一种卵母细胞质量评价方法与流程

本发明涉及生殖医学领域，具体涉及一种卵母细胞质量评价方法。

背景技术：

我国不孕症患者目前已经占到育龄人口的12.5％，人数已经超过4000万，并呈现出快速增长的趋势。辅助生殖技术(assistedreproductivetechnology,art)为不孕症患者带来了诞生新生命体的希望，然而在体外受精(invitrofertilization,ivf)中，近80％的胚胎着床失败，为提高成功率，各生殖中心进行多胚胎移植，由此多胎妊娠随之增加，而多胎妊娠出生的新生儿早产、死产、低出生体重、出生缺陷及母亲高血压等并发症均较自然受孕高。因此，准确预测卵母细胞的发育潜能，挑选出优质卵母细胞进行ivf，进而选出单个胚胎进行移植对提高ivf妊娠结局、孕育健康子代具有重大意义。

目前形态学方法是评估卵母细胞发育潜能最常用的方法，主要采取卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocytecomplexes,cocs)形态、第一极体形态、卵周隙大小、胞质形态、纺锤体形态学等判断卵母细胞质量。形态学方法无创、方便，但缺乏最合适的统一标准，不能准确反映卵母细胞的功能状态，且受观察者主观影响较大，观察者间的主观性使卵母细胞与胚胎发育的关联显示出差异性。因此，寻找一种更为客观、精准的卵母细胞质量评估方法迫在眉睫。

卵泡液构成卵母细胞生长、发育的微环境，卵母细胞在卵泡中的时间占据从生长到成熟时程的99％以上。研究表明卵泡液内含有生物活性代谢物和蛋白质等，可能影响卵泡生长、卵母细胞质量与受精以及胚胎的发育，因此卵泡液生物标志物最能够间接反映卵母细胞的质量。通过art取得卵母细胞后，卵泡液的一半作为废弃物而丢弃，这部分卵泡液可以作为用于评估所收集的卵母细胞质量优劣的丰富的资源。据此，运用组学技术研究卵泡液内含物，并筛选出特征标志物，将为建立一种客观、精准、无创性的卵母细胞质量评估方法奠定基础。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后新兴起的一门科学，是系统生物学的重要组成部分。nicholson等于1999年首次提出代谢组学概念:对受病理生理刺激或基因改变的生物体系所反应的动态代谢进行多参数定量分析。它以组群指标分析为基础，以高通量检测和数据处理为手段，以信息建模与系统整合为目标，定量分析特定时期特定生理条件下细胞体系中所有的代谢物。代谢物组即指生物样本中所有的小分子代谢物，包括代谢中介物及终产物，如氨基酸、脂类、核肽、atp等，它是细胞调节过程的终产物，理化特性广泛，反映生物体系受外部刺激所做出的变化。

代谢组学具有如下特点:首先，与细胞或机体的基因和蛋白质相比，代谢物数量显著少，人类基因组大约包含2.5万个基因，编码10万-20万个转录子，翻译100万种蛋白质，却仅产生2500-3000种代谢物，故代谢组检测要比转录组或蛋白组检测简单廉价。其次，转录组及蛋白组的改变并不总是与细胞表型相关，而代谢物组是基因表达的终产物，反映了细胞的真实功能状态，可较前者更准确地评估基因功能。最后，基因过度表达等微小变化经转录组和蛋白组逐级放大后，在代谢物水平上更易被检测。因此，代谢组学从筛选难易程度上更具优势，是良好的、潜在的卵泡液内特征标志物筛选方法。

技术实现要素：

根据本发明，提供一种卵母细胞质量评价方法，所述方法包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成。

其中，所述方法还包括比较卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的含量。

在所述方法中，可以通过核磁共振氢谱检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成差异，也可以通过gc-ms检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成及含量差异，还可以通过hplc-ms检测卵巢储备功能低下受试者与健康受试者的卵泡液代谢物的组成及含量差异。

所述方法对检测数据进行统计学分析，有统计学差异的组分被认定为标志物。

根据本发明的方法，被认定的标志物包括反式咖啡酰酒石酸和β-丙氨酸，进一步还包括牛磺酸、十六碳烯、油酸和焦磷酸。

根据本发明的方法，被认定的标志物包括括n-乙酰-d-色氨酸和亚牛磺酸，进一步还包括哌啶酸、尿素和肾上腺素。

附图说明

图1示出根据本发明的实施例2所描述的技术路线；

图2示出根据本发明的实施例3和4所描述的技术路线；

图3示出根据本发明的实施例5所描述的技术路线。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施方式对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。

根据本发明的一个实施方式，绘制卵巢功能低下与正常卵母细胞卵泡液代谢指纹图谱，筛选差异代谢物组。

卵巢储备是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精的卵母细胞的能力。此能力下降,即卵巢产生卵母细胞能力减弱,卵母细胞质量下降,所致的生育能力下降称为卵巢储备功能低下。以卵巢功能低下患者为研究对象，易得到质量较差的卵泡。而且排除其他多种因素的干扰，如子宫内膜异位、pcos等。最近一项研究回顾性分析卵巢功能低下患者与卵巢功能正常者颗粒细胞线粒体生物发生，筛选出两组间卵母细胞mtdna含量不同，并指出可能作为卵母细胞发育能力标志物。

根据本发明的一个实施方式，收集卵巢功能低下和卵巢功能正常的卵母细胞卵泡液，利用h¹-nmr(核磁共振氢谱)分析技术分别采集两组代谢物信息，利用偏最小二乘方判别分析(pls-da)建模分析，运用simca-p软件进行正交偏最小二乘方判别分析(opls-da)处理，通过opls-da模型第一主成分的vip(variableimportanceintheprojection)值(阈值>1)，并结合studentt检验的p值(阈值0.05)寻找差异代谢物组。并经hmdb人类代谢组学数据库进行检索，定性分析差异性代谢物。

根据本发明的一个实施方式，采用logistic回归模型，明确卵泡液代谢标志物组与卵母细胞质量之间的关系，筛选卵母细胞质量标志物。

根据本发明的一个实施方式，利用hplc-ms(高效液相色谱-质谱)技术对两组差异代谢物组进行含量测定，通过多远逐步logistic回归分析确定独立影响卵母细胞质量的差异代谢物，并赋予各代谢物反映卵巢储备功能的等级分值，据此建立卵母细胞质量评估系统。应用roc曲线下面积评价其诊断准确性，kappa检验评估其诊断可靠性。

本发明的创新性在于：

1)理论上创新

目前对卵泡液筛选差异代谢物研究，多数停留在代谢物对卵母细胞质量的影响并未建立卵巢储备功能评估体系。本研究利用hplc-ms加以定量分析，采用logistic回归模型，建立卵母细胞质量与差异代谢物的方程，并对各代谢物指标进行赋值，从而建立卵母细胞质量评价系统。评价只需利用hplc测量各差异代谢物组含量，根据赋值得出总评分，判断卵母细胞质量。

2)方法上创新

目前形态学方法是评价卵母细胞质量的常用方法，但缺乏最合适的统一标准，不能准确反映卵子的功能状态，观察者间的主观性使卵子与胚胎发育的关联显示出差异性。并未一种更为客观、精准的评估方法。本发明通过代谢组学分析，筛选特征生物标志物，明确卵泡液代谢标志物组与卵母细胞质量间关系，建立更加客观的、无创的卵母细胞质量评估系统。

实施例1

1.实验组卵巢功能低下患者的选择：

1)诊断标准：

根据文献报道关于卵巢功能低下的诊断标准进行诊断：12miu/ml＜bfsh＜40miu/ml，或窦卵泡数≤5-7个，或基础amh＜1.26ug/l，或fsh/lh比值升高＞2-3.6，或be2＞80pg/ml。

2)纳入标准：

①符合卵巢功能低下诊断标准。

②需要行ivf-et的不孕患者。

③年龄在25-30岁之间的已婚女性。

④接受ivf-et≤2次。

⑤受试者知情，自愿签署知情同意书。

3)排除标准：

①因子宫畸形导致不孕者

②多囊卵巢综合征、甲状腺功能异常等合并症的不孕症患者

③有其它器官严重疾病者。

④因男性因素导致不孕者。

⑤接受ivf-et≥3次。

4)剔除标准

①剔除：不应入组但已入组的受试者，应予剔除，包括误纳、误诊患者。不作统计分析。

根据以上选取标准入组患者10例，保证每位患者年龄、身高、体重、饮食习惯最相近。

2.对照组健康者的选择：

对于因男性不育或女性输卵管不通原因造成的不孕，需采取辅助生殖技术的无其他疾病的患者作为卵巢功能正常的对照组。年龄要求在25-30岁之间。入组健康者10例，与患者年龄、身高、体重、饮食习惯最相近。

3.卵子与卵泡液获取

①卵泡的选择：经阴道b超引导下行穿刺取卵术取卵。实验组和对照组分别选取10例大小相近的卵泡提取的卵泡液作为测试样品。

②卵泡液提取：分离卵母细胞于50μlhtf液中单独体外培养4h后行常规体外受精，受精后16-18h(d1)检查原核形成情况，并换液至20μlp1液中继续培养，出现双原核为正常受精。吸取卵泡液，置于低温离心机中，2000r/min离心10min，吸取上清液分装至无菌样品管，每管1ml，置-80℃冰箱中保存备用。

实施例2

基于nmr技术对卵泡液代谢组分分析：

按照如图1所示技术路线，将2ml冻存的卵泡液置冷冻干燥机中，经过升华、干燥后，制成冻干粉，密封保存。冻干粉取1g用75％色谱甲醇沉淀，12000r/min离心10min后，取其上清液，氮气吹干，350ul重水溶解后，用bruker800mhznmr测定氢谱，计算积分值。运用监督分析法偏最小二乘法-辨别分析(pls-da)，应用simca-p和metaproc软件进行opls-da处理。筛选出差异代谢物组，查找经hmdb人类代谢组学数据库进行检索，定性分析差异性代谢物。

实施例3

用hplc-ms方法对差异代谢物定量分析：按照如图2所示技术路线进行如下操作。

①样本准备：卵泡液于4℃避光复融，取150μl，分别加入20μl内标溶液与30μl水混匀。于4℃静置15min，10000rpm离心10min。取上清，0.45μm滤膜过滤后待测。

②分类与条件确定：将差异代谢物组根据化学结构与性质分成若干组，如氨基酸类、糖类、脂类等。利用高效液相色谱分析系统对卵泡液样品进行含量测定，根据文献或预实验摸索确定每组物质的分离条件；确定流动相体积比，柱温，流速以及荧光检测激发波长等。

③检测分析：采用全扫描形式进行质谱检测,质谱检测范围为50-1000m/z。根据总离子流图中各峰的保留时间挑选共有峰(即各图谱中共有的色谱峰),获取各峰与内标峰的峰面积数据,用相对峰面积(与内标峰的比值)表示代谢物的含量。根据内标物实际加入量测算样品中差异代谢物的具体含量。统计分析差异代谢物组在对照组和实验组卵泡液中含量的范围值。

实施例4

按照如图2所示技术路线，采用logistic回归模型建立卵巢储备功能与差异代谢物关系方程

①入组病例：按照入组、排除、剔除标准入组卵巢功能低下患者及卵巢功能正常者

(按上述标准)，每组各50例。

②含量测定：收集卵母细胞卵泡液(按上述方法)，采用hplc方法测定两组差异代谢物具体含量。

③建立方程：以卵母细胞质量为因变量，差异代谢物含量为自变量，建立logistic

回归方程，采用向前法，逐步排出相互影响的差异代谢物，筛选出具有独立影响因素的差异代谢物组。

④建立评价系统：根据各指标权重分成3个间隔，应用卡方自动交互检测(chaid)

分别赋予相应的等级分值，建立卵母细胞质量评价系统。

实施例5

评价系统准确性及可靠性分析：按照如图3所示技术路线进行如下操作。

①入组病例：按照入组、排除、剔除标准入组卵巢功能低下患者20例。实施超促

排卵方案或者其他药物干预。

②含量测定：收集卵母细胞卵泡液(按上述方法)，采用hplc方法测定两组差异

代谢物具体含量。

③采用评价系统：根据相应赋值计算出总分。预判卵母细胞质量优劣。

④确定cut-off值：进行icsi及胚胎移植以及随访观察，以胎心出现为怀孕成功，间接表明卵母细胞质量好，以未出现胎心为怀孕失败，表明卵母细胞质量低下。计算例数，并计算假阳性率以及假阴性率。绘制roc，计算曲线下面积(auc)，确定cut-off值。

实施例6

资料的收集与分析：

采用spss19.0软件数据处理与统计分析。数据用“均数±标准差”表示，方差齐性两组计数资料比较采用studentt检验，以p＜0.05作为差异有统计学意义。根据hplc-ms总离子流图中各峰的保留时间挑选共有峰(即各图谱中共有的色谱峰)，获取各峰与内标峰的峰面积数据,用相对峰面积(与内标峰的比值)表示代谢物的含量；应用simca-p11.5软件进行opls-da处理。

上述说明示出并描述了本发明的一些实例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附加权利要求的保护范围内。

以上结合优选实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明。不过需要声明的是，这些具体实施方式仅是对本发明的阐述性解释，并不对本发明的保护范围构成任何限制。在不超出本发明精神和保护范围的情况下，可以对本发明技术内容及其实施方式进行各种改进、等价替换或修饰，这些均落入本发明的保护范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。