一种抗精子抗体检测方法与流程

文档序号:17155248发布日期:2019-03-19 23:55阅读:744来源:国知局

本发明属于基因检测领域,具体是指一种抗精子抗体检测方法。



背景技术:

抗精子抗体既可在女性也可在男性体内产生。男性产生asab的主要机制是血屏障因疾病或创伤受损,使隐藏的精子或其可溶性膜抗原逸出,刺激机体免疫系统产生抗精子自身免疫抗体,简称asab。asab可抑制精子活动或受精,引起男性不育。女性产生asab的主要机制是正常生殖道中能降解精子抗原的酶系统缺陷,致使进入的精子抗原得以保存完整,而作为同种异体抗原剩激女性免疫系统则产生asab,影响生育。

人类精子抗原十分复杂,包括附着于精子表面的“精子附着抗原”和精子核抗原、胞质抗原、膜固有抗原等,共100余种,其中有些是精子特有的,有些是非特异性的有些与生育有关,有些无关。这些抗原均能引发机体产生相关抗体,抗精子抗体按其对精子的作用分为凝集性、制动性和结合性3类。

通常不育症患者血清中asab检出率为20%-30%左右,而在梗阻性无精患者中,asab患者,asab阳性率可高达60%。不孕患者血清与精浆中asab的1g种类有所不同,血清中通常以igm、igg类为主;而精浆中则以1gg、iga类出现较多。

asab阳性也可见于其它原因,如输精管阻塞以及睾丸和附睾的损伤和炎症。鉴于asab的异质性以及其中很多asab针对的靶抗原与生育并不相关,因此,asab的阳性结果必须结合临床综合考虑。

因此,如何研发一种抗精子抗体检测方法,能够解决上述问题,便成为亟待解决的技术问题。



技术实现要素:

本申请解决的主要问题是提供一种抗精子抗体检测方法,操作简单、流程科学,标准明确,实践操作效果好,以解决一种抗精子抗体检测方法成本高、流程不科学,标准不明确,实践操作效果不佳、操作难度高、难以复制操作的技术问题。

为了解决上述技术问题,本发明公开了一种抗精子抗体检测方法,其特征在于,包括:

步骤一:血清提取及试剂准备;

步骤二:准备包被孔与未包被孔,将步骤一准备的试剂中的稀释后的标准品、质控物及已稀释血清至包被孔与被包被孔中,水溶下进行第一次温育;

步骤三:根据所述步骤二中温育后的溶液孵育后,清洗并干燥微孔条,在所述微孔条每孔中加入稀释后酶标记抗体100u1,水浴进行第二次温育;

步骤四:清洗并干燥微孔条,每孔中加入底物液100u1,避光室温显色10-15分钟;

步骤五:每孔中加入终止液50u1,在酶标仪波长450nm比色读消光系数;

步骤六:结果读取为0-75u/ml判读为正常。

进一步的,所述步骤三和步骤四中的清洗并干燥微孔条包括:将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液.采用挤压式清洗瓶,则让每个微孔充满清洗液,然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上,最后在滤纸上拍干微孔条。

进一步的,还包括质控步骤:

每次实验均要进行高低浓度质控,并绘制质控图;

每块板均带阴阳性质控品,质控品位置可随机放置在elisa板中,也可放置在板的前面、中间、后面,阴性质控品为之前检测结果小于75u/ml的病人样本,阳性质控品为试剂盒内自带的质控品。

每批次质控结果录入urt,阳性质控使用westgard多规则中的1-3s和2-2s规则,阴性质控只需为阴性即可,若在控,则当批次实验结果有效;若失控,则需分析失控原因并按失控类型对当批次实验结果进行复查,并填写室内质控失控报告。

进一步的,所述标准品稀释方式为倍比稀释。

进一步的,所述底物液为tmb底物液。

进一步的,所述酶标记抗体包括过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白,抗人免疫球蛋白包括iga、igg和igm。

本申请提供的抗精子抗体检测方法操作简单便利并且灵活、降低检测成本,减少步骤流程,提高劳动效率,流程科学,标准明确,实践操作效果好。

具体实施方式

如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解,硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式,而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式,然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的,并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

实施例一:

取患者坐位静脉血,血清或血浆1ml,标本应无溶血,无脂血,无微生物污染;对溶血++++,黄疸++++,脂血++++的标本拒收,标本的采集应使用清洁无菌的一次性干燥管,标本用量最少100ul,血清和血浆样本在2-8℃保存,保存10天,若室温保存,可存放1天,若长期保存,需置一20℃保存、同时避免反复冻融血清。

试剂应在2-8℃保存,未用的包被板应放置防潮剂密封保存。已开封的包被板可在2-8℃稳定6周。

已稀释的洗涤液在温室可保存1天,要求现配先用,2-8℃可保存4周。

浓缩酶可保存到试剂有效期,但稀释后酶仅能在常温中稳定20分钟。

复融后稀释液在2-8℃可保存2天,-20℃可保存2个月。

试剂盒包括:(1)反应板;(2)600倍稀释后使用的浓缩液1瓶;(3)标准品s53瓶;(4)质控k3瓶;(5)稀释液3瓶;(6)20倍稀释后使用的浓缩洗液(7)底物液1瓶;(8)终止液1瓶。

操作步骤包括:

将试剂从冰箱中取出并平衡至室温约30min.将浓缩洗涤液用蒸馏水按所需量以要求比例进行稀释待用。

所用试剂使用前应充分混匀:不同的试剂瓶盖、不同批号的试剂不能混用。

洗涤液:25m1浓缩洗涤液+去离子水475m1,2-8℃保存4周。

稀释液:每瓶冻干稀释液粉末+20m1释后洗涤液,2-8℃保存2天。

标准品:标准品稀释为一个倍比稀释过程。

质控物:1瓶质控物冻干粉末+1m1稀释后洗涤液溶解。

联物稀释:用溶解后样本稀释液将浓缩酶联物按1:601倍稀释,需加酶前20分钟以内配制。

样本稀释:待检血清5u1+稀释液500u1。

根据需要准备包被孔与未包被孔、各标准品、质控物、病人样本都应做包被与未包被孔,将未用的包被条立即密封放回2-8℃;

分别加100u1标准品、质控物及已稀释血清至包被孔与被包被孔中,37℃水溶下温育60分钟。

解育后,将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液。采用挤压式清洗瓶,则让每个微孔充满清洗液,然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上,最后在滤纸上拍干微孔条。

每孔中加入稀释后酶标记抗体100u1,37℃水浴温育60分钟;

洗板,将微孔条在滤纸上轻轻拍打以除去微孔中的残液。采用挤压式清洗瓶,则让每个微孔充满清洗液,然后弃去清洗液.在清洗过程中应避免气泡的产生.重复清洗操作两次以上,最后在滤纸上拍干微孔条。

每孔中加入底物液100u1,避光室温显色10-15分钟。

每孔中加入终止液50u,在酶标仪波长450nm,参考波长600nm-650n比色读消光系数。

还包括质控步骤:

每次实验均要进行高低浓度质控,并绘制质控图;

每块板均带阴阳性质控品,质控品位置可随机放置在elisa板中,也可放置在板的前面、中间、后面,阴性质控品为之前检测结果小于75u/ml的病人样本,阳性质控品为试剂盒内自带的质控品。

每批次质控结果录入urt,阳性质控使用westgard多规则中的1-3s和2-2s规则,阴性质控只需为阴性即可,若在控,则当批次实验结果有效;若失控,则需分析失控原因并按失控类型对当批次实验结果进行复查,并填写室内质控失控报告。

所述标准品稀释方式为倍比稀释。

所述底物液为tmb底物液。

所述酶标记抗体包括过氧化酶标记的抗人免疫球蛋白,抗人免疫球蛋白包括iga、igg和igm。

上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例,但如前所述,应当理解本申请并非局限于本文所披露的形式,不应看作是对其他实施例的排除,而可用于各种其他组合、修改和环境,并能够在本文所述申请构想范围内,通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围,则都应在本申请所附权利要求的保护范围内。

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