本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种类风湿因子检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：类风湿因子(rheumatoidfactor，rf)是一种抗变性igg的自身免疫性抗体，可与人及多种动物igg分子的fc段结合。rf有igm、igg、iga、ige、igd五种，其中以igm为主，也可见igg和iga，而ige、igd少见。类风湿因子与人体内变性igg形成免疫复合物，激活补体，引起组织损伤。rf可在大多数类风湿关节炎(ra)患者的血清中检测到，是临床上诊断ra的重要依据之一。虽然rf的检测并不能直接得出疾病诊断的结果，必须综合临床症状等多种指标才能得到疾病诊断的结论，但是rf的检测可作为一项重要的参考指标，对于后期ra确诊具有重要意义。目前，类风湿因子多采用胶乳凝集法和散射比浊法，但是这两种方法不能对rf进行分型检测且灵敏度不高。随着临床上对rf分型检测的认可，国内和国外都已有rf的elisa产品上市，多采用间接法原理。化学发光平台目前产品较少，但相比操作繁琐的elisa，化学发光法操作相对简单，且灵敏度高，检测范围宽。所以采用化学发光法进行类风湿因子检测是趋势所在。化学发光免疫分析是近年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析技术。检测原理是以发光物质作为信号放大系统并借助其发光强度直接测定免疫结合。该方法灵敏度高、检测范围宽，是免疫学检测重要的发展方向。技术实现要素：为解决上述现有技术问题，本发明提供一种类风湿因子检测试剂盒及其检测方法。一种类风湿因子检测试剂盒，该试剂盒包括试剂r1、试剂r2和试剂r3；所述试剂r1中含有包被兔igg的磁微粒；所述试剂r2中含有抗人igm抗体、抗人igg抗体、抗人iga抗体中一种或多种的标记物；所述试剂r3是由缓冲体系、无机盐、糖类物质、蛋白类物质、着色剂、乙二胺四乙酸二钠、非离子表面活性剂和防腐剂按一定比例混合组成。在一种优选实施方式中，所述标记物上标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯或吖啶酯衍生物中的一种。在一种优选实施方式中，所述试剂r3是由以下浓度的组分组成：10～50mm、ph值为6～8的缓冲体系；5～50g/l的无机盐；5～200g/l的糖类物质；5～100g/l的蛋白类物质；0.05～0.5g/l的着色剂；8～50mm的乙二胺四乙酸二钠；0.01～10ml/l的非离子表面活性剂和0.1～10ml/l的防腐剂。在另一种优选实施方式中，所述试剂r1中的磁微粒为顺磁微粒，该磁微粒选自亲和素磁微粒、甲苯磺酰基磁微粒、羧基磁微粒中的一种；所述试剂r1还包括缓冲体系、无机盐、糖类物质、蛋白类物质、非离子表面活性剂、多元醇和防腐剂；所述r2还包括缓冲体系、无机盐、糖类物质、蛋白类物质、着色剂、非离子表面活性剂、多元醇和防腐剂。在另一种实施方式中，一种类风湿因子检测试剂盒，该试剂盒是包括试剂r1、试剂r2和试剂r3；所述试剂r1是由以下浓度的成分组成：0.2～2mg/ml的包被兔igg的磁微粒；10～200mm、ph值为6～8.5的缓冲体系；4～50g/l的无机盐；2～300g/l的糖类物质；5～160g/l的蛋白类物质；0.01～10ml/l的非离子表面活性剂；5～50ml/l的多元醇和0.1～10ml/l的防腐剂；所述试剂r2是由以下浓度的成分组成：0.03～4μg/ml的抗人igm抗体、抗人igg抗体、抗人iga抗体混合物的标记物；10～200mm、ph值为5.5～8.5的缓冲体系；4～50g/l的无机盐；2～300g/l的糖类物质；5～160g/l的蛋白类物质；0.05～0.5g/l的着色剂；0.01～10ml/l的非离子表面活性剂；5～50ml/l的多元醇和0.1～10ml/l的防腐剂；所述试剂r3是由以下浓度的成分组成：10～50mm、ph值为6～8的缓冲体系；5～50g/l的无机盐；5～200g/l的糖类物质；5～100g/l的蛋白类物质；0.05～0.5g/l的着色剂；8～50mmol/l乙二胺四乙酸二钠；0.01～10ml/l的非离子表面活性剂和0.1～10ml/l的防腐剂。在一种优选实施方式中，所述缓冲体系为磷酸缓冲体系、tris缓冲体系、mes缓冲体系或hepes缓冲体系；所述无机盐为氯化钠；所述糖类物质选自甘露醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖中的一种或多种；所述蛋白类物质选自酪蛋白、牛血清白蛋白中的一种或多种；所述着色剂为果绿色素、日落黄、苋菜红或柠檬黄；所述非离子表面剂为tween-20、tween-80、span-60、tritonx-45、tritonx-100或tritonx-305；所述多元醇为丙三醇；所述防腐剂为krovin系列防腐剂、proclin系列防腐剂或叠氮钠。在另一种优选实施方式中，所述试剂盒还包括校准品；所述校准品是由以下浓度的组分组成：0.1～500au的类风湿因子；0～50mm、ph值为6～8的缓冲体系；4～20g/l的无机盐；1～200g/l的糖类物质；5～150g/l的蛋白类物质；0.20g/l的着色剂；0.01～10ml/l的非离子表面活性剂；5～50ml/l的多元醇和0.1～10ml/l的防腐剂。一种利用上述的类风湿因子检测试剂盒进行类风湿因子的检测方法，该方法包括以下步骤：首先，将样本与试剂r1和试剂r3混合均匀，使其结合充分后，磁场作用下洗涤多次，然后，加入试剂r2，待结合充分后，将未结合的物质清洗去除后，加入发光底物，然后，测定发光反应后的吸光度。在一种优选实施方式中，所述样本、试剂r1、试剂r3的体积比为1:4～6:8～12。在更进一步地优选实施方式中，所述样本、试剂r1、试剂r3的体积比为1:5:10。下面将详细地解释本发明。本发明提供的一种检测类风湿因子试剂盒，检测类风湿因子采用全自动化学发光磁微粒免疫分析方法；本发明还采用了试剂r3。因在保存过程中，试剂r1和试剂r2极易变质或保存时间较短；因此往往需在试剂r1和试剂r2中加入稳定剂、防腐剂等可使试剂r1和试剂r2在检测时保持较好的测试活性的添加剂，但是添加剂加入过多影响检测结果的准确性；此外，由于试剂盒容量的限制，测试用试剂不能充分的尽可能多的放入试剂盒中；因此本发明增加了试剂r3，以解决上述问题。发明人发现，如果单独配置试剂r3，在测试时再按适当比例将样本、试剂r1和试剂r3混合，可以有效解决检测试剂保存时间较短的问题，同时还可以确保检测试剂在检测时具备最佳缓冲液体系，提高检测灵敏度和准确性。此外，发明人意外发现，单独配置的试剂r3还有效的降低了类风湿因子检测过程中的交叉反应——在使用常规类风湿检测试剂盒时，如果直接对样本进行检测，检测过程中容易受到样本中补体的干扰，影响检测准确性；为了避免样本中补体的干扰，往往需在检测前对样本进行热处理。而本发明的类风湿检测试剂盒由于增加了试剂r3，将其加入到样本后，样本无需热处理，直接测试就可避免补体的干扰。因此，本发明的试剂盒由于增加了试剂r3而提高了检测特异性，本发明试剂盒的抗干扰能力更强。本发明中，试剂r1中1mg磁微粒上包被的兔igg优选为0.3～60μg。当试剂r2中含有抗人igm抗体、抗人igg抗体、抗人iga抗体混合物的标记物时，该混合物中抗人igm抗体、抗人igg抗体、抗人iga抗体的质量比优选为6～12:0.5～2:0.5～2。综上，本发明的试剂盒具有灵敏度高、线性范围宽、抗干扰能力强、安全快速检测等优点。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。定义缓冲体系本发明的缓冲体系是指由弱酸及其盐、弱碱及其盐组成的混合溶液，能在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定。本发明缓冲体系包括磷酸缓冲体系、tris缓冲体系、mes缓冲体系或hepes缓冲体系。磷酸缓冲体系包括nah2po4和na2hpo4、nah2po4和k2hpo4、kh2po4和na2hpo4、kh2po4和k2hpo4。当使用的缓冲体系为磷酸缓冲体系时，其缓冲体系的浓度以磷酸根浓度计。无机盐无机盐在本发明的缓冲液中作用为提供电解质。本发明中无机盐优选钠盐、钾盐；更优选地，本发明的无机盐为氯化钠。糖类物质糖类物质在本发明缓冲液中的作用为稳定作用，本发明缓冲液中常用的糖类物质为甘露醇、海藻糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖。蛋白类物质蛋白类物质在本发明缓冲液中的作用为稳定作用，本发明的蛋白类物质为酪蛋白和/或牛血清白蛋白。着色剂任何可以使物质显现设计需要颜色的物质都称为着色剂。它可以是有机或无机的，可以是天然的或合成的。着色剂又称食品色素，是以食品着色为主要目的，使食品赋予色泽和改善食品色泽的物质。目前世界上常用的食品着色剂有60余种，我国允许使用的有46种，按其来源和性质分为食品合成着色剂和食品天然着色剂两类。本发明的着色剂为辨识作用。常用着色剂包括果绿色素、苋菜红、胭脂红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝、赤红、诱惑红等。非离子表面活性剂非离子表面活性剂是指在水溶液中不电离，其亲水基主要是由具有一定数量的含氧基团(一般为醚基和羟基)构成。因为在溶液中不是离子状态，所以稳定性高，不易受强电解质无机盐类存在的影响，也不易受ph值的影响，与其他类型表面活性剂相容性好。本发明中非离子表面活性剂用于促溶和增强免疫反应。本发明的非离子表面活性剂优选tween-20、tween-80、span-60、tritonx-45、tritonx-100或tritonx-305。防腐剂防腐剂是能抑制微生物活动，防止食品腐败变质的一类食品添加剂。本发明中防腐剂作用为防腐。本发明防腐剂为krovin系列防腐剂、proclin系列防腐剂或叠氮钠。所述krovin系列防腐剂优选krovin100、krovin400、krovin500或krovin750；所述proclin系列防腐剂优选proclin50、proclin150、proclin200、proclin300、proclin950或proclin5000。以类风湿因子(igm)的检测试剂盒为例，一、试剂盒的制备方法如下：1)试剂r1——磁微粒包被兔igg，具体过程如下：抗体生物素化：取适量兔igg，加入适量生物素酯，室温条件下于混匀仪上混匀反应0.5～3小时，然后加入适量tris水溶液，室温条件下于混匀仪上混匀反应10～30分钟，混合液用磷酸缓冲液透析，透析后得生物素化兔igg；包被抗体：将适量生物素化兔igg与链霉亲和素磁微粒混合，室温条件下于混匀仪上混匀反应0.5～3小时，将包被好的磁微粒用磁微粒保护缓冲液清洗后重新悬浮至0.2～2mg/ml，得到试剂r1。(生物素化兔igg的包被量范围0.3～60μg/mg)。所述的磁微粒保护缓冲液配方如下表：表1为磁微粒保护缓冲液的配方具体成分浓度缓冲体系10～200mm(ph6～8.5)无机盐4～50g/l糖类物质2～300g/l蛋白类物质5～160g/l非离子表面活性剂0.01～10ml/l多元醇5～50ml/l防腐剂0.1～10ml/l2)吖啶酯标记的抗人igm抗体取适量抗人igm抗体，加入适量吖啶酯，室温条件下于混匀仪上避光混匀反应0.5-5小时，然后加入适量赖氨酸水溶液，室温条件下于混匀仪上避光混匀反应10-30分钟，混合液经过脱盐柱纯化后得到吖啶酯标记的抗人igm抗体。用标记物保护缓冲液将其稀释至0.03～4μg/ml，得到免疫标记物，即试剂r2。所述标记物保护缓冲液的组分如表2所示：表2为本发明标记物保护缓冲液的组分具体成分浓度缓冲体系10～200mm(ph5.5～8.5)无机盐4～50g/l糖类物质2～300g/l蛋白类物质5～160g/l着色剂0.05～0.5g/l非离子表面活性剂0.01～10ml/l多元醇5～50ml/l防腐剂0.1～10ml/l3)试剂r3的配制本发明试剂r3按照表3进行配制：表3为本发明试剂r3的配方具体成分浓度缓冲体系10～50mm(ph6～8)无机盐5～50g/l糖类物质5～200g/l蛋白类物质5～100g/l着色剂0.05～0.5g/l乙二胺四乙酸二钠8～50mm非离子表面活性剂0.01～10ml/l防腐剂0.1～10ml/l4)校准品的配制本发明的校准品包括校准品1和校准品2两个点，取适量类风湿因子用校准品稀释液分别稀释至30au/ml和300au/ml。该标准品稀释液的组分如表所示。表4为本发明校准品稀释液的组分具体成分浓度缓冲体系0～50mm(ph6～8)无机盐4～20g/l糖类物质1～200g/l蛋白类物质5～150g/l着色剂0.20g/l非离子表面活性剂0.01～10ml/l多元醇5～50ml/l防腐剂0.1～10ml/l二、人血清(血浆)中类风湿因子浓度的检测方法：整个检测均是在全自动化学发光仪上进行。首先，将样本和包被了兔igg的磁微粒(试剂r1)及分析缓冲液(试剂r3)混合反应，如果样本中含有类风湿因子，将形成抗体-抗原复合物。混合液中的磁微粒在磁场的作用下被吸附住，通过多次洗涤，未结合的物质被清洗除去。然后加入抗人igm抗体的标记物(试剂r2)，此时将形成抗原-抗体-二抗夹心复合物。然后，混合液中的磁微粒在磁场的作用下被吸附住，通过多次洗涤，未结合的物质被清洗除去。然后，加入免疫分析仪底物液1和免疫分析仪底物液2，检测其化学发光光子强度(rlu)。产生的光子强度与样本中的类风湿因子(igm)浓度成正比。然后根据标准曲线计算该光子强度对应的类风湿因子浓度。以下实施例中，试剂盒中试剂r1、试剂r2和校准品的具体成分和配方分别见表5～表7。表5为试剂r1的成分及具体含量表6为试剂r2的成分及具体含量标记吖啶酯的抗人igm1μg/ml磷酸缓冲体系20mm,ph6.5氯化钠35g/l酪蛋白10g/l牛血清白蛋白10g/l海藻糖20g/l果绿色素0.1g/ltx-1003ml/l丙三醇20ml/l生物防腐剂pc-3003ml/l表7为校准品稀释液的组分类风湿因子30au/ml和100au/ml磷酸缓冲体系30mm,ph7.5氯化钠10g/l牛血清白蛋白100g/l海藻糖67g/l果绿色素0.20g/ltx-1006.8ml/l丙三醇24ml/l生物防腐剂pc-9505.5ml/l实施例1本实施例试剂盒中的试剂r3组分如下表所示：表8为实施例1中试剂r3的组分使用实施例1的试剂r3制备的试剂盒在进行样本检测时，其检测cv值小于3％。具体见下表。表9为对相同样本重复10次的cv值下述对比实施例的试剂盒，试剂r1和试剂r2均相同，仅试剂r3有所区别。对比实施例1本对比实施例试剂盒中的试剂r3组分如下表所示：表10为对比实施例1中试剂r3的组分对比实施例2本对比实施例试剂盒中的试剂r3组分如下表所示：表11为对比实施例2中试剂r3的组分磷酸缓冲体系25mm,ph7.5氯化钠20g/l葡萄糖220g/l酪蛋白2.5g/l果绿色素0.3g/l乙二胺四乙酸二钠30mm吐温-202ml/l生物防腐剂pc-9506ml/l对比实施例3本对比实施例试剂盒中的试剂r3组分如下表所示：表12为对比实施例3中试剂r3的组分磷酸缓冲体系25mm,ph7.5氯化钠20g/l葡萄糖85g/l酪蛋白10g/l果绿色素0.3g/l吐温-202ml/l生物防腐剂pc-9506ml/l实施例2本实施例为对已知浓度样本的检测，检测用试剂r1和试剂r2相同，试剂r3分别为使用实施例1、不使用试剂r3和使用生理盐水代替试剂r3。检测方法同人血清(血浆)中类风湿因子浓度的检测方法。结果如下表所示：表13为对已知样本进行检测的化学发光光子强度从表13中可以看出，加入试剂r3的试剂盒检测的灵敏度高，各浓度间信号倍比高；而不加入试剂r3其检测的灵敏度低和各浓度间信号倍比均低；使用生理盐水代替试剂r3检测灵敏度低，不利于低浓度样本的检测。实施例3本实施例的测试用试剂盒中试剂r1和试剂r2均相同，试剂r3分别为使用实施例1和对比实施例1的试剂r3。然后对已知浓度样本进行检测，检测结果如下表所示：表14为不同的试剂r3配方对已知样本进行检测的光子强度从上表可以看出，虽然使用对比实施例1的试剂盒检测样本的浓度，其背景低，但是使用对比实施例1的试剂盒检测的特异性信号相对于实施例1的试剂盒来说低很多，导致灵敏度比实施例1的低。由此可见，本发明的试剂r3必须在合适成分配合下才能使得试剂盒具备较高的灵敏度。实施例4本实施例的试剂盒分别使用实施例1和对比实施例2的试剂盒。然后对已知浓度样本进行检测，检测结果如下表所示：表15为不同的试剂r3配方对已知样本进行检测的光子强度从表中可以看出，试剂盒中试剂r3的各成分含量如有个别不在适当范围内，均可能会影响检测的准确性，并且检测的灵敏度较低。因此，只有在本发明给出的试剂r3的成分及合适的取值范围内才能使试剂盒检测的准确性好、灵敏度高。实施例5试剂r3对类风湿因子样本的抗干扰能力测试。分别利用实施例1和对比实施例3的试剂盒对临床样本进行检测，然后根据检测得到的光子强度计算得到样本中类风湿因子rf的浓度。当使用实施例1中的试剂盒时，对样本进行加热和不加热处理；检测结果如下表所示：表16为含不同试剂r3的试剂盒检测样本中rf的浓度从表16中可以看出，当使用的试剂盒中，不添加或者添加成分不合适的试剂r3时，均不能避免样本中补体的干扰。仅当使用的试剂盒中具有合适成分组成的试剂r3时，才能避免补体干扰，提高试剂盒的测试特异性和测试准确性。使用本发明试剂盒，样本可无需加热直接进行测试，测试过程简单。实施例6本发明的类风湿因子(igm/igg/iga)的检测试剂盒：该试剂盒中的试剂r1和r3同实施例1，试剂r2中标记物、保护缓冲液同实施例1，标记物为抗人igm抗体、抗人igg抗体、抗人iga抗体按质量比为8:1:1的混合物。利用该实施例的试剂盒进行已知浓度样本的检测其检测结果准确性高，稳定性好。应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。当前第1页12