或其衍生物等固体辅料，最常见的纤维素衍生物包括微晶纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、羟丙甲纤维素，羧甲基纤维素及其盐。这些固体辅料有些水溶的，有些是水溶胀的，有些是水不溶的。要将单硝酸异山梨酯组合物中的单硝酸异山梨酯及其杂质异山梨醇溶解出来，仅靠水，或含水的有机溶剂作为溶剂并不适用所有组合物。当组合物中不含水不溶性辅料时，溶解步骤可不用分步实施。溶剂可采用水或水与甲醇、乙醇、乙酸、乙腈、乙酸乙酯、丙酮的混合物。单硝酸异山梨酯及其组合物的溶剂应对单硝酸异山梨酯、异山梨醇有良好溶解性，对组合物的其他组分也应具有一定溶解性，水或水与甲醇、乙醇、乙酸、丙酮、乙酸乙酯、乙腈的混合物是优选。实际上，由于异山梨醇在单硝酸异山梨酯中的比例占比较低，比如1％，因此优选的溶剂对单硝酸异山梨酯溶解性较好即可。对单硝酸异山梨酯的溶解度应不小于0.1mg/ml，优选不小于0.5mg/ml。溶解1g单硝酸异山梨酯所需溶剂的量见下表。表3单硝酸异山梨酯缓释溶解性当组合物含有水不溶性辅料，尤其是由水不溶性辅料将单硝酸异山梨酯形成包覆状态时，如单硝酸异山梨酯缓释胶囊中微丸被乙基纤维素覆盖，为了加快溶解配制速度，优选分步使用溶剂，第一步使用溶剂是对单硝酸异山梨酯组合物中的水不溶性组分具有溶解、溶胀或致孔作用。最后步骤供试品溶液的溶剂为水或水与甲醇、乙醇、乙酸、乙腈、乙酸乙酯、丙酮的混合物。通过溶解，或稀释，最终配制成单硝酸异山梨酯供分析时的浓度为0.1～100mg/ml，浓度越高，对溶剂的要求越高，但是可以提高灵敏度，检出浓度更低的异山梨醇。相同色谱条件下，假定异山梨醇的检测限为1μg/ml，当样品浓度为0.1、1、10、100mg/ml时，对应异山梨醇的检出限度百分率为1％、0.1％、0.01％、0.001％。优选的供试品浓度相当于单硝酸异山梨酯的浓度为0.5～10mg/ml。实际上，本发明的一个方案中标明，异山梨醇的检测检测限为0.4μg/ml，比上述假定值更低，当样品浓度为0.1、1、10、100mg/ml时，对应异山梨醇的检出限度百分率为0.4％、0.04％、0.004％、0.0004％。因此本发明的技术方案对异山梨醇的检测灵敏度很高。本发明的液相色谱法优选反向高效液相色谱法。本发明反向高效液相色谱法，优选分析条件是：色谱柱填料是c8-c18的烷基硅烷键合硅胶，流动相为水-甲醇的混合液，两者体积比为80～98:20～2；流速为0.5～2ml/min；柱温为20～50℃，检测池温度20～50℃。在本发明指导下，也可以对上述方法进行拓展。本发明的一个实施例总中，色谱柱填料为c18的烷基硅烷键合硅胶；流动相为水-甲醇的混合液，两者体积比为95:5；流速为1ml/min；柱温为35℃，检测池温度40℃。本发明的方法相比tlc法，极大提高了灵敏度，而且可以准确定量。附图说明图1是实施例1专属性图。右侧a-g代表各种供试品，1～3代表检出物质。1：异山梨醇；2：2-单硝酸异山梨酯；3：单硝酸异山梨酯。a：异山梨醇对照品溶液(1mg/ml)；b：2-单硝酸异山梨酯溶液(1mg/ml)；c：单硝酸异山梨酯缓释胶囊供试溶液(2mg/ml)；d：硝酸异山梨酯溶液(1mg/ml)；e：空白辅料溶液；f：空白溶剂(流动相)；g：加入杂质异山梨醇、2-单硝酸异山梨酯和硝酸异山梨酯(均达到20μg/ml)单硝酸异山梨酯缓释胶囊供试溶液(2mg/ml)图2是实施例2对比图。a为异山梨醇峰，①～⑥为不同流动相条件下分析流动相和异山梨醇对照品的色谱图；①流动相1-空白流动相；②流动相1-异山梨醇对照品；③流动相2-空白流动相；④流动相2-异山梨醇对照品；⑤流动相3-空白流动相；⑥流动相3-异山梨醇对照品具体实施方式实施例1如无特别说明，按如下色谱条件试验。1.1色谱条件及系统适用性仪器：agilent1260(rid)高效液相色谱仪色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(welchultimateaq-c185μm4.6mm×250mm)流动相：5％甲醇检测器：示差折光检测器流速：1.0ml/min进样量：100μl稀释溶剂：流动相柱温：35℃检测池温度：40℃1.2检测限与定量限精密称取异山梨醇对照品100mg，置100ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为贮备液(1000μg/ml)。以贮备液加流动相逐步稀释，按信噪比(s/n)≥3作为检测限，按信噪比≥10作为定量限。结果见下表。检测限为0.02％，相比tlc检测限1％，灵敏度提高了50倍。表4检测限与定量限结果1.3专属性⑴以流动相作为空白溶剂；称取空白辅料(微晶纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇20000、蔗糖、淀粉、羟丙甲纤维素、滑石粉)，照供试液配制方法配制，得空白辅料溶液；⑵取异山梨醇对照品、2-单硝酸异山梨酯对照品和硝酸异山梨酯对照品适量，分别配制成浓度为1mg/ml的溶液，作为各杂质定位溶液；⑶取单硝酸异山梨酯缓释胶囊(异乐定，优时比(珠海)制药有限公司)内容物适量(约相当于单硝酸异山梨酯100mg)，置50ml量瓶中，加甲醇2.5ml超声20min，加水适量超声20min，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，离心，滤过，作为供试品溶液(2mg/ml)；⑷取单硝酸异山梨酯缓释胶囊(异乐定，优时比(珠海)制药有限公司)内容物适量(约相当于单硝酸异山梨酯100mg)，置50ml量瓶中，加甲醇2.5ml超声20min，同时量取各杂质定位溶液适量和加水适量超声20min，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，离心，滤过，配制成每1ml中约含各杂质20μg和单硝酸异山梨酯2mg的混合溶液，作为主药加杂质混合液；⑸异山梨醇对照品溶液(std)：精密称取异山梨醇对照品适量，用流动相溶解并制成含异山梨醇约20μg/ml溶液。分别将空白溶剂、空白辅料溶液、各杂质定位溶液、供试品溶液、主药加杂质混合液，精密量取100μl，注入液相色谱仪，考察空白溶剂、空白辅料及已知杂质是否干扰异山梨醇测定。结果详见附图1，异山梨醇、2-单硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯分别在约4.4、18.2、24.2min出峰，硝酸异山梨酯无明显峰，空白溶剂、空白辅料在异山梨醇峰附近无明显峰，表明专属性良好。硝酸异山梨酯无明显峰也表明并非任何物质在示差折光监测器中均可检出。1.4线性和范围以贮备液稀释制成200μg/ml的线性母液，以线性母液稀释制成4、10、16、20、24、30、40μg/ml溶液，依法检测，记录色谱图，由溶液浓度c对峰面积a进行线性回归，得回归方程a＝878.4333c-67.3105(r＝0.9998)表明异山梨醇在4～40μg/ml浓度范围内线性关系良好。1.5重复性精密称取单硝酸异山梨酯缓释胶囊内容物和异山梨醇对照品适量，照专属性项下方法配制对异山梨醇照品溶液及6份供试品溶液(n＝1)；分别取异山梨醇对照品溶液及供试品溶液各100μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法计算异山梨醇含量，考察重复性。结果见下表表5异山梨醇测定重复性试验结果编号123456avgrsd(％)异山梨醇(％)n.dn.dn.dn.dn.dn.d----注：n.d.为未检出。试验结论：本批样品6份异山梨醇测定，均未检出异山梨醇，表明此方法重复性好。1.6准确度精密称取单硝酸异山梨酯缓释胶囊内容物适量(约相当于单硝酸异山梨酯100mg，以重复性实验结果计算异山梨醇本底量)9份，分别置于50ml量瓶中，加甲醇2.5ml超声20min，放冷，分别加入浓度为1000μg/ml异山梨醇溶液0.5ml、1.0ml和1.5ml，加水适量超声20min，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，离心，滤过，取续滤液，作为杂质回收率50％、100％、150％样品(n＝3)，另配制异山梨醇对照品溶液。分别注入液相色谱仪，采用外标法计算回收率及rsd。计算公式：测得量＝异山梨醇浓度×样品稀释倍数理论加入量＝对照品浓度×加入量试验结果：见下表表6异山梨醇测定回收率试验结果试验结论：异山梨醇的平均回收率为97.46％，rsd为2.20％；回收率均在92％～105％之间，rsd＜10％，表明本方法准确度良好。相比较而然，tlc尚无准确定量。1.7耐用性试验方法：精密称取单硝酸异山梨酯缓释胶囊内容物适量(约相当于单硝酸异山梨酯100mg，以重复性实验结果计算异山梨醇本底量)，分别置于50ml量瓶中，加甲醇2.5ml超声20min，放冷，分别加入浓度为1000μg/ml异山梨醇溶液1.0ml，加水适量超声20min，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，离心，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，另配制异山梨醇对照品溶液。分别在不同流动相比例、不同流速、不同色谱柱、不同柱温和不同池温的条件，注入上述溶液，计算异山梨醇含量。考察色谱条件的微小改变对测定结果的影响。试验结果：见下表表7耐用性色谱条件变动表8异山梨醇测定耐用性试验—色谱参数考察表9异山梨醇测定耐用性试验—测定结果对比注：n.d.为未检出。试验结论：在色谱条件微小改变的条件下，异山梨醇峰拖尾因子＜2.0、分离度＞1.5；且异山梨醇含量的rsd为2.69％＜5.0％，表明方法的耐用性较好。实施例21.1色谱条件及系统适用性仪器：agilent1260(rid)高效液相色谱仪色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(welchultimateaq-c185μm4.6mm×250mm)流动相：流动相1水-甲醇(75:25)；流动相2水-甲醇(90:10)；流动相3水-甲醇(95:5)检测器：示差折光检测器流速：1.0ml/min进样量：100μl稀释溶剂：流动相柱温：35℃检测池温度：40℃在三种流动相条件下，待系统平衡后进样流动相和异山梨醇对照品溶液结果见附图2流动相1时，异山梨醇出峰在溶剂峰处，无法分离流动相2时，异山梨醇与溶剂峰可以达到基线分离，分离度约为2.0；流动相3时，异山梨醇与溶剂峰分离度大于20，完美分离。当前第1页12