塞内卡病毒的阻断ELISA抗体检测试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测领域，更具体而言，本发明涉及一种用于检测塞内卡病毒抗体试剂盒、该试剂盒的制备方法及使用方法。
背景技术：
：塞内卡病毒(senecavalleyvirus，svv)也称为塞尼卡病毒a(senecavirusa，sva)，为小rna病毒科、塞内卡病毒属的唯一成员。sva与其他小rna病毒科成员一样，具有直径约25nm-30nm的无囊膜衣壳，呈二十面体对称。sva基因组长约7.2kb，为单链正股rna，拥有一个唯一的开放阅读框(orf)；orf两侧为5′非翻译区(约668个核苷酸)和3′非翻译区(约68个核苷酸)，3′非翻译区后具有多聚(a)尾巴。该病毒于2002年首次发现于per.c6细胞培养物中，被鉴定为细胞培养基中的污染物。最初sva被用作溶瘤病毒进行肿瘤治疗研究。现已证实sva感染猪能够引起原发性水疱病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水疱病变，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床表现，可致病猪机体免疫功能受损，减少产肉量。目前在我国境内，sva呈爆发流行，且流行区域广泛，给养猪业造成巨大经济损失。由sva感染引发的水疱病与口蹄疫(fmd)、猪水疱病(svd)和水疱性口炎(vs)引起的病变极为类似，具体表现为病畜鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡；同时病畜伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等症状。因此，仅从临床症状上是无法区分sva感染和其它水疱病的。目前已经用于sva诊断的实验室方法包括病毒分离、病毒中和、竞争elisa、常规rt-pcr和实时荧光rt-pcr(rrt-pcr)等方法。目前加拿大biovet公司制备的svv特异性单克隆抗体开发出svv竞争性elisa检测方法，是比较成熟的检测试剂盒，但是其价格昂贵，购买周期长，且操作过程及结果计算较为复杂，对操作人员的专业技术水平要求较高，不适于养猪场对猪群感染性检测。针对该病的不断扩散，急需提出和制定有效的诊断与防控措施。鉴于sva快速传播的能力，建立高效、准确的诊断方法是进行该病防控的前提。进一步研发可大范围推广使用的血清学诊断方法对于sva的防控依然非常紧迫和重要。将不同种检测方法结合使用确保诊断结果的准确率和可信性，能够为sva的防控提供有力保障和支持。技术实现要素：本发明提供一种用于检测塞内卡病毒阻断elisa抗体的检测试剂盒，仅与塞内卡病毒抗体发生反应，而不与其他猪病(口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎)抗体发生交叉反应，并且，本发明还提供该试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒包括：包被塞内卡病毒灭活抗原的酶标板、塞内卡病毒阳性对照血清、塞内卡病毒阴性对照血清和辣根过氧化物酶标记的塞内卡病毒兔多克隆抗体。其中，抗原为浓缩纯化灭活的塞内卡病毒。本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒还包括样品稀释液、酶标抗体稀释液、tmb显色液、终止液和20倍浓缩pbst洗涤液。本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的制备方法包括：制备塞内卡病毒灭活抗原，然后用病毒灭活抗原包被酶标板。其中，包被的条件为塞内卡病毒灭活抗原的浓度为2μg/ml，100μl/孔，37℃孵育2h或者4℃过夜。该制备方法中，优选将浓缩纯化的塞内卡病毒用二乙烯亚胺灭活。本发明还提供上述塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒在检测塞内卡病毒抗体中的应用。该应用包括以下步骤：将待检血清稀释，加入包被塞内卡病毒灭活抗原的酶标板；并且设置阴性对照、阳性对照孔和空白对照孔；在37℃孵育60min；甩干酶标板，洗涤5次，用吸水纸拍干；加入稀释的辣根过氧化物酶标记的塞内卡病毒兔多克隆抗体，在37℃孵育30min；甩干酶标板，洗涤5次，用吸水纸拍干；加入tmb底物溶液，在37℃显色15min；加入终止液；选择od450nm读值，计算阻断率。其中，阻断率＝(阴性对照od值-待检血清od值)/阴性对照od值×100％，如果待检血清的阻断率≥35％，判断为塞内卡病毒抗体阳性；如果待检血清的阻断率＜35％，则判断为塞内卡病毒抗体阴性。上述应用中，将待检血清用样品稀释液按照体积比1︰10稀释；阴性对照血清、阳性对照血清无需稀释；将辣根过氧化物酶标记的塞内卡病毒兔多克隆抗体用酶标抗体稀释液按照体积比1︰1000稀释。由于塞内卡病毒只有一个血清型，塞内卡病毒抗原位点有特异性，只与塞内卡病毒阳性血清发生反应，而与其它能引起相似症状的其他猪病(口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎)无交叉反应，因此，使用本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒进行检测，其结果具有极高的特异性。并且，本发明采用纯化抗原，具有良好的反应敏感性。本发明采用高纯度的多抗，与单克隆抗体相比较而言，制备过程简便快速，而且并不影响检测的特异性结果，在一定程度上也降低了生产成本。另外，试剂盒重复性良好，保存期长。本发明涉及的试剂盒应用阻断elisa技术，与传统的间接elisa检测方法(例如，文献comparisonofindirectelisaandcompetitiveelisafordetectingpestedespetitsruminantsvirusantibody,jwang,etal.,chinesejournalofanimal&veterinarysciences,2014,45(2):333-336)相比较，减少了间接elisa方法的交叉反应和非特异性反应。本发明采用的阻断elisa技术，属于开放性操作，对于技术要求比较宽松，操作步骤简单、方便、快速，相关专业人员均可按照说明书中记载的步骤来检测血清样品，因此本发明的试剂盒能够广泛推广应用。附图说明图1是表示特异性实验结果的图。具体实施方式以下，更具体地对本发明进行说明，但是，这些示例不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员能够在不超出本发明的精神的范围内对本发明的实施方式进行修改或替换。实施例1塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的制备1、塞内卡病毒抗原的制备选取长满单层的pk-15细胞(购自中国兽医药品监察所)，按照2％浓度接种塞内卡病毒(由金宇保灵生物药品有限公司兽用疫苗国家工程实验室种毒室分离鉴定培养)，待cpe(细胞病变)达到85％-90％时，收获毒液，-20℃反复冻融2次，加入6％peg，搅拌4小时，静置过夜，第二天以8000rpm/min，离心20分钟，弃掉上清，将沉淀重悬；将纯化柱用平衡液(0.02m磷酸氢二钠，0.15m氯化钠，ph7.4)平衡5-10个柱体积，选择样品泵进行上样，再使用平衡液进行洗脱，收集纯化后毒液；用二乙烯亚胺(bei)对抗原进行灭活，具体灭活方法为按照终浓度为0.03％的比例加入3％bei，置于28℃摇床，110rpm/min，灭活30小时，加入50％硫代硫酸钠终止灭活反应；使用thermo品牌蛋白定量分析试剂盒按照相应说明书对纯化灭活抗原进行蛋白含量测定。2、血清的制备(1)塞内卡病毒阳性猪血清(标准阳性血清)的制备：以tcid50＝10-7/0.1ml浓度，每头份接种免疫5ml，分别以2.5ml肌肉注射和2.5ml滴鼻免疫，第一次免疫28天后，进行第二次免疫，方法同第一次免疫，第二次免疫后7天采血，分离血清，经病毒中和实验和pcr双重鉴定为塞内卡病毒阳性血清。(2)塞内卡病毒阴性猪血清(标准阴性血清)的制备：血清由经病毒中和实验和pcr双重鉴定筛选出的无塞内卡病毒感染的阴性猪采血制备所得。3、辣根过氧化物酶标记兔多克隆抗体的制备以灭活的塞内卡病毒为抗原，对长耳白兔进行免疫。免疫程序为：首次免疫时，免疫抗原含量为25μg/只，将免疫抗原按照1︰1的比例与弗氏完全佐剂乳化后对长耳白兔进行皮下注射免疫。14天后，将相同剂量的抗原按照1︰1的比例与弗氏不完全佐剂乳化后，对长耳白兔进行皮下注射免疫，进行第二次免疫。再经过14天后，从兔子心脏采血收集血清。收集的血清以亲和层析的方法进行纯化，使用平衡液进行纯化柱的平衡，待穿过3-5个柱体积后，进行上样，待血清全部流入纯化柱中，再加入平衡液待穿过3-5个柱体积后，换洗脱液进行样品的洗脱与收集。使用高活力酶(sigma)对收集的多抗进行标记，标记程序为称取4mg纯化抗体溶解于0.05mph9.5的碳酸盐缓冲液中透析三次，每次不少于3小时；称取3mghrp(辣根过氧化物酶)溶解于0.5ml蒸馏水中，随后加入0.18ml新配的0.1mnaio4溶液，加入0.16m乙二醇水溶液(10mlh2o+0.09ml乙二醇)0.3ml，轻轻混匀。将hrp加入到抗体中，继续对0.05mph9.5的碳酸盐缓冲液中透析两次，每次使用不少于100倍体积的透析液，时间不少于3小时，取出上述产物，加0.12ml新配的5mg/mlnabh4溶液，混匀。将上述溶液装入透析袋中，使用不少于100倍体积的0.01mph7.2pbs透析，4℃过夜。取出后加入等体积优质甘油，分装，-20℃保存。4、用塞内卡病毒灭活抗原包被酶标板抗原包被浓度：经方阵滴定试验，确定抗原的最佳包被浓度为2μg/ml，100μl/孔。包被液为无菌pbs(ph7.4)。抗原的包被程序为：将上述制得的浓缩纯化灭活后的塞内卡病毒抗原用ph7.4的pbs缓冲液稀释至2μg/ml，以100μl/孔加入酶标板(costar)中，置于37℃2h或者4℃过夜进行包被。次日甩掉抗原液，用pbst洗涤液清洗后，使用1％牛血清白蛋白以200μl/孔进行封闭，在4℃过夜后，甩干，在超净台内吹1h。最后放入包装袋内，抽成真空，-20℃保存备用。5、组装试剂盒本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒包括：包被塞内卡病毒灭活抗原的酶标板、标准阳性血清、标准阴性血清、辣根过氧化物酶标记兔多克隆抗体。还可以包括样品稀释液、酶标抗体稀释液、tmb显色液a液和b液、终止液、20倍浓缩pbst洗涤液。其中，样品稀释液按1lpbs︰10g牛血清白蛋白的比例制备；酶标抗体稀释液按1lpbs︰10g牛血清白蛋白︰0.25mltween20制备；tmb显色液a液按1l去离子水︰9.888g醋酸钠︰3.15g柠檬酸︰0.54ml30％双氧水的比例制备；tmb显色液b液按0.9l去离子水︰2.1g柠檬酸︰0.372gedta-na2︰0.1l丙三醇︰0.47gtmb-hci制备；终止液按1l去离子水︰27.8ml硫酸制备；20倍浓缩pbst洗涤液按1l去离子水︰5.92gnah2po4·2h2o︰58gna2hpo4·12h2o︰170gnacl︰5mltween20制备。试剂盒在4℃保存，保存期为6个月。实施例2塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的使用方法1.将实施例1中得到的试剂盒从4℃冰箱中取出，经过大约15min左右，恢复至室温。用纯化水将20倍洗涤液稀释至1倍使用浓度。2.取出酶标板。拆封的酶标板在4℃保存，最好在7天内用完。3.使用样品稀释液稀释血清，将待检血清10倍稀释，标准阳性血清和标准阴性血清无需稀释。4.加样：在酶标板第一排的1～2孔加入标准阳性血清，第3～4孔加入标准阴性血清，第5～6孔为空白对照。其余各孔加入待检血清，每份血清加1孔，不做重复，轻轻揺动混匀。5.温育：用封板膜封住酶标板，放入37℃温箱中孵育60min。6.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去。如此重复5次，拍干。7.加酶：用酶标抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记兔多克隆抗体作1000倍稀释，以100μl/孔加入酶标板孔内。8.温育：用封板膜封住酶标板，放入37℃温箱中孵育30min。9.洗涤：操作同6。10.显色：加入tmb显色液，100μl/孔，37℃避光显色15min。11.终止：加入终止液，50μl/孔。12.读数：立即用酶标仪在450nm长度下测量各孔的吸光度(od450值)。13.结果判定：阻断率＝(阴性对照od值-待检血清od值)/阴性对照od值×100％。如果待检血清的阻断率≥35％，判断为塞内卡病毒抗体阳性；如果待检血清的阻断率＜35％，则判断为塞内卡病毒抗体阴性。实施例3塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的重复性实验选取57份塞内卡病毒阳性血清和46份阴性血清，使用同批次的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，按照实施例2的使用方法，在不同时间的相同条件下，重复检测三次，结果如表1所示。判定结果一致，说明试剂盒重复性好。[表1]阳性血清检出率阴性血清检出率第一次检测56/5745/46第二次检测56/5745/46第三次检测56/5745/46实施例4塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的稳定性实验选取57份塞内卡病毒阳性血清和46份阴性血清，使用三个批次制备的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，按照实施例2的使用方法，在不同时间的相同条件下进行检测，结果如下表2所示。判定结果一致，说明试剂盒稳定性好。[表2]试剂盒批次阳性检出率阴性检出率no.156/5745/46no.256/5745/46no.356/5745/46实施例5塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的敏感性将经病毒中和实验检测抗体效价为1︰128和1︰256的2份塞内卡病毒阳性血清，分别标记为1、2号血清，将其分别作1︰5、1︰10、1︰20、1︰40、1︰80、1︰160共6个稀释度，用本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒检测每个稀释梯度的样品，检验试剂盒能检测出的最低抗体效价。结果如下表3所示，效价为1︰128的1号阳性血清稀释至1︰40时检测为阳性；效价为1︰256的2号阳性血清稀释至1︰80时仍可检测出阳性，说明本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的敏感性较高。[表3]血清稀释度1︰51︰101︰201︰401︰801︰1601号血清检测阳性阳性阳性阳性阴性阴性2号血清检测阳性阳性阳性阳性阳性阴性实施例6塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的特异性用本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，按照实施例2的使用方法，对塞内卡病毒阳性血清、塞内卡病毒阴性血清、口蹄疫阳性血清、猪水疱病阳性血清和水疱性口炎阳性血清(均由金宇保灵生物药品有限公司工程实验室提供)各5份进行检测。检测结果如图1所示。对于塞内卡病毒阳性血清的阻断率远高于35％，即，判断为塞内卡病毒阳性；对于塞内卡病毒阴性血清、口蹄疫阳性血清、猪水疱病阳性血清和水疱性口炎阳性血清的阻断率均低于35％，即，判断为塞内卡病毒阴性。由此，说明在塞内卡病毒阳性血清和其它能引起猪群出现类似症状的猪病阳性血清之间不存在交叉反应，试剂盒有良好的特异性。实施例7塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的保存期测定使用同批制备的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒，按照实施例2的使用方法，每间隔2周对相同的57份阳性血清和46份阴性血清进行检测。结果，保存6个月的试剂盒对同一份血清的检测结果相同，说明试剂盒的保存期至少为6个月。实施例8塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒的符合率试验1.材料使用经病毒中和试验鉴定的57份阳性血清(编号为p001～p057)和46份阴性血清(编号为n001～n046，由金宇保灵生物药品有限公司采集鉴定)以及本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒。2.操作程序2.1样品灭活将恒温水浴箱(hh2常州智博瑞仪器制造有限公司)预热至56℃后，将待检血清置恒温水浴箱，在56℃灭活30分钟。2.2样品稀释用移液器吸取细胞维持液加入到96孔微量细胞板(costar)中，每孔50μl，弃枪头，再用移液器吸取已灭活待检血清50μl加入到96孔微量细胞板的相应孔中，混合均匀后取50μl加入到下一稀释度的相应孔中，依次类推，做2倍系列稀释至所需稀释度，确保最终每孔含量为50μl，每个稀释度2～4孔。2.3稀释病毒取-70℃冰箱中保存的塞内卡病毒毒液(来源同实施例1)，按测定的毒价(tcid50/0.1ml)作200tcid50稀释。2.4中和将稀释好的病毒液加入2.2中的血清稀释板，每孔50μl，置5％co2培养箱37℃中和1小时。2.5加细胞悬液血清与病毒中和1小时后，取出96孔微量细胞板，每孔加入100μl细胞悬液(细胞密度为24小时长满单层为宜)，置5％co2培养箱37℃培养。2.6阴性和阳性血清对照各设2～4孔。阴性血清和阳性血清分别使用实施例1中的塞内卡病毒阴性猪血清和塞内卡病毒阳性猪血清。阴性、阳性血清对照的检测方法同待检血清。2.7病毒回归试验将200tcid50病毒液先用离心管作2倍稀释成100tcid50病毒液，再将100tcid50病毒液进行10、100、1000倍稀释，即获得10tcid50、1tcid50、0.1tcid50，每个稀释度4～8孔，再用移液器依次加入到96孔微量细胞培养板，每孔100μl，再加100μl细胞悬液(细胞密度为24小时长满单层为宜)。2.8细胞对照设立4～8孔正常细胞对照，每孔加100μl细胞维持液，然后加100μl细胞悬液。3结果观察、判定和计算3.1结果观察和判定每日观察，培养3～7天后进行结果判定。对照细胞应保持良好的形态和特征，阴、阳性对照血清抗体滴度均应成立，0.1tcid50/0.1ml孔不出现cpe，100tcid50/0.1ml孔全部出现cpe，则该实验成立，否则该实验不成立。3.2结果计算用reed-muench法计算血清的中和效价，效价≥1︰64判为阳性。对上述经病毒中和试验鉴定的57份阳性血清(编号为p001～p057)和46份阴性血清(编号为n001～n046)，用本发明的塞内卡病毒阻断elisa抗体检测试剂盒进行检测，验证该方法与病毒中和试验的符合率。结果如表4所示，可知试剂盒与病毒中和试验的符合率为97.6％。[表4]当前第1页12