人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法与流程

本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种高准确度、高重现性、高灵敏度、高专属性、高效率、高通量、低成本、操作简便快速的人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术：

儿茶酚胺即有邻苯二酚(即儿茶酚)的胺类化合物，包括多巴胺、去甲肾上腺素，肾上腺素及它们的衍生物。去甲肾上腺素和肾上腺素既是肾上腺髓质所分泌的激素，又是交感神经和中枢神经系统中去甲肾上腺素能纤维的神经介质。去甲肾上腺素在中枢神经系统内分布广泛，含量较多，而肾上腺素含量则较少。多巴胺主要集中在锥体外系部位，也是一种神经介质。以上儿茶酚胺类物质都是重要的典型肾上腺素受体激动剂。儿茶酚胺类物质在体内调节基本生理功能，传递生理信号，是正常生理过程中重要的信号介质，同时在病理过程中其含量也会出现明显的变化。因此它们可以用于临床辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病，其代谢物甲氧基肾上腺素(mn)以及甲氧基去甲肾上腺素(nmn)对诊断嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤有极高的敏感度与准确度，是内分泌指南推荐的首选检测指标。血检和尿检是儿茶酚胺临床常规检测方式，其中以尿检结果更为精确，通过测定24小时尿中儿茶酚胺的水平可反映交感神经和肾上腺髓质的功能，且有昼夜规律性变化。

目前常用的测定儿茶酚胺及其代谢物的方法主要有放射酶学法、毛细管电泳法、荧光法以及高效液相色谱法等，其中检测人尿液中儿茶酚胺主要采用高效液相色谱电化学方法。但是，现有方法存在以下缺点：

1、放射酶学法试剂昂贵，不能满足临床大批量检测的需求；

2、毛细管电泳法前处理包括渗析和离心等操作，且需进行毛细管修饰，以防止儿茶酚胺类物质与毛细管壁发生作用，因此该方法繁琐耗时，检测难度和成本较高；

3、儿茶酚胺类化合物的荧光较弱，且生物样本中含量极低，因此荧光法需额外的衍生化处理来加强荧光信号，较繁琐耗时；

4、液相色谱法需要相对复杂的前处理过程，以分离生物样本中杂质成分、费时费力，且灵敏度较低、分析时间长，检测通量低，基质干扰严重，特异性差，自动化程度低。

总之，现有方法的灵敏度较低，专属性和准确度较低，容易受到基质的干扰，检测的儿茶酚胺种类有限；此外，所用试剂和耗材的成本较高，限制了方法的推广使用。

与传统检测方法相比较，高效液相色谱串联质谱法具有极好的选择性，在检测时无需复杂的分离操作，生物样本基质的干扰与影响较小。液质联用仪配有自动进样系统，样品测定可以24小时不间断进行，样本检测可以实现自动化和高通量。现尚无关于人尿液中儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱质谱联用检测方法的专利公开。

技术实现要素：

本发明的目的是解决现有人尿液中儿茶酚胺及其代谢物检测方法中存在的部分问题，提供一种人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，该方法具有专属性强、准确度高、灵敏度高、检测成本低、操作简便、分析效率高通量高等优点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包含人尿液中游离去甲肾上腺素(ne)、肾上腺素(e)、多巴胺(da)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)以及甲氧基肾上腺素(mn)的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：

(1)样本预处理：取100～500μl人尿液，依次加入10～50μl内标工作液和0.1～1ml磷酸溶液，涡旋混匀；

(2)spe96孔板活化：取弱阳离子交换固相萃取96孔板，依次加入1ml甲醇与水，待其自然流干；

(3)固相萃取：将步骤(1)处理后的样品转移到步骤(2)活化后的spe96孔板上，用氮气正压装置压干，依次加入0.1～1ml水与甲醇进行淋洗；再加入0.5～2ml2％甲酸甲醇溶液洗脱，用96孔接收板收集洗脱液，通25～60℃氮气直至干燥；

(4)将步骤(3)得到的残渣，进一步用50～200μl复溶溶液复溶，涡旋使充分溶解，上高效液相色谱串联质谱系统进样5～50μl分析检测。

优选地，所述步骤(1)中内标工作液的配置方法如下：用0.5％焦亚硫酸钠溶液溶解得到1mg/ml的氘代甲氧基去甲肾上腺素(nmn-d3)、氘代甲氧基肾上腺素(mn-d3)、氘代去甲肾上腺素(ne-d6)、氘代肾上腺素(e-d3)、氘代多巴胺(da-d4)的内标储备液，然后用0.1％甲酸溶液进一步稀释混合得到含有ne-d6浓度为5μg/ml、e-d3浓度为500ng/ml、da-d4浓度为200ng/ml、nmn-d3浓度为250ng/ml以及mn-d3浓度为100ng/ml的内标工作液。

优选地，所述步骤(1)中磷酸溶液质量比浓度为1～10％。

优选地，所述步骤(1)中当检测项目包含甲氧基去甲肾上腺素(nmn)以及甲氧基肾上腺素(mn)时，步骤(1)还包括加入磷酸溶液后加热10～60分钟的操作。

优选地，所述步骤(4)中的复溶溶液为甲酸和醋酸铵溶液的混合物，其体积比为1:1000；其中醋酸铵溶液的浓度为5mmol/l。

优选地，所述步骤(4)所述的高效液相色谱串联质谱为三重四级杆质谱仪。

优选地，所述步骤(4)采用的高效液相色谱串联质谱方法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以水-乙腈-醋酸铵-甲酸为流动相体系，流动相的流速为0.4～1ml/min，柱温为30～45℃，采用多反应监测扫描模式(mrm)检测。

进一步地，所述高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液使用的流动相由以下流动相a和流动相b组成；其中流动相a相为体积分数0.1％甲酸-5mm醋酸铵溶液，流动相b相为体积分数0.1％甲酸-98％乙腈溶液，流动相a和流动相b的体积比为100～0：0～100％。

进一步地，所述反相色谱法建立待测物的分离条件包括色谱柱的类型为c18柱、苯基柱或者改性苯基柱，填料粒径为1.7～5μm，内径为2.1～4.6mm，柱长为25～150mm。

更进一步地，所述步骤(4)高效液相色谱串联质谱检测采用电喷雾离子源(esi)和mrm检测模式，用于检测去甲肾上腺素(ne)、肾上腺素(e)、多巴胺(da)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)和甲氧基肾上腺素(mn)的母离子/子离子检测离子对如下所示：ne，m/z169.9>m/z152.1和m/z169.9>m/z107.2；e，m/z184.0>m/z107.2和m/z184.0>m/z166.2；da，m/z154.1>m/z91.1和m/z154.1>m/z137.1；nmn，m/z166.0>m/z134.1和m/z166.0>m/z149.3；mn，m/z180.2>m/z120.2和m/z180.2>m/z148.1；内标ne-d6的检测离子对为m/z176.2>m/z158.1和m/z176.2>m/z111.3；e-d3的检测离子对为m/z187.1>m/z135.2；da-d4的检测离子对为m/z158.1>m/z95.1和m/z158.1>m/z122.0；nmn-d3的检测离子对为m/z169.0>m/z137.2；mn-d3的检测离子对为m/z183.1>m/z123.2。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下所示：

与传统检测相比，高效液相色谱串联质谱法具有以下优点：(1)高特异性：在检测时可有效降低生物基质中复杂组分的干扰与影响，从而简化样本前处理过程；(2)高灵敏度，儿茶酚胺及其代谢物的检测下限可以达到pg级别；(3)自动化和高通量：液质联用仪配有自动进样系统，样品测定可以24小时不间断进行，可实现自动化、高通量，从而满足医院检验科及第三方医学检验单位的实际检测需求；(4)前处理过程相对简单：检测过程中不需要与干扰组分完全分离即可完成准确定量分析，可简化复杂的前处理提取和衍生化操作过程。

除了以上高效液相串联质谱法的优点外，本发明还具有以下几个显著的优点(1)使用稳定同位素标记物作为内标，检测结果准确度和重现性更好；本方法采用与待测物结构一致的同位素标记物内标，可有效校正实际临床样本的基质效应的影响(如高脂质，肝肾功能受损患者的基质和溶血)，确保实际样本结果的准确性；(2)本方法采用质谱临床检测指导原则推荐的多反应监测模式(mrm)进行检测，通过对特征母离子和子离子的筛选，从而有效降低生物样本中复杂组分的干扰，提高方法的专属性和灵敏度；(3)本方法检测单个样本的5种儿茶酚胺类物质的水平，仪器分析时间仅为6分钟，较传统高效液相色谱法大大缩短；前处理采用96孔板，大大提高操作效率；此外结合使用液质联用仪的自动进样系统，可实现自动化和高通量检测；(4)样本前处理过程简单，采用弱阳离子交换固相萃取方法来处理样本，对儿茶酚胺及其代谢物具有较高的回收率，同时可降低生物样本中复杂基质的干扰，获得更好的灵敏度；(5)此外，使用的试剂耗材常规易于获得且成本低，不需要复杂的衍生化操作。

总之，本方法可快速及时的检测人尿液中5种儿茶酚胺类物质的浓度，为临床疾病的诊断提供了准确的检验结果。与现有方法相比较，本方法具有专属性强、准确度高、灵敏度高、检测成本低、操作简便、分析效率高通量高等优点，适合于临床推广，具有广泛的临床应用价值。

基于上述的实验条件，经过多次试验验证，本发明的精密度rsd％<15％。

附图说明：

图1a、1b、1c、1d、1e分别是检测10ng/mlne、0.5ng/mle、10ng/mlda、10ng/mlnmn和5ng/mlmn的定量下限的色谱图；

图2a、2b、2c、2d、2e分别是ne、e、da、nmn和mn的标准曲线。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明用于人尿液游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法检测的具体实现过程。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例：人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法

一、溶液配置：

标准工作液配置：精密称取ne、e、da、nmn和mn标准品，加入0.5％焦亚硫酸钠溶液溶解得到浓度为10mg/ml的一级储备液，然后用0.1％甲酸溶液进一步稀释得到1mg/ml的二级储备液；取适量的0.1％甲酸溶液置于2ml的离心管中，再依次加入适量的ne、e、da、nmn和mn二级储备液到该离心管中，涡旋10s混匀，得到ne浓度为160μg/ml、e浓度为8μg/ml、da浓度为160μg/ml、nmn浓度为160μg/ml、mn浓度为80μg/ml的混合三级储备液，将三级储备液用0.1％甲酸溶液稀释配置得到系列标准工作液，具体浓度如下表1。

表1标准曲线浓度

内标工作液配置：精密称取5种内标标准品，加入0.5％焦亚硫酸钠溶液溶解稀释成1mg/ml的氘代去甲肾上腺素(ne-d6)、氘代肾上腺素(e-d3)、氘代多巴胺(da-d4)、氘代甲氧基去甲肾上腺素(nmn-d3)和氘代甲氧基肾上腺素(mn-d3)的内标储备液，再用0.1％甲酸溶液进一步稀释混合得到ne-d6浓度为5μg/ml、e-d3浓度为500ng/ml、da-d4浓度为200ng/ml、nmn-d3浓度为250ng/ml以及mn-d3浓度为100ng/ml的内标工作液。

二、具体操作步骤：

(1)取尿液500μl，依次加入40μl的内标工作液和500μl质量比4％磷酸溶液，涡旋混匀，100℃加热15分钟；

(2)取弱阳离子交换固相萃取96孔板(spe96孔板)，孔中依次加入1ml甲醇与水，待其自然流干；

(3)将步骤(1)处理所得的样品转移到步骤(2)活化好的spe96孔板中，用氮气正压装置缓慢压干，依次加入1ml水与甲醇进行淋洗；氮气正压装置压干，然后加入1ml2％甲酸甲醇溶液洗脱，用96孔接收板收集洗脱液，置于氮吹仪下通25℃氮气直至干燥。

(4)步骤(3)得到的残渣，加入100μl复溶溶液复溶，涡旋使充分溶解，上高效液相色谱串联质谱联用系统进样20μl分析。

步骤(4)中的复溶溶液为甲酸和醋酸铵溶液的混合物，其体积比为1:1000，醋酸铵溶液浓度为5mmol/l。

步骤(4)所述的质谱为三重四级杆质谱仪。

步骤(4)通过高效液相色谱串联质谱法测定经预处理后的样品溶液，采用梯度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：色谱柱为kinetex2.6μmf5(3×100mm，2.6μm)柱，流速为0.4ml/min，柱温为40℃；

流动相a为含体积分数0.1％甲酸-5mm醋酸铵溶液，流动相b为体积分数0.1％甲酸-98％乙腈溶液；a相∶b相体积比为100～0％：0～100％，按表2梯度程序洗脱，流速为0.4ml/min。

表2；梯度洗脱程序

去甲肾上腺素(ne)保留时间为1.32min，肾上腺素(e)保留时间为1.87min，多巴胺(da)保留时间为2.50min，甲氧基去甲肾上腺素(nmn)保留时间为2.23min，甲氧基肾上腺素(mn)保留时间为4.29min。

质谱条件如表3所示；

表3质谱条件

按以上液相条件分离后，采用电喷雾电离源(esi)和mrm进行质谱检测，用于去甲肾上腺素(ne)、肾上腺素(e)、多巴胺(da)、甲氧基去甲肾上腺素(nmn)与甲氧基肾上腺素(mn)的母离子/子离子检测离子对如下所示：ne，m/z169.9>m/z152.1和m/z169.9>m/z107.2；e，m/z184.0>m/z107.2和m/z184.0>m/z166.2；da，m/z154.1>m/z91.1和m/z154.1>m/z137.1；nmn，m/z166.0>m/z134.1和m/z166.0>m/z149.3；mn，m/z180.2>m/z120.2和m/z180.2>m/z148.1；内标ne-d6的检测离子对为m/z176.2>m/z158.1和m/z176.2>m/z111.3；e-d3的检测离子对为m/z187.1>m/z135.2；da-d4的检测离子对为m/z158.1>m/z95.1和m/z158.1>m/z122.0；nmn-d3的检测离子对为m/z169.0>m/z137.2；mn-d3的检测离子对为m/z183.1>m/z123.2。以上检测离子对的mrm质谱参数如表4所示；

表4检测离子对质谱mrm参数

图1a、1b、1c、1d、1e分别是检测10ng/mlne、0.5ng/mle、10ng/mlda、10ng/mlnmn、5ng/mlmn的定量下限的色谱图；

采用内标法建立标准曲线。如图2a、2b、2c、2d、2e和表5可知，ne在10～1600ng/ml的线性范围内，e在0.5～80ng/ml的线性范围内，da在10～1600ng/ml的线性范围内，nmn在10～1600ng/ml的线性范围内，mn在5～800ng/ml线性相关性良好，相关系数r分别为0.9984、0.9992、0.9966、0.9979和0.9986，准确度范围分别为97.6％-102％、94.0％-103％、89.5％-106％、92.8％-107％和91.6％-107％。

表5：标准曲线结果

本发明已用于临床批量样本的检验测定，结果表明该方法线性范围能够满足临床检验的需要。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。