本发明涉及免疫分析医学,尤其是涉及一种采用竞争法原理设计的利用化学发光免疫分析技术检测ⅲ型前胶原n端肽(n-terminalpropeptideoftypeⅲcollagen,以下简称pⅲnp)的试剂盒。
背景技术:
pⅲnp是ⅲ型前胶原经氨基端内切肽酶的作用脱下的多肽。完整的ⅲ型前胶原肽主要由肝脏通过窦状隙内皮细胞受体介导的内吞作用被清除,而小片段则主要由肾脏排泄清除,故胶原代谢活跃及肝功能损伤时,血清pⅲnp增高,因此pⅲnp被视为肝纤维化生成的血清学指标。pⅲnp在肝纤维化病人血清中水平的上升与组织学上的表现,如炎症和纤维化的活动程度有伴随关系。测定pⅲnp的含量可以有效地区别轻型与中重型慢性肝炎,提示活动性肝纤维化,是反映慢性肝纤维化活动性和程度的指标。长期随访血清pⅲnp含量能判定慢性肝病的预后。对原发性胆汁性肝硬化、慢性迁延性肝炎、慢性活动性肝炎、自身免疫性肝炎进行2~10年随访,无论药物治疗与否,原发性肝硬化者血清pⅲnp总是升高,接受肝移植后,pⅲnp含量降至正常;慢性迁延性肝炎pⅲnp含量在正常上限;发展成肝硬化的慢性活动性肝炎其血清pⅲnp水平持续升高,转入缓解期则血清pⅲnp值正常。唯自身免疫性肝炎例外,血清值一直不高,而陈旧性肝硬化和部分晚期肝硬变、肝萎缩患者血清pⅲnp则不一定增高。综上所述,血清pⅲnp可评估慢性肝病,特别是慢性活动性肝炎纤维化过程,其临床判断预后价值已被公认。
目前对pⅲnp含量的测定方法有:elisa测定方法,该方法一般用于半定量的测定,测定准确度、灵敏度、精密度较差,而且操作比较繁琐,不利于在临床中广泛应用。放射免疫测定方法,该方法因为试剂有放射性污染和试剂有效期短暂(半衰期)等缺陷在逐渐被淘汰。
化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,clia)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析方法,是继放射免疫分析(ria)和酶免疫分析(eia)之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术,具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者,是目前免疫定量分析最理想的方法。
现有基于化学发光免疫分析技术检测pⅲnp的试剂盒均为双抗体夹心法。众所周知,夹心法检测高浓度样本会发生hook效应,导致检测结果假性偏低,引起临床误判。而且双抗体夹心法制备的检测试剂盒至少用到一株鼠单抗,若待检样本中有人抗鼠抗体(humanantimouseantibody,hama),检测结果会受到干扰,导致假阳性或异常偏高。
技术实现要素:
本发明的目的在于提供一种采用竞争法原理设计的利用化学发光免疫分析技术检测ⅲ型前胶原n端肽的试剂盒。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的检测ⅲ型前胶原n端肽的试剂盒,包括结合有ⅲ型前胶原n端肽的固相载体;ⅲ型前胶原n端肽系列校准品;兔抗ⅲ型前胶原n端肽多克隆抗体溶液;酶标记的鼠抗兔igg溶液。
所述固相载体为粒径为0.1-5um的羧基化、氨基化、巯基化或甲苯磺酰基化的磁微粒。
所述ⅲ型前胶原n端肽为天然纯化或重组的ⅲ型前胶原n端肽抗原。
所述系列校准品以0.01m-1m,ph6-ph8的磷酸盐、tris-hcl、hepes或mops为缓冲液,以0.5%-10%的bsa、鱼明胶、casein、新生牛血清为保护蛋白,添加了天然纯化或重组的ⅲ型前胶原n端肽抗原配制而成的浓度分别为0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml的系列校准品。
所述兔抗ⅲ型前胶原n端肽多克隆抗体溶液由0.01m-1m,ph6-ph8的磷酸盐、tris-hcl、hepes或mops为缓冲液,以0.5%-10%的bsa、鱼明胶、casein、新生牛血清为保护蛋白,添加了兔抗ⅲ型前胶原n端肽多克隆抗体配制而成。
所述酶为辣根过氧化物酶。
本发明试剂盒检测时,由于反应的第一步是兔源抗体,而辣根酶标记的鼠抗兔igg抗体是在反应的第二步添加,不会直接接触到样本,因此反应全程均不会受到hama样本的干扰,能够简便、快速、灵敏、准确的检测ⅲ型前胶原n端肽。具体来说:
1、本发明试剂盒检测速度快,40分钟即可出结果。过程稳定、无放射性污染等,在没有磁场存在的情况下,磁性微粒悬浮在液体中,使得抗原抗体反应类似于均相反应;磁性微粒在外加磁场的作用下可方便地分离,洗涤快速;
2、磁性微粒的粒径达到纳米级,使得包被固相接近于液相状态,相对微孔板式,减少了包被,封闭等多个影响精密性的操作步骤,检测的精密性和稳定性得到极大的提升,本发明试剂盒的分析内精密性在6%以内,天间精密性10%以内,批间精密性12%以内;
3、本发明试剂盒灵敏度高,分析灵敏度为1.5ng/ml,优于酶免试剂和放免试剂;
4、本发明试剂盒稳定性好,在2-8℃至少可以稳定存放一年;
5、本发明盒特异性好,和同系列的透明质酸(ha)、层粘连蛋白(ln)、ⅳ型胶原(colⅳ)无交叉,不受hama样本的干扰;
6、本发明试剂盒从设计原理上彻底避免了检测的hook效应。
附图说明
图1是本发明试剂盒的定标曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明,以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明,本发明实施例中所用的检测试剂和检测仪器均为市售产品,采用的检测方法也为本领域常规方法。
实施例1制备检测ⅲ型前胶原n端肽的试剂盒
1、制备磁微粒
将粒径为1nm的氨基化磁微粒原液充分混匀,取出适量进行磁分离,去除上清,加入0.05m,ph7.0的硼酸-硼砂缓冲液进行重悬清洗,重复2次;加入交联剂戊二醛10ul对磁微粒表面氨基进行活化;加入天然纯化或重组的ⅲ型前胶原n端肽抗原2ul进行偶联,室温震荡反应10h,磁分离,去除上清;用添加了2%鱼明胶的0.05m,ph7.0的磷酸盐缓冲液做为封保液进行封闭,放置2-8℃保存。
2、制备抗体溶液
在0.02m,ph7.0的磷酸盐中加入0.5%的bsa配制成稀释液1l,添加兔抗ⅲ型前胶原n端肽多克隆抗体5ul,混合均匀,放置2-8℃保存。
3、制备酶结合物
在0.02m,ph7.0的磷酸盐中加入0.5%的bsa配制成稀释液1l,添加辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔igg10ul,混合均匀,放置2-8℃保存。
4、制备系列校准品
在0.02m,ph7.0的磷酸盐中加入0.5%的bsa配制成稀释液1l,分成5等份,分别添加天然纯化或重组的ⅲ型前胶原n端肽抗原配制成0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml的系列浓度,放置2-8℃保存。
实施例2本发明试剂盒的检测方法
采用安图生物工程股份有限公司所生产的全自动磁微粒化学发光仪(autolumoa2000plus)进行检测:
使用无添加普通管/分离胶管/促凝管采集全血5ml,于37℃静置30min,后用4000转/min的转速离心10min,取离心后的血清做为检测样本。样本收集后在室温放置不可超过8小时,如果不在8小时内检测需将样本放置在2~8℃的冰箱中,若需48小时以上保存或运输,则应冻存于-20℃以下,避免反复冻融。使用前恢复到室温,轻轻摇动混匀。
1)在反应容器(以下简称“孔”)中分别加入校准品(用于定标)或样本,加样量均为50µl/孔。
2)每孔分别加入磁微粒混悬液20µl。
3)每孔分别加入抗体溶液50µl。
4)混匀后37℃温育15分钟。
5)清洗液洗涤5次。
6)每孔分别加入酶结合物100µl。
7)混匀后37℃温育17分钟。
8)清洗液洗涤5次。
9)每孔加入发光底物a液和发光底物b液各50µl。
10)混匀后1~5分钟检测发光强度。
11)结果计算:
首先采用四参数(lin-log)拟合方式,以校准品浓度值为x轴,以校准品发光强度值的log值为y轴建立定标曲线,拟合的曲线如图1所示。
根据待测样品的发光强度值回算相应的浓度值。仪器操作系统可通过存储的定标曲线以及样本测试得到的信号值自动计算样本测试结果。
实施例3本发明试剂盒的性能检测
1、分析灵敏度
用0值校准品做为灵敏度控制品,进行10孔测定,计算其发光值的平均数(m)与标准差(sd),根据剂量-反应曲线回算m-2sd的浓度值,所得结果即为分析灵敏度。检测结果见下表1。
表1
从表1数据可以看出:检测出的分析灵敏度远低于1.5ng/ml,符合试剂盒的设计要求。
2、天间精密性
用同一个批号试剂盒分别检测高、低两种室内质控品(q1、q2),要求重复测定4天,每天至少5次重复,根据四参数(lin-log)拟合标准曲线计算测量结果,再计算至少20次测量结果的平均值m和标准差sd,根据公式cv=sd/m*100%得出变异系数cv。检测结果见下表2。
表2
从表2数据可以看出:天间精密性均在10%以内。
3、特异性
用校准品稀释液分别配制浓度为1000ng/ml透明质酸(ha),1000ng/ml层粘连蛋白(ln),1000ng/mlⅳ型胶原(cⅳ)作为特异性质控品。用一个批次试剂盒,复孔测定特异性质控品,将发光值代入剂量-反应曲线回算浓度值,计算浓度值的平均值。检测结果见表3。
表3
从表3数据可以看出:本试剂盒和同系列的透明质酸(ha),层粘连蛋白(ln),ⅳ型胶原(cⅳ)均没有交叉。
4、参考值
采用百分位数法确定参考值:样本浓度值<15ng/ml判为阴性;浓度值≥15ng/ml判为阳性。
建议各实验室也可以根据自身实际条件及接触人群建立正常参考值。