一种检测马兜铃酸A荧光传感器的制备方法与流程

本发明属于荧光传感器领域，具体涉及了一种检测马兜铃酸a荧光传感器的制备方法。

背景技术：

肾毒性马兜铃酸是一种硝基菲啰啉羧酸衍生物，其来源于马兜铃科植物，例如马兜铃属和细辛属，大多数成分已被证实是肾毒性、致癌和诱变。其中，马兜铃酸a(aas)毒性最大，并且引起了人们广泛关注。这些含aas的草药已被广泛用作治疗肿瘤、蛇咬伤、小痘、风湿病和肺炎，直到aas被证实是严重危害人体肾毒素的致癌物和致突变物。虽然，在世界范围内已经禁止使用含有aas的草药。但这些草药目前仍然通过互联网销售，并且滥用含aas的草药现象也屡禁不止。因此，高效准确的检测出马兜铃酸a对肾脏疾病的诊断和治疗具有重大的意义。

目前检测含aas草药中的aas及其类似物，主要有薄层色谱(tlc)、高效液相色谱和紫外检测(hplc-uv)、高效液相色谱质谱(hplc-ms)、毛细管电泳与电化学检测(ce-ecd)和酶联免疫吸附试验(elisa)；但是现有这些检测方法存在检测步骤复杂，检测速度慢及对马兜铃酸a检出限较高的问题。

技术实现要素：

本发明旨在解决现有马兜铃酸a检测方法过于复杂、检测速度慢及对马兜铃酸a识别性较低的问题，而提供一种检测马兜铃酸a荧光传感器的制备方法。

本发明首先合成碳量子点(cqds)，然后用卵白蛋白稳定金纳米簇，构建荧光传感cqds-ova@auncs；使用时，利用随着马兜铃酸a(aas)的浓度逐渐增加，荧光传感器的荧光逐渐猝灭，根据荧光强度变化与马兜铃酸a加入浓度的线性关系来定量检测马兜铃酸a。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明荧光传感器的制备方法如下：

(1)将活性炭与混酸混合后，置于80-90℃下回流反应，冷却至室温，在反应产物中添加混酸体积2-3倍的水，然后用氢氧化钠调节ph至12-14后放入水热反应釜中反应13-15小时，再调节ph至中性，最后将中性产物用超纯水透析2-3天，将透析袋内产物干燥后得到碳量子点，其中活性炭与混酸的质量体积比mg:ml为8-12:1；

(2)在浓度为8-12mg/ml卵白蛋白(ova)液体中加入氯金酸溶液，超声5-10min后搅拌15-30min；用0.5-1mol/l氢氧化钠调ph至12-13；然后在30-45℃水浴反应10-12小时，反应产物干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇(ova@aunps)，其中卵白蛋白液体与氯金酸溶液的体积比为4-6:1；

(3)将碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇分别用超纯水溶解后，混合均匀，即制得检测马兜铃酸a荧光传感器(cqds-ova@auncs)，其中碳量子点和卵白蛋白稳定的金纳米簇的质量比为1300-1500:1。

所述混酸为是浓硫酸和浓硝酸按体积比2-3.5:1组合而得，浓硫酸和浓硝酸均为市购产品。

所述步骤(1)中氢氧化钠浓度为5～6mol/l；用1mol/l的硫酸调节ph至中性。

所述制备碳量子点时，在水热反应釜中的反应温度为150-170℃。

所述氯金酸溶液浓度为8-12mmol/l。

本发明马兜铃酸a荧光传感器灵敏度高；检测时，以碳量子点为主体，利用ova@auncs增强碳量子点荧光，然后加入马兜铃酸a，随着aas的浓度逐渐增加，荧光传感器的荧光逐渐猝灭，根据荧光强度变化与马兜铃酸a加入浓度的线性关系来定量检测马兜铃酸a；以cqds-ova@auncs作为荧光传感平台，利用荧光猝灭的方式来定量检测马兜铃酸a；这种基于cqds-ova@auncs的复合传感界面，比普通的复合传感界面，灵敏度更高、稳定性更好；本发明方法在常温常压下进行、简单、快速、可控性高，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1的碳量子点(cqds)的透射电镜图(5nm)；

图2为本发明实施例1的碳量子点(cqds)的透射电镜图(10nm)；

图3为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(ova@auncs)的透射电镜图(5nm)；

图4为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(ova@auncs)的透射电镜图(10nm)；

图5为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(ova@auncs)和碳量子点(cqds)混合的透射电镜图(5nm)；

图6为本发明实施例1的卵白蛋白稳定的金纳米簇(ova@auncs)和碳量子点(cqds)混合的透射电镜图(20nm)；

图7为基于cqds-ova@auncs构建的荧光传感器检测马兜铃酸a的示意图；

图8为ova、cqds、ova@aunc的红外谱图；

图9为本发明实施例3ova@auncs对cqds的荧光增强图，横坐标为ova@auncs浓度，纵坐标为荧光强度；

图10为本发明实施例4中ova@auncs对cqds的荧光增强(mef)机理验证图；

图11为本发明实施例5中cqds-ova@auncs体系荧光强度猝灭的程度；

图12为本发明实施例5中cqds-ova@auncs体系荧光强度与马兜铃酸a浓度的线性关系示意图；

图13为马兜铃酸a对cqds-ova@auncs因荧光内滤作用(ief)而猝灭的机理验证图；

图14为cqds-ova@auncs传感器对aas识别的抗干扰性能。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不限于所述内容，实施例中如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯；使用试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂；所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式；所述的荧光光谱测定条件均为发射波长467-700nm，激发波长为447nm，狭缝宽度为10nm。

实施例1：本检测马兜铃酸a荧光传感器的制备方法如下：

(1)将250mg活性炭粉末、22.5ml浓硫酸、7.5ml浓硝酸依次加入到圆底烧瓶中80℃下回流5小时，冷却至室温后，在反应产物中添加混酸体积2倍的加超纯水，用6mol/l氢氧化钠调节ph至13后放入水热反应釜中，在160℃下反应14小时后，用1mol/l的硫酸调节ph至7.0，将中性产物用1000分子量的透析袋透析2天，将透析袋内产物冷冻干燥得到碳量子点(cqds)，碳量子点的透射电镜图(图1、2)；

(2)将5ml、10mg/ml卵白蛋白(ova)液体以及1ml、10mmol/l氯金酸溶液放入烧杯中，超声5min后室温搅拌15min，用1mol/lnaoh调节溶液ph至13后，在37℃水浴条件下搅拌12小时，反应产物冷冻干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇(ova@auncs)，卵白蛋白稳定的金纳米簇的透射电镜图(图3、4)；

(3)将2ml、0.2mg/ml的cqds水溶液和30μl、0.01mg/ml的ova@auncs水溶液混匀后得到cqds-ova@auncs；冷冻干燥用于cqds-ova@auncs的透射电镜，结果见图5、6。

实施例2：本检测马兜铃酸a荧光传感器的制备方法如下：

(1)将250mg活性炭粉末、19.4ml浓硫酸、5.6ml浓硝酸依次加入到圆底烧瓶中90℃回流6小时，冷却至室温后，在反应产物中添加混酸体积3倍的加超纯水，用5mol/l氢氧化钠调节溶液ph至12后放入水热反应釜中，在170℃反应13小时后，用1mol/l硫酸调节ph至7.0，将中性产物用1000分子量的透析袋透析3天，将透析袋内产物冷冻干燥得到碳量子点粉末(cqds)；

(2)将20ml、8mg/ml卵白蛋白(ova)溶液以及5ml、8mmol/l氯金酸溶液放入烧杯中，超声10min后室温搅拌25min，用0.5mol/lnaoh调节溶液ph至12后，在43℃下搅拌10小时，反应产物冷冻干燥后得到卵白蛋白稳定的金纳米簇粉末(ova@auncs)；

(3)将10ml、0.21mg/ml的cqds水溶液和150μl、0.01mg/ml的ova@auncs水溶液混合后冷冻干燥，得到cqds-ova@auncs粉末(图7为cqds-ova@auncs荧光传感器的制备及使用原理)；图8为ova、cqds、ova@aunc的红外谱图，结果显示3420cm^-1为o-h键的伸缩振动，3440cm^-1为n-h键的平面变角震动；2930cm^-1为ch2的伸缩振动，1615cm^-1为o＝c-o的伸缩振动，1590cm^-1为酰胺键的i带峰；1883cm^-1为c-h的弯曲震动，1374cm^-1为c-n的伸缩振动，1143cm^-1为s-o的伸缩振动；1445cm^-1为c＝c的拉伸震动。

实施例3：ova@auncs增强cqds荧光的实验

向2ml0.2mg/mlcqds溶液中逐步加入10μl0.01mg/mlova@auncs溶液，每次加10μl，可见cqds溶液的荧光强度在加入至30μlova@auncs溶液时达到最高值，之后逐渐降低(图9)。

实施例4：验证ova@auncs增强cqds荧光的实验

向紫外比色皿中，加入1ml超纯水后，再加入1ml、1mg/ml的cqds溶液，用紫外分光光度计测量其对紫外光的吸收值；同样，向紫外比色皿中，加入2ml、1mg/ml的ova@auncs溶液，用紫外分光光度计测量其对紫外光的吸收值；可以看到，cqds和ova@auncs溶液的紫外吸收值在225nm处的峰有重叠部分；即可证明cqds和ova@auncs之间有金属增强cqds荧光的作用(mef)(图10)。

实施例5：aas对cqds-ova@auncs荧光传感器荧光的淬灭机理的验证

在紫外比色皿中加入1.96ml超纯水，然后取40μl25μmol/l的aas，测定其紫外吸收值；在荧光比色皿中，取1.875ml超纯水，然后取125μl实施例1的cqds-ova@auncs液体，分别测定cqds-ova@auncs液体的荧光发射光谱和荧光激发光谱；图13中a为马兜铃酸a紫外吸收谱图，b为cqds-ova@auncs的荧光激发谱图，c为cqds-ova@auncs的荧光发射谱图；由图13可以看出马兜铃酸a的紫外吸收光谱与cqds-ova@auncs的荧光激发光谱有部分的重叠，所以可以将马兜铃酸a猝灭cqds-ova@auncs的荧光的作用，归为荧光内滤效应(ief)；

由于马兜铃酸a(aas)溶液能通过荧光内滤作用猝灭cqds-ova@auncs传感器的荧光，导致cqds-ova@auncs传感器的荧光强度降低；因此在实施例1制得的cqds-ova@auncs传感器液体中加入马兜铃酸a(aas)，直至荧光强度猝灭达到饱和(图11)；获得荧光强度与马兜铃酸a浓度的线性关系(图12)，用于后期测定样品中的aas；在本实施例中检测马兜铃酸a的线性范围为0.002-1000μmol/l，检出限为50nmol/l，线性回归方程为：(f0－f)/f0＝9.81944×10^-4c(μm)+4.66474、(f0－f)/f0＝1.47831c(μm)+0.05927和(f0－f)/f0＝7.01326×10^-4c(μm)+0.34625，相关系数为0.99217、0.96226、0.98445(图8)。

实施例6：cqds-ova@auncs传感器对aas识别的抗干扰性能

选取马兜铃酸a类似物马兜铃对酮(arist)进行干扰试验，同时也选取一些常规干扰物进行干扰试验，如kbr、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、kcl、na3po4、ch3coona、k2co3；将上述干扰物分别与马兜铃酸a混合并加入到实施例1的cqds-ova@auncs溶液中，测定其荧光猝灭程度，作出其相对应的荧光强度(f-f0)/f0的图像，见图14，从图中看出，对比同时添加干扰物和马兜铃酸a的溶液检测结果与单独添加马兜铃酸a的检测结果，可以说明cqds-ova@auncs传感器对aas识别具有良好的抗干扰性能。

实施例7：cqds-ova@auncs传感器的应用

以人工血清为实际样品，采用加标回收的方式进行实际样品中马兜铃酸a含量的检测；取稀释50倍的血清样品500μl，在血清样品中分别各加入500μl，0.02μmol/l、20μmol/l、100μmol/l的马兜铃酸a溶液，配制得到加标量分别为0.01μmol/l、10μmol/l、50μmol/l、的待测样品，将待测样品中加入到2ml、实施例1的cqds-ova@auncs溶液中，测定每个样品的荧光吸收值，每个样品平行测定3次，将每个样品的荧光吸收值代入实施例5获得的荧光强度恢复与马兜铃酸a浓度的线性关系中，计算出每个样品的实际测量浓度，并进一步计算回收率及标准偏差，结果见表1，实验结果显示回收率在94％-99.8％之间，相对标准偏差为0.67-4.0％之间，说明本发明感器可用于检测实际血清样品中的马兜铃酸a含量，在生物医学和临床检测中有着很大的应用潜力。

表1血清实际样品中马兜铃酸a加标回收实验结果