一种基于数字微流控技术的真菌检测系统及真菌检测方法与流程

本发明属于数字微流控技术领域，尤其是涉及一种基于数字微流控技术的真菌检测系统及真菌检测的方法。

背景技术：

目前因真菌引起的疾病发病率迅速上升，而快速、有效、便捷的真菌检测系统的发展也备受关注。elisa作为一种重要的真菌检测方法应用日趋成熟，利用抗体和抗原的特异性结合，经过孵育洗涤后，加入底物溶液产生显色反应，确定其在特定波长光照下的吸光度，可以实现真菌的检测。

介质上电润湿技术通过电压改变液滴在介质表面的润湿性能实现对液滴的操控，具有驱动方式简单、驱动力强、自动化程度高等许多优点。微流控作为一种微纳流体处理技术近年来备受关注。其成本低、通量高、分析速度快、试剂消耗少的优势，对于真菌细菌检测系统的降低成本、设备小型化集成化等具有重要意义。基于介电润湿的数字微流控作为一种新兴的离散化微液滴操纵手段，基于微电极阵列来实现离散液滴精确控制(包括移动、合并、分裂等操作)，利用液滴在疏水化表面上的介电润湿现象实现了对微液滴的操控，可实现大通量离散化液滴的可控精准控制。这种操作方式具有高并行性和全自动化的特点，能够实现多通路实时可控反应，特别适用于高集成度、高性能、操作复杂的微生化分析系统。

技术实现要素：

本发明要解决的问题是提供一种可实现真菌细菌检测小型化、集成化的基于数字微流控技术的真菌检测系统及真菌检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于数字微流控技术的真菌检测系统，包括数字微流控芯片、集成电路、光度检测模块、控温孵育模块，所述数字微流控芯片分别与所述集成电路、光度检测模块、控温孵育模块连接，所述控温孵育模块设于所述光度检测模块下方，所述集成电路分别与所述光度检测模块、控温孵育模块连接，所述集成电路和光度检测模块分别连接计算机。

技术方案中，优选的，所述数字微流控芯片包括平行放置的下极板、上极板和中间的间隙，液滴在所述间隙中运动；所述上极板从上到下依次设置的上基底、上导电层和上疏水层，所述下极板包括从上到下依次设置的下疏水层、介质层、下导电层和下基底；所述下导电层包括样本区、液滴生成通道电极阵列、试剂储液单元和孵化检测区，所述样本区、液滴生成通道电极阵列、试剂储液单元均为具有一定形状的金属电极阵列，所述样本区、试剂储液单元和孵化检测区设置于所述液滴生成通道电极阵列周围。

技术方案中，优选的，所述光度检测模块包括从上到下依次设置的发光二极管、滤光片、光圈、硅光电池。

技术方案中，优选的，所述孵化检测区设于所述光圈和所述硅光电池之间。

技术方案中，优选的，所述样本区数量为2-4个，所述孵化检测区包括5-10个分区。

技术方案中，优选的，所述样本区、液滴生成通道电极阵列和孵化检测区的电极部分均为矩形叉齿形电极。

技术方案中，优选的，所述试剂储液单元包括标记后抗体区、洗液区、底物溶液区、终止液区、临界值对照品区、阴性对照品区、阳性对照品区及废液区。

一种利用基于数字微流控技术的真菌检测系统的真菌检测方法，包括如下步骤：

步骤1、将标记后抗体、洗液、底物溶液、终止液、临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品分别加入试剂储液单元各对应区中，将各样本分别加入各样本区中；

步骤2、通过集成电路的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，分别将抗体试剂以单个液滴形式，通过液滴生成通道电极阵列移动至孵化检测区各分区，控制各分区内电极对抗体试剂进行搅拌，然后将试剂移动至废液区；

步骤3、按照步骤2的液滴操作方法，向孵化检测区的各区中分别加入临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品及各样本，分别进行搅拌；

步骤4、集成电路控制控温孵育模块保持36.5-37.5℃，孵育85-95min，然后将试剂移动至废液区；

步骤5、按照步骤2的液滴操作方法，将洗液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌后移至废液区，重复4-8次；

步骤6、按照步骤2的液滴操作方法，将底物溶液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤7、控制控温孵育模块，保持36.5-37.5℃，孵育15-25min，将孵化检测区各区内试剂移动至废液区；

步骤8、按照步骤2的液滴操作方法，将终止液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤9、集成电路控制光度检测模块，使发光二极管发光，测出孵化检测区各区光信号功率读数od值，计算样本指数。

技术方案中，优选的，所述间隙中注有氟油。

技术方案中，优选的，所述上极板、孵化检测区均为透明。

本发明具有的优点和积极效果是：

(1)数字微流控实现对液滴更灵活、快速的控制，自动化和集成化方面优势明显，试剂及样本需求量更小，系统体积更小，且移液操作可多路同时进行，效率更高；

(2)样本区、液滴生成通道电极阵列和孵化检测区电极采用矩形叉齿形结构，可以增大液滴与相邻电极的接触面积，更利于液滴的移动，有助于降低驱动电压；

(3)孵化检测区与电极通道集成，使得液滴移动、孵化、检测高度集成，提高集成度，简化移液检测流程；

(4)设置对照组，检测结果更加准确；

(5)孵化检测区上下均为透明结构，液滴厚度固定，光照位置固定，可直接进行显色后的光度测量，效率更高、更准确。

附图说明

图1为本发明一实施例基于数字微流控技术的真菌检测系统的整体系统图。

图2为本发明一实施例基于数字微流控技术的真菌检测芯片的侧面结构示意图。

图3为本发明一实施例在图1的数字微流控芯片的分区及平面结构示意图。

图4为本发明一实施例在图1的数字微流控芯片上实现真菌检测的原理图。

图中：

1-数字微流控芯片、2-集成电路、3-光度检测模块、4-控温孵育模块

11-下极板、12-上极板、13-间隙

111-下疏水层、112-下导电层、113-介质层、114-下基底

121-上基底、122-上导电层、123-上疏水层

1121-样本区、1122-液滴生成通道电极阵列、1123-试剂储液单元、1124-孵化检测区

31-发光二极管、32-滤光片、33-光圈、34-硅光电池

c-标记后抗体区，d-洗液区，e-底物溶液区，f-终止液区，g-临界值对照品区，h-阴性对照品区，i-阳性对照品区，k-废液区

具体实施方式

实施例1

下面结合附图以数字微流控芯片1上的曲霉菌半乳甘露聚糖检测(elisa法)为例，对本发明进行进一步细致描述。

如图1所示，一种基于数字微流控技术的真菌检测系统，包括数字微流控芯片1、集成电路2、光度检测模块3、控温孵育模块4，数字微流控芯片1分别与集成电路2、光度检测模块3、控温孵育模块4连接，控温孵育模块4设于光度检测模块3下方，集成电路2分别与光度检测模块3、控温孵育模块4连接，集成电路2和光度检测模块3分别连接计算机，光度检测模块3包括从上到下依次设置的发光二极管31、滤光片32、光圈33、硅光电池34。

如图2-4所示，数字微流控芯片1为双极板结构，包括平行放置的下极板11、上极板12和中间的间隙13，液滴在间隙13中运动；上极板12从上到下依次设置的上基底121、上导电层122和上疏水层123，下极板11包括从上到下依次设置的下疏水层111、介质层113、下导电层112和下基底114，介质层113均匀平整覆盖在下导电层112上表面，上基底121、下基地材料为玻璃，上疏水层123、下疏水层111采用等离子疏水处理，减少其他材质疏水涂层对电学特性的影响，改善疏水层易击穿的问题。

下导电层112包括2-4个样本区1121、液滴生成通道电极阵列1122、试剂储液单元1123和孵化检测区1124，样本区1121、试剂储液单元1123和孵化检测区1124设置于液滴生成通道电极阵列1122周围，样本区1121、液滴生成通道电极阵列1122、试剂储液单元1123均为具有一定形状的金属或导电玻璃电极阵列，孵化检测区1124的电极材料为导电玻璃(ito)，样本区1121、液滴生成通道电极阵列1122和孵化检测区1124电极形状为矩形叉齿形，矩形叉齿形电极可以增大液滴与相邻电极的接触面积，有助于促进液滴的移动，降低驱动电压。

试剂储液单元1123包括标记后抗体区、洗液区d、底物溶液区e、终止液区f、临界值对照品区g、阴性对照品区h、阳性对照品区i及废液区k，便于存放、取出各试剂。

上极板12、下极板11及光度孵化检测区3均设计为透明结构，孵化检测区上下设计为透明结构，液滴厚度固定，光照位置固定，可直接进行显色后的光度测量，效率更高、更准确。

孵化检测区1124设于光圈33和硅光电池34之间，包括5个以上分区，制备过程中在孵化检测区1124内完成真菌抗体对应包被原的包被过程。

一种利用基于数字微流控技术的真菌检测系统的真菌检测方法，包括如下步骤：

步骤1、将标记后抗体、洗液、底物溶液、终止液、临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品分别加入试剂储液单元1123各对应区中，将各样本分别加入各样本区1121中；

步骤2、通过集成电路2的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，分别将抗体试剂以单个液滴形式，通过液滴生成通道电极阵列1122移动至孵化检测区1124各分区，控制各分区内电极对抗体试剂进行搅拌，然后将试剂移动至废液区；

步骤3、按照步骤2的液滴操作方法，向孵化检测区1124的各区中分别加入临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品及各样本，分别进行搅拌；

步骤4、集成电路2控制控温孵育模块4保持36.5℃，孵育85min，然后将试剂移动至废液区；

步骤5、按照步骤2的液滴操作方法，将洗液移至孵化检测区1124各区，分别进行搅拌后移至废液区，重复6次；

步骤6、按照步骤2的液滴操作方法，将底物溶液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤7、控制控温孵育模块4，保持37.5℃，孵育20min，将孵化检测区1124各区内试剂移动至废液区；

步骤8、按照步骤2的液滴操作方法，将终止液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤9、集成电路2控制光度检测模块3，使发光二极管31发光，测出孵化检测区各区光信号功率读数od值，计算样本指数；

数据处理：

临界值对照值的均值：将2个临界值对照品的od值相加，除以2；

阴性对照指数：将阴性对照的od值除以临界值对照品的od值均值；

阳性对照指数：将阳性对照的od值除以临界值对照品的od值均值；

样本指数：将样本的od值除以临界值对照品的od值均值。

质量控制及结果判读：

临界值对照品的od值＞0.2，表示临界值对照有效；

阴性对照指数＜0.4，表示阴性对照有效；

阳性对照指数＞1.5，表示阳性对照有效；

样本指数≥0.5为阳性，样本指数＜0.5为阴性。

通过集成电路2的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，从储液电极单元产生液滴，随后进行抗体结合-加样品-孵育-洗涤-孵育-加底物-孵育-终止-光照光度检测，进行光度检测的时候，发光二极管31发出光信号，光圈33和下方孵化检测区1124及硅光电池34对准，光信号通过滤光片32及光圈33，以特定位置、特定波长照射到样品上，通光照射到硅光电池34上，获得光功率(光度)值，传输到计算机上。

为了防止液滴的挥发和表面黏附，在间隙13中加入氟油，可促进液滴的移动。

搅拌具体操作为在区域内，重复20-30次液滴移动、液滴分离后合并。

真菌检测系统全程处于封闭避光环境中。

本发明的数字微流控制作工艺如下：

下极板11的制作：

(1)下极板11基底选择任意绝缘透明材料，如玻璃，在基底上通过光刻、溅射等工艺形成具有一定图形的金属电极层，其中孵化检测区电极材料选取透光率高的材料，如ito等，通过等离子体增强的化学气相沉积形成；

(2)介质层113为具有高介电常数、厚度均匀、上表面平整、抗击穿能力强的绝缘材料，如pdms、pmma、paralyene-c、si3n4等材料，通过旋涂或沉积的方式形成，厚度2-5μm；

(3)疏水层可通过旋涂teflon退火后形成，也可通过对介质层113上表面进行等离子疏水处理或硅烷化溶液处理形成，厚度2μm以下；

(4)制作完成后将孵化检测区浸泡于包被溶液中，进行抗体对应包被原的包被处理。

上极板12的制作：

(1)上极板12基底选择任意绝缘透明材料，如玻璃；

(2)导电层选取透光率高的材料，如ito等，通过沉积形成；

(3)上极板12疏水层与下极板11疏水层一致。

上下极板11之间为100μm的间隙13(间距可选50-500μm)，液滴通过对应下极板11储液电极单元上方的上级板位置开孔，从外部滴入，在间隙13中加入氟油油封，起到隔绝污染、防止液滴挥发、促进液滴移动的作用。

实施例2

一种利用基于数字微流控技术的真菌检测系统的真菌检测方法，包括如下步骤：

步骤1、将标记后抗体、洗液、底物溶液、终止液、临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品分别加入试剂储液单元1123各对应区中，将各样本分别加入各样本区1121中；

步骤2、通过集成电路2的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，分别将抗体试剂以单个液滴形式，通过液滴生成通道电极阵列1122移动至孵化检测区1124各分区，控制各分区内电极对抗体试剂进行搅拌，然后将试剂移动至废液区；

步骤3、按照步骤2的液滴操作方法，向孵化检测区1124的各区中分别加入临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品及各样本，分别进行搅拌；

步骤4、集成电路2控制控温孵育模块4保持37℃，孵育95min，然后将试剂移动至废液区；

步骤5、按照步骤2的液滴操作方法，将洗液移至孵化检测区1124各区，分别进行搅拌后移至废液区，重复4次；

步骤6、按照步骤2的液滴操作方法，将底物溶液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤7、控制控温孵育模块4，保持36.5℃，孵育25min，将孵化检测区1124各区内试剂移动至废液区；

步骤8、按照步骤2的液滴操作方法，将终止液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤9、集成电路2控制光度检测模块3，使发光二极管31发光，测出孵化检测区各区光信号功率读数od值，计算样本指数。

数据处理：

临界值对照值的均值：将2个临界值对照品的od值相加，除以2；

阴性对照指数：将阴性对照的od值除以临界值对照品的od值均值；

阳性对照指数：将阳性对照的od值除以临界值对照品的od值均值；

样本指数：将样本的od值除以临界值对照品的od值均值。

质量控制及结果判读：

临界值对照品的od值＞0.2，表示临界值对照有效；

阴性对照指数＜0.4，表示阴性对照有效；

阳性对照指数＞1.5，表示阳性对照有效；

样本指数≥0.5为阳性，样本指数＜0.5为阴性。

实施例3

一种利用基于数字微流控技术的真菌检测系统的真菌检测方法，包括如下步骤：

步骤1、将标记后抗体、洗液、底物溶液、终止液、临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品分别加入试剂储液单元1123各对应区中，将各样本分别加入各样本区1121中；

步骤2、通过集成电路2的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，分别将抗体试剂以单个液滴形式，通过液滴生成通道电极阵列1122移动至孵化检测区1124各分区，控制各分区内电极对抗体试剂进行搅拌，然后将试剂移动至废液区；

步骤3、按照步骤2的液滴操作方法，向孵化检测区1124的各区中分别加入临界值对照品、阴性对照品、阳性对照品及各样本，分别进行搅拌；

步骤4、集成电路2控制控温孵育模块4保持37.5℃，孵育90min，然后将试剂移动至废液区；

步骤5、按照步骤2的液滴操作方法，将洗液移至孵化检测区1124各区，分别进行搅拌后移至废液区，重复8次；

步骤6、按照步骤2的液滴操作方法，将底物溶液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤7、控制控温孵育模块4，保持37℃，孵育15min，将孵化检测区1124各区内试剂移动至废液区；

步骤8、按照步骤2的液滴操作方法，将终止液移至孵化检测区各区，分别进行搅拌；

步骤9、集成电路2控制光度检测模块3，使发光二极管31发光，测出孵化检测区各区光信号功率读数od值，计算样本指数。

数据处理：

临界值对照值的均值：将2个临界值对照品的od值相加，除以2；

阴性对照指数：将阴性对照的od值除以临界值对照品的od值均值；

阳性对照指数：将阳性对照的od值除以临界值对照品的od值均值；

样本指数：将样本的od值除以临界值对照品的od值均值。

质量控制及结果判读：

临界值对照品的od值＞0.2，表示临界值对照有效；

阴性对照指数＜0.4，表示阴性对照有效；

阳性对照指数＞1.5，表示阳性对照有效；

样本指数≥0.5为阳性，样本指数＜0.5为阴性。

以上对本发明的若干实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。