一种复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸薄层鉴别检测方法与流程

本发明属于医药技术分析领域，具体涉及一种复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸薄层鉴别检测方法。

背景技术：

复方金银花颗粒是由金银花、连翘和黄芩3味中药材经现代提取其有效成分，加入适宜的蔗糖精制而成的中药制剂。其功能主治为清热解毒和凉血消肿，主要用于风热感冒、咽炎、扁桃体炎、目痛、牙痛及痈肿疮疖。现为临床治疗风热感冒的常用药，其疗效不容置疑，但对于该产品的质量控制，现行国家标准的黄芩苷及绿原酸薄层鉴别方法专属性差，斑点不清晰，不能有效控制产品质量，从而影响产品的生产和质量保证。

技术实现要素：

为了克服上述标准中的缺陷，本发明的目的在于提供一种复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸薄层鉴别检测方法，该方法能够实现对复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸进行专属性薄层鉴别，排除其他物质的干扰且分离度佳，重现性好。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸薄层鉴别检测方法，包括以下步骤：

步骤1，配制供试品溶液、阴性对照品溶液、黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液；配制展开剂和显色剂；展开剂包括乙酸乙酯、甲醇和乙酸，乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为(1～7):(2～5):(7～15)；

步骤2，薄层层析：以聚酰胺薄膜作为薄层板，将供试品溶液、阴性对照品溶液、黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液均点样至薄层板上，将点好样品的薄层板放入展开剂饱和的展开缸中进行展开；然后将薄层板取出，晾干；

步骤3，检视，分别在紫外和日光下检视绿原酸、黄芩苷。

优选的，步骤1中，供试品溶液的配制方法为：将复方金银花颗粒研细，加入甲醇，超声，过滤，取滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，定容，得到供试品溶液。

优选的，步骤1中，黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液的配制方法为：取黄芩苷和绿原酸对照品，分别加入甲醇，超声溶解，定容，分别得到黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液。

进一步的，超声时间为10～30分钟。

优选的，步骤1中，显色剂为1％～2％的三氯化铁乙醇溶液。

优选的，步骤2中，供试品溶液点样量为1～2μl。

优选的，步骤3中，检视具体为：365nm紫外光下检视绿原酸，将晾干的薄层板均匀喷洒显色剂，放置，日光下检视黄芩苷。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

复方金银花颗粒中三味药材金银花、黄芩、连翘含有的主要成分咖啡酰奎尼酸类(绿原酸、新绿原酸、异绿原酸等)、黄酮类(黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素等)、连翘酚、连翘苷等均含有羟基，可和聚酰胺薄膜中酰胺键的羰基形成氢键，因形成氢键能力不同吸附能力不同而分离。在层析过程中，展开剂可与被分离物质竞争性地与聚酰胺薄膜中酰胺键的羰基形成氢键，要选择展开剂使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间分配系数有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，形成不同顺序分离。所以本发明通过采用极性较小的乙酸乙酯、极性较大的甲醇和乙酸按照一定体积比配制的展开剂，并以聚酰胺薄膜作为薄层板，能够实现对复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸进行专属性薄层鉴别，专属性强，可排除阴性干扰，斑点清晰、分离度高，重现性好。本发明采用的展开剂，直接配制使用，不用静置取上层溶液，简化了展开剂的配制步骤，同时节约了时间，提高了效率。

进一步的，采用超声法配制样品，简化了实验步骤，缩短了样品制备时间。最后定量溶解，可精确控制点样量，点样量变小，易于操作。

进一步的，在用聚酰胺薄膜薄层鉴别，黄芩苷在紫外下颜色与薄层板颜色相似度高，不容易清晰分辨，而本发明在喷显色剂后日光下检视黄芩苷清晰易辨。

附图说明

图1以体积比为8:1:1的乙酸乙酯、甲醇和甲酸的混合物为展开剂。

图2以体积比为10:3:1:2的甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸的混合物为展开剂。

图3以体积比为4:3:10的乙酸乙酯、甲醇和乙酸的混合物为展开剂。

图4为不同点样体积薄层层析效果。

图5为最佳条件下薄层层析效果。

图6为专属性考察薄层层析效果。

图7薄层板为上海金穗生物科技有限公司的薄层层析效果。

图8薄层板为浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂薄层层析效果。

图9为5℃展开结果。

图10为30℃展开结果。

图11为湿度32％条件下展开结果。

图12为湿度72％条件下展开结果。

图13为实施例1展开结果。

图14为实施例2展开结果。

图1、2、3中点样顺序如下：1、2、3均为供试品溶液，4为阴性对照品溶液，5为黄芩苷对照品溶液，6为绿原酸对照品溶液；

图4中点样顺序如下：1、2、3、4是点样体积分别为0.5μl、1μl、2μl和3μl的供试品溶液，5为1μl阴性对照品溶液，6为1μl黄芩苷对照品溶液，7为1μl绿原酸对照品溶液；

图5、6、7、8、9、10、11、12、13、14中点样顺序如下：1、2、3均为1μl的供试品溶液，4为1μl阴性对照品溶液，5为1μl黄芩苷对照品溶液，6为1μl绿原酸对照品溶液。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明所述的复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸薄层鉴别检测方法，包括以下步骤：

1、配制复方金银花颗粒黄芩苷和绿原酸薄层鉴别供试品溶液

采用甲醇超声处理的方法，获得复方金银花颗粒黄芩苷和绿原酸薄层鉴别测定供试品溶液。

2、配制复方金银花颗粒黄芩苷和绿原酸薄层鉴别阴性对照品溶液

按照复方金银花颗粒处方制备黄芩和金银花阴性样品，再按照步骤1的方法制备获得阴性对照品溶液。

3、配制复方金银花颗粒黄芩苷和绿原酸薄层鉴别对照品溶液

采用甲醇超声处理的方法，获得黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液。

4、薄层板

三种薄层板，硅胶g薄层板、4％醋酸钠硅胶g板和聚酰胺薄膜(薄层层析)。

5、展开剂的配制

分别配制3种展开剂，展开剂1包括甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸，甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸的体积比为10:3:1:2；展开剂2包括乙酸乙酯、甲醇和甲酸，乙酸乙酯、甲醇和甲酸的体积比为8:1:1；展开剂3包括乙酸乙酯、甲醇和乙酸，乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为4:3:10；并对3种展开系统进行比较。

6、显色剂的配制

称取三氯化铁2g于100ml容量瓶中，加95％的乙醇少量溶解后，继续定容至100ml，备用。通过实施例确定，三氯化铁浓度可以为1-2％，均可达到预定效果。

7、复方金银花颗粒中黄芩苷和绿原酸的薄层鉴别检测

用定量毛细管分别量取步骤1、2、3制得的复方金银花颗供试品溶液、阴性对照品溶液、黄芩苷对照品溶液和绿原酸对照品溶液点于薄层板上，放入展开剂饱和的展开缸中展开至薄层板2/3处以上，取出，晾干，分别置于规定条件下检视。

点样时，斑点为圆点状，距薄层板底边10～15mm，距两左右边缘15mm，圆点状直径2～3mm，点样量1～2μl。

展开时，展开剂先饱和15～30分钟，薄层板浸入展开剂深度要求展开剂最初的前沿线距原点5mm。

检视时，紫外365下检视绿原酸，将自然晾干的薄层板均匀喷洒上显色剂，放置后，于日光下检视。

8、鉴别条件优化

1)供试品处理方法选择

分别考察了提取溶剂甲醇、75％甲醇、乙醇和60％乙醇，结果表明甲醇提取效果好，考察了不同的提取方法超声处理30分钟，加热回流30分钟，以提取效率高，方法简便的原则，选择超声处理。通过实施例确定，超声时间为10-30分钟均可达到预定效果。

2)薄层板的选择

分别将样品用定量毛细管点于硅胶g薄层板、4％醋酸钠硅胶g板、聚酰胺薄膜(薄层层析)上，展开，检视，对比展开效果，最终选择聚酰胺薄膜(薄层层析)。

3)展开剂的选择

展开剂1：甲苯、乙酸乙酯、甲醇和甲酸比例为10:3:1:2；展开剂2：乙酸乙酯、甲醇和甲酸比例为8:1:1；展开剂3：乙酸乙酯、甲醇和乙酸比例为4:3:10；将样品点于聚酰胺薄膜薄层板，分别采用展开剂1、展开剂2和展开剂3进行展开，展开剂1、展开剂2和展开剂3的展开效果分别如图1、2、3所示，图中1、2、3均为供试品溶液，4为阴性对照品溶液，5为黄芩苷对照品溶液，6为绿原酸对照品溶液，分别对其展开效果进行评价选择、优化，确定最佳展开剂为展开剂3。通过实施例确定，展开剂中乙酸乙酯、甲醇和乙酸的体积比为(1～7):(2～5):(7～15)。

4)点样体积的选择

分别取供试品溶液0.5μl、1μl、2μl和3μl，及黄芩苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液和阴性对照品溶液各1μl点于聚酰胺薄膜薄层板上，如图4。对比层析效果，图中，1、2、3和4是点样体积分别为0.5μl、1μl、2μl和3μl的供试品溶液，5是阴性对照品溶液1μl，6是黄芩苷对照品溶液1μl，7是绿原酸对照品溶液1μl，确定最佳点样体积为1～2μl。

5)确定最佳薄层层析条件

根据以上各因素的优化结果，确定黄芩苷和绿原酸的最佳薄层鉴别条件为供试品加甲醇超声处理30分钟，薄层板选用聚酰胺薄膜，展开剂选用展开剂3：乙酸乙酯、甲醇和乙酸比例为4:3:10，点样体积为1～2μl。如图5。

9、方法学验证

本发明复方金银花颗粒黄芩苷、绿原酸定性鉴别，采用薄层色谱法，依据处方中黄芩、金银花、连翘三味药材所含主要成分的情况，建立检测色谱条件；对建立的色谱条件进行系统的方法学验证研究，保证所建立色谱条件的专属性和耐用性。

1)专属性考察：

取复方金银花颗粒批号180623、180623-1、180624样品按本发明方法分别制备供试品溶液、黄芩苷对照品溶液、绿原酸对照品溶液及阴性对照样品溶液，并点样于同一聚酰胺薄膜(薄层层析)，结果见图6，其中，1、2和3分别为复方金银花颗粒批号180623、180623-1和180624供试品溶液各1μl，4为阴性对照品溶液1μl，5为黄芩苷对照品溶液1μl，6为绿原酸对照品溶液1μl；置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与绿原酸对照品相应位置显相同颜色的荧光斑点。再喷以2％三氯化铁乙醇溶液，置日光下检视，供试品色谱中，在与黄芩苷对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点且无阴性干扰。

2)耐用性考察

①薄层板：采用2个不同厂家生产的聚酰胺薄膜(薄层层析)，分别为上海金穗生物科技有限公司、浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂。图7为上海金穗生物科技有限公司的生产的聚酰胺薄膜、图8为浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂生产的聚酰胺薄膜。

②温度考察：将点样后的薄层板分别置5℃(冰箱)和30℃饱和30分钟后，展开，考察主斑点的分离度，图9为5℃展开结果，图10为30℃展开结果。

③湿度考察：在展开缸一侧分别加入68％和27.5％的硫酸溶液控制相对湿度分别32％和72％，将点样后的薄层板放入另一侧槽中，密闭15-30分钟，立即将薄层板移置于盛有展开剂的展开缸中，展开，考察主斑点的分离度。32％湿度条件下展开结果见图11，72％湿度条件下展开结果见图12(操作间温度22℃)。

耐用性考察结果显示，不同厂家生产的聚酰胺薄膜对鉴定检测结果没有显著影响，温度和湿度对鉴定检测结果也没有显著影响，说明本发明鉴定检测方法具有很好的耐用性。

具体实施例如下。

本发明实施例所用复方金银花颗粒为“金花复方金银花颗粒”，国药准字z20053982。

实施例1：

本发明公开的复方金银花颗粒黄芩苷、绿原酸薄层鉴别检测方法测定包括下述步骤：

1、供试品溶液的制备：

取样品研细，称取2.5g，加入甲醇50ml，超声处理10分钟，过滤，取滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml溶解，即完成供试品溶液的制备。

2、阴性对照品溶液制备

步骤a：按照5000g处方，称取连翘(不含金银花、黄芩的处方)药材750g，加入12倍量的水提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩至相对密度1.26(60～70℃)时，称重，加入3倍量的乙醇，边加边搅拌，静置24小时，回收乙醇，浓缩至1.26(60～70℃)稠膏状，加入蔗糖粉，混匀，制成颗粒，干燥即得；

步骤b：取步骤a中制得的颗粒研细，称取2.5g，加入甲醇50ml，超声处理10分钟，过滤，取滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml溶解，即完成阴性对照品溶液的制备。

3、对照品溶液制备

分别精密称取黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院)10.88mg、绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院)10.09mg于25ml容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解，再定容至25ml，配制成含对照品0.4mg/ml的溶液。

4展开剂的配制

按照乙酸乙酯、甲醇和乙酸体积比为4:3:10的比例，分别量取乙酸乙酯4ml、甲醇3ml、乙酸10ml于展开缸中，摇匀，饱和15分钟。

5、显色剂配制

称取三氯化铁1g于100ml容量瓶中，加95％的乙醇少量溶解后，继续定容至100ml，配制成1％的三氯化铁乙醇溶液。

6、薄层层析

1)点样

选用聚酰胺薄膜(薄层层析)10*20cm，用定量毛细管点样，点样直径2～3mm，对照品点样量为1μl，供试品点样量为1μl。

2)展开

将点好样品的薄层板放入展开剂饱和15分钟的展开缸中，薄层板浸入展开剂深度要求为展开剂最初的前沿线距原点5mm左右。展距为薄层板的2/3处左右，取出，自然晾干。紫外365下检视绿原酸。

3)显色

将晾干的薄层板均匀喷洒1％的三氯化铁乙醇溶液，放置，日光下检视黄芩苷。

4)检视条件

紫外365下检视绿原酸，日光下检视黄芩苷，结果如图13。

5)结果判定

供试品色谱中，在与绿原酸对照品位置显相同颜色的荧光斑点，在与黄芩苷对照品位置显相同颜色的斑点。

实施例2

本发明公开的复方金银花颗粒黄芩苷、绿原酸薄层鉴别检测方法测定包括下述步骤：

1、供试品溶液的制备：

取样品研细，称取2.5g，加入甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，取滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml溶解，即完成供试品溶液的制备。

2、阴性对照品溶液制备

步骤a：按照5000g处方，称取连翘(不含金银花、黄芩的处方)药材750g，加入12倍量的水提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩至相对密度1.26(60～70℃)时，称重，加入3倍量的乙醇，边加边搅拌，静置24小时，回收乙醇，浓缩至1.26(60～70℃)稠膏状，加入蔗糖粉，混匀，制成颗粒，干燥即得；

步骤b：取步骤a中制得的颗粒研细，称取2.5g，加入甲醇50ml，超声处理30分钟，过滤，取滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml溶解，即完成阴性对照品溶液的制备。

3、对照品溶液制备

分别精密称取黄芩苷对照品10.88mg、绿原酸对照品10.09mg于25ml容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解，再定容至25ml，配制成含对照品0.4mg/ml的溶液。

4展开剂的配制

按照乙酸乙酯、甲醇和乙酸体积比为7:2:7的比例，分别量取乙酸乙酯7ml、甲醇2ml、乙酸7ml于展开缸中，摇匀，饱和15分钟。

5、显色剂配制

称取三氯化铁2g于100ml容量瓶中，加95％的乙醇少量溶解后，继续定容至100ml，配制成2％的三氯化铁乙醇溶液。

6、薄层层析

1)点样

选用聚酰胺薄膜(薄层层析)10*20cm，用定量毛细管点样，点样直径2～3mm，对照品点样量为1μl，供试品点样量为2μl。

2)展开

将点好样品的薄层板放入展开剂饱和15分钟的展开缸中，薄层板浸入展开剂深度要求为展开剂最初的前沿线距原点5mm左右。展距为薄层板的2/3处左右，取出，自然晾干。紫外365下检视绿原酸。

3)显色

将晾干的薄层板均匀喷洒2％的三氯化铁乙醇溶液，放置，日光下检视黄芩苷。

4)检视条件

紫外365下检视绿原酸，日光下检视黄芩苷，结果如图14。

5)结果判定

供试品色谱中，在与绿原酸对照品位置显相同颜色的荧光斑点，在与黄芩苷对照品位置显相同颜色的斑点。

实施例3：

本发明公开的复方金银花颗粒黄芩苷、绿原酸薄层鉴别检测方法测定包括下述步骤：

1、供试品溶液的制备：

取样品研细，称取2.5g，加入甲醇50ml，超声处理20分钟，过滤，取滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml溶解，即完成供试品溶液的制备。

2、阴性对照品溶液制备

步骤a：按照5000g处方，称取连翘(不含金银花、黄芩的处方)药材750g，加入12倍量的水提取2次，每次1小时，合并提取液，浓缩至相对密度1.26(60～70℃)时，称重，加入3倍量的乙醇，边加边搅拌，静置24小时，回收乙醇，浓缩至1.26(60～70℃)稠膏状，加入蔗糖粉，混匀，制成颗粒，干燥即得；

步骤b：取步骤a中制得的颗粒研细，称取2.5g，加入甲醇50ml，超声处理20分钟，过滤，取滤液蒸干，残渣加入甲醇2ml溶解，即完成阴性对照品溶液的制备。

3、对照品溶液制备

分别精密称取黄芩苷对照品(中国食品药品检定研究院)10.88mg、绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院)10.09mg于25ml容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解，再定容至25ml，配制成含对照品0.4mg/ml的溶液。

4展开剂的配制

按照乙酸乙酯、甲醇和乙酸体积比为7:5:15的比例，分别量取乙酸乙酯7ml、甲醇5ml、乙酸15ml于展开缸中，摇匀，饱和15分钟。

5、显色剂配制

称取三氯化铁1.5g于100ml容量瓶中，加95％的乙醇少量溶解后，继续定容至100ml，配制成1.5％的三氯化铁乙醇溶液。

6、薄层层析

1)点样

选用聚酰胺薄膜(薄层层析)10*20cm，用定量毛细管点样，点样直径2～3mm，对照品点样量为1μl，供试品点样量为1.5μl。

2)展开

将点好样品的薄层板放入展开剂饱和15分钟的展开缸中，薄层板浸入展开剂深度要求为展开剂最初的前沿线距原点5mm左右。展距为薄层板的2/3处左右，取出，自然晾干。紫外365下检视绿原酸。

3)显色

将晾干的薄层板均匀喷洒1.5％的三氯化铁乙醇溶液，放置，日光下检视黄芩苷。

4)检视条件

紫外365下检视绿原酸，日光下检视黄芩苷。

5)结果判定

供试品色谱中，在与绿原酸对照品位置显相同颜色的荧光斑点，在与黄芩苷对照品位置显相同颜色的斑点。

本发明通过筛选展开剂组成、展开剂比例、点样量等措施，确定了最优检测条件；采用该条件检测，薄层鉴别图谱中，黄芩苷、绿原酸斑点清晰，分离度高，提高了检测准确度。通过系统的验证研究确定了拟定检测条件的专属性、耐用性(不同品牌的薄层板、温湿度)，解决了原标准中斑点不清晰、分离度差的问题。本发明适用于复方金银花颗粒黄芩苷和绿原酸薄层鉴别的检测，更有效的控制产品质量，保证临床疗效。