HPLC-ICP-MS联用技术检测海产贝类中无机铅离子的方法与流程

本发明属于水产品检测技术领域，具体地涉及一种用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪(hplc-icp-ms)联用技术测定水产品中无机铅离子的方法。

背景技术：

铅是重金属污染中毒性较大的一种，一旦进入人体将很难排除。它对神经系统、骨骼造血功能、消化系统、男性生殖系统等均有危害、且有慢性中毒作用。铅能直接伤害人的脑细胞，尤其是胎儿的神经系统，可造成先天智力低下，特别是大脑处于神经系统敏感期的儿童，对铅有特殊的敏感性。铅还有致癌、致突变作用。铅对水产品的污染主要是由于大量铅污染物排入水体引起。铅通过离子交换、吸附、络合、絮凝、沉淀等作用,最终绝大部分进入表层沉积物中，使水体中铅含量降低。而沉积物中铅的大量积累具有潜在性的污染与危害。当环境条件变化时，一部分铅由于扩散、解吸、溶解、氧化还原和络合作用,以及在物理、生物等因素的作用下，从沉积物中向水中释放，造成次生污染。因此铅随着水环境物理因素的变化，在水、底泥和生物三者之间发生迁移转化。水生生物摄食了铅污染物，使铅在水生生物体内蓄集，从而造成了对水产品的污染。贝类作为一类具有世界性分布的软体无脊椎水生动物，由于其具有分布广，移动性较差，滤食食性，对重金属及污染物具有较强的生物累积能力等特点，是最易受到铅等重金属污染的水产品种类之一。

现行铅的检测方法是根据国标gb5009.12-2017中规定的食品中铅的测定方法，将水产品中各种形态铅通过高温、强氧化剂(硝酸和高氯酸)消解成离子态铅，因此该方法检测到的是水产品中铅的总量。由于不同形态铅具有不同的生物毒性和生物有效性，因此对贝类中铅的形态分析技术研究对提高贝类质量安全具有重要意义。目前国际iso和cac标准中尚无测定水产中无机铅离子的方法标准。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种hplc-icp-ms联用技术检测海产贝类中无机铅离子的方法，使用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪联用(hplc-icp-ms)形态分析技术,对水产品中的铅元素进行定性和定量分析，准确测定海产贝类中的无机铅离子含量。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种hplc-icp-ms联用技术检测海产贝类中无机铅离子的方法，包括以下步骤：1)选用的仪器及设备，hplc-icp-ms联用系统，2)配置试剂与标准溶液，3)样品处理的步骤，4)实验所用的仪器条件，5)样品检测与结果计算；具体步骤如下：

1)选用的仪器及设备包括：

(1)液相色谱仪hplc：使用series200高压液相泵，配有自动进样器，配有保护柱cg5a4×50mm和相同材质填料的cs5a4×250mm阳离子交换色谱柱；

(2)电感耦合等离子体质谱仪icp-ms：配有动态反应池，进样系统，射频发生器，等离子体系统，chromera形态分析全自动处理接口、离子透镜系统、四极杆、真空系统、检测器、气路控制系统；

2)配置试剂与标准溶液包括：

(1)浸提液：1.0mmol/l乙酸

(2)流动相：50mm草酸+95mm氢氧化锂混合溶液ph＝4.8，使用前经过0.22μm滤膜过滤并超声脱气；

所有的试剂均是优级纯，整个实验用水均为超纯水；玻璃仪器使用前经15％硝酸浸泡24h；

(3)无机铅离子的标准使用液：

将1000μg/ml铅离子标准溶液稀释至1.00μg/ml的储备液，置4℃冰箱存放备用，由1.00μg/ml的铅离子储备液用水稀释成10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml、200.0ng/ml的标准使用液，现用现配；

3)样品处理的步骤:

将贝类样品均匀匀浆后经冷冻干燥、粉碎处理后，称取样品置于离心管中，加浸提液涡旋混匀后，超声浸提、离心，取出上清液用水系微孔滤膜过滤后为待测样液，移入进样瓶中，上机测定待测样液中铅离子的值；

4)实验所用的仪器条件：

(1)高效液相色谱条件：流动相为50mm草酸+95mm氢氧化锂混合溶液，所述混合溶液的ph至4.8，流速1.0ml/min；进样体积20μl，自动进样；

(2)电感耦合等离子质谱仪条件：射频功率1150w，等离子体气流速:15l/min，雾化气流速0.92l/min，透镜电压7.00v，辅助气流速1.2l/min，检测器模拟级电压-1800v，检测器脉冲级电压900v，质量通带带宽0.25，采样时间5min；

所述50mm草酸+95mm氢氧化锂混合溶液的ph值是用氢氧化锂水溶液调节。

5)样品检测与结果计算:

开机后按上述仪器条件进行设置，待稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的待测样液；在上述高效液相色谱和电感耦合等离子质谱仪条件下采用全自动进样器进样20μl进行测定，高效液相色谱仪进行分离，电感耦合等离子质谱仪对铅离子进行检测；在上述仪器条件下铅离子保留时间为2.4min；

定量：待测样液中铅离子的色谱峰保留时间与标准使用液相比变化范围在±10％之内即认为是该待测定物质；

结果计算与表述：

用数据处理软件中的外标法，确定铅离子保留时间及分离度脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度积分为纵坐标，绘制标准工作曲线，然后将待测样液峰分析处理，即可得到待测样液中的无机铅离子的浓度，按下面式(1)计算，可得样品中无机铅离子的含量：

x＝c×v/m×1000...............(1)

式中：

x—样品中无机铅离子的含量，mg/kg；

c—待测样液中无机铅离子的浓度，ng/ml；

m—称样量，g；

v—测定液体总体积，ml。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

1、本发明采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术分析海产贝类中的无机铅离子，提取液首先由高效液相色谱，采用阳离子交换色谱技术洗脱分离提取液中的无机铅离子，再由电感耦合等离子体质谱仪做为检测器进行分析。阳离子交换色谱柱能吸附提取液中的无机铅离子，通过流动相中草酸对铅离子的络合作用，将无机铅离子洗脱，通过电感耦合等离子体质谱仪对无机铅离子进行分析，得到无机铅离子的保留时间及其分离度的脉冲强度。根据标准系列溶液的强度和脉冲强度积分，由仪器计算机拟合得到线性回归方程。该实验条件选择合理，检测数据准确可靠。

2、本发明对贝类中的铅采用1.0mmol/l乙酸超声提取，能够提取样品中水溶态和可交换的铅形态，阳离子交换色谱柱能吸附提取液中的无机铅离子，采用的流动相中草酸对铅离子具有很强的络合作用，并形成可溶性的配合物，因此能够对提取液中的无机态铅离子发生吸附洗脱作用，实现了对样品中铅离子的很好分离。

3、本发明填补了目前国标中仅有总铅测定方法而未有铅元素形态检测方法的空白，可以准确科学的评价水产品及其制品的质量安全，同时对制定水产品中有害元素限量的新标准具有重要意义。

附图说明：

图120ng/mlpb(ⅱ)标准溶液色谱图；

图2扇贝中pb(ⅱ)分析色谱图；

图3四角蛤蜊中pb(ⅱ)分析色谱图。

具体实施方式：

下面通过实施例详细叙述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

本发明为利用高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪(hplc-icp-ms)联用技术分析海产贝类中无机铅离子的方法，步骤包括：1、选用的仪器及设备，2、配置试剂与标准溶液，3、样品提取的步骤，4、实验所用的仪器条件，5、样品检测与结果计算。

海产贝类包括扇贝、牡蛎、菲律宾蛤仔、四角蛤蜊、贻贝等，因其在其生长过程中具有移动性差，滤食食性等特性，对重金属的富集能力远高于鱼、虾、蟹等水产品。我们在对我国主要海产贝类中重金属进行风险监测过程中，发现不同贝类中铅含量差异较大，因此挑选铅含量较高的扇贝、四角蛤蜊等样品，作为验证的实施例。

实施例1：扇贝中无机铅离子即pb(ⅱ)的测定：

1、本实施例选用的仪器及设备：hplc-icp-ms联用系统：

(1)hplc(美国perkin-elmer公司，型号series200)部分：使用series200高压液相泵，配有自动进样器，配有保护柱cg5a4×50mm和相同材质填料的cs5a4×250mm阳离子交换色谱柱；

(2)icp-ms(美国perkin-elmer公司，型号elandrcii)部分：配有动态反应池，自动进样系统，射频发生器，等离子体系统，chromera形态分析全自动处理接口，离子透镜系统，四极杆，真空系统，检测器，气路控制系统；

(3)冷却循环水(美国polyscience公司，型号sha-c)；

(4)漩涡混合器(ikams3basic)；

(5)纯水系统(美国millipore,milli-qgradienta10)；

(6)循环式真空砂芯过滤器泵(真空泵，上海亚荣生化仪器厂、型号shz-ⅲ；砂芯过滤装置、型号sh/t0093)；

(7)高速冷冻离心机(thermo，型号d-37520)；

(8)数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司，型号kq-600de)；

(9)水系微孔滤膜(0.22μm)；

(10)氩气(纯度≥99.99％)。

2、配置试剂与标准溶液；

(1)浸提液：1.0mmol/l乙酸。

(2)流动相：50mm草酸+95mm氢氧化锂溶液(ph＝4.8)，使用前经过0.22μm滤膜过滤并超声脱气。

所有的试剂均是优级纯，整个实验都使用超纯水；玻璃仪器使用前经15％硝酸浸泡24h；

(3)无机铅离子pb(ⅱ)的标准使用液：

从国家标准物质中心购得1000μg/mlpb(ⅱ)的标准溶液，稀释至1.00μg/ml作为pb(ⅱ)的储备液(置4℃冰箱存放备用)；1.00μg/ml的pb(ⅱ)储备液用水稀释成10.0ng/ml、20.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml、200.0ng/ml的pb(ⅱ)标准使用液，现用现配。

3、样品处理的步骤:：

将均匀匀浆的扇贝样品-20℃冷冻后经真空冷冻干燥，粉碎，称取粉末约0.2000g置于50ml具塞刻度离心管中，加1.0mmol/l乙酸15ml混匀，超声浸提40min，8000r/min4℃离心10min，取出上清液用0.22微米的水系微孔滤膜过滤，移入进样瓶中，上机测定待测样液中无机铅离子的值。

4、实验所用的仪器条件：

(1)高效液相色谱条件(hplc)：流动相:50mm草酸+95mm氢氧化锂溶液(ph＝4.8)，流速1ml/min；进样体积20μl，自动进样。

(2)电感耦合等离子质谱仪条件(icp-ms)：射频功率1150w，等离子体气流速15l/min，雾化气流速0.92l/min，透镜电压7.00v，辅助气流速1.2l/min，检测器模拟级电压-1800v，检测器脉冲级电压900v，质量通带带宽0.25，采样时间5min。

5、样品检测与结果计算:

(1)定性：开机后按上述条件进行设置，待稳定后，取标准使用溶液1ml移入进样瓶中，自动进样注入高效液相色谱仪(hplc)，进行洗脱分离成分，然后应用电感耦合等离子体质谱仪(icp/ms)作为检测器对pb(ⅱ)进行分析，确定pb(ⅱ)的保留时间及其分离度的脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度的积分为纵坐标，由仪器的计算机作线性拟合，得到标准曲线方程。在上述高效液相色谱和电感耦合等离子质谱仪条件下采用全自动进样器进样20μl样品提取液进行测定，高效液相色谱仪进行分离，电感耦合等离子质谱仪对pb(ⅱ)进行检测；在上述仪器条件下pb(ⅱ)保留时间约为2.4min；详见图1；

(2)定量：待测样品中pb(ⅱ)的色谱峰保留时间与标准使用液相比变化范围在±10％之内即认为是该待测定物质；

结果计算与表述：

用数据处理软件(chromera)中的外标法，确定pb(ⅱ)保留时间及分离度脉冲强度，以浓度为横坐标，脉冲强度积分为纵坐标，绘制标准工作曲线，将标准工作曲线保存，然后将样品峰分析处理，即可得到待测样液中的pb(ⅱ)的浓度，按下面式(1)计算，可得试样中pb(ⅱ)的含量：

x＝c×v/m×1000...............(1)

式中：

x—样品中pb(ⅱ)的含量，mg/kg；

c—待测样液中pb(ⅱ)的浓度，ng/ml；

m—称样量，g；

v—测定液体总体积，ml；

6、结果：

本方法pb(ⅱ)检出限量为0.30mg/kg。通过对扇贝样品的加标回收率试验，回收率为>83％，相对标准偏差<5％，证明上述检测方法的可行。

对四角蛤蜊中的无机铅离子的测定方法与扇贝相同，扇贝和四角蛤蜊加标回收率的测定结果见表1。

表1、扇贝、四角蛤蜊加标回收率的测定结果

为确保实验数据的准确可靠我们采取的措施有：①将贝类组织首先均匀匀浆，-20℃冷冻后经真空冷冻干燥后再一次粉碎均匀可使样品均匀度提高，称样具有代表性且能浸提完全；②采用1.0mmol/l乙酸提取液提取，可以保证浸提出样品中水溶态和可交换态的铅；③、选用的保护柱cg5a4×50mm，分析柱cs5a4×250mm阳离子交换柱能吸附离子态pb(ⅱ)，再通过草酸的络合作用形成可溶性的配合物，经洗脱，使离子态铅很好的分离，见图2和图3。

因此高效液相色谱-电感耦合等离子质谱仪联用(hplc-icp-ms)技术是分析海产贝类中无机铅离子的首选方法。这种方法回收率高，稳定性好，灵敏度高，前处理简便，解决了水产品中的毒性较高的无机铅离子的分析问题，特别是对于具有高富集特性的扇贝、牡蛎、蛤蜊等海产贝类，该方法可以更为清晰、准确的反应其中无机铅离子的含量，为科学准确的进行质量安全性评价提供重要技术支持。