液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒与流程

本发明涉及维生素检测领域，特别涉及一种液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒。

背景技术：

维生素b12是一类含有咕啉(corrin)环的类咕啉(corrinoids)化合物,维生素b12通俗名称又叫做“钴胺素(cobalamin)”,是唯一的一种含金属元素的维生素。然而人血清中大约1/3的维生素b12并非钴胺素，而是其他的类咕啉，它们在代谢上对人体是不具有生物学活性的。甲钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素是维生素b12的活性型，也是血液中存在的主要形式。

人体不能合成维生素b12，主要依靠动物性食品提供，含量丰富者有肝肾组织、肉类、蛋类和乳类制品。维生素b12在人体代谢当中起到非常重要的作用，其可作为甲基丙二酸单酰辅酶a异构酶的辅酶，参与甲基丙二酸单酰辅酶a转变为琥珀酸单酰辅酶a的反应，该反应在奇数碳原子脂肪酸的代谢中起重要作用。维生素b12亦可作为β-甲基天门冬氨酸变构酶的辅酶，参与β-甲基天门冬氨酸向谷氨酸转化的过程。此外，维生素b12与叶酸协同参与甲基转移作用，影响体内的多种代谢过程。维生素b12缺乏时，可导致dna合成障碍和巨幼细胞贫血，影响神经髓鞘形成，从而出现神经系统症状。

另外，人类血浆中存在3种维生素b12的结合蛋白，即tcⅰ、tcⅱ、tcⅲ(transcobalaminⅰ、ⅱ、ⅲ)，正常情况下，约80％以上的血清维生素b12会与tcⅰ和tcⅲ结合，称为血清全结合咕啉，仅20％与tcⅱ相结合，形成holotcⅱ。全结合咕啉的半衰期约为240小时，holotcⅱ的半衰期仅为6分钟。因此总血清维生素b12含量可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素b12水平。

目前，维生素b12的检测方法有多种，包括化学发光免疫法、微生物法和同位素放射免疫方法等，然而免疫检测方法和微生物方法有很多的弊端，如下：

第一、免疫反应对反应条件的要求比较严苛,必须保证适宜的ph、电解质环境和排除交叉反应；

第二，不同厂商检测试剂盒检测结果存在显著差异，即免疫反应的检测准确度得不到保障；

第三，特异性差，不能有效区分钴胺素和类咕啉，不能给出准确的维生素b12含量；

第四，放射性免疫法存在放射线辐射和污染等问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对目前检测维生素b12存在的缺陷，提出一种液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒，特异性强，灵敏度高，可满足临床检测的需求。

为了实现以上任一发明目的，本发明提供一液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法，适用于测定血清或血浆中维生素b12，包括以下步骤：

(1)维生素b12的提取和稳定：

维生素b12的提取：将结合态维生素b12从钴胺素结合蛋白中游离出来；

维生素b12的稳定：提供氰基离子，转化钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等)为相对稳定的氰钴胺素；

(2)净化浓缩氰钴胺素；以及

(3)串联质谱检测；

其中色谱条件选择为：

色谱柱：2.6μmpolarc18lccolumn50x2.1mm；

流动相a液：含有甲酸的乙酸铵水溶液；

流动相b液：含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液：

流速：0.3-0.4ml/min；

进样量：20μl-40μl；

柱温：30-40℃；

其中质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；离子喷雾电压：4500-5500v；离子源温度(tem)：400-500℃；气帘气(cur)：20-35psi；碰撞气(cad)：9psi；离子源雾化气(gs1)：40-55psi；离子源加热辅助气(gs2)：40-60psi；扫描模式：mrm。

对应维生素b12的检测离子对及其他条件如下表一，表一：

另外，在本发明中，采用甲氨喋呤作为内标定量,由于甲氨喋呤和维生素b12的色谱保留行为非常类似，故可被选为内标定量标准物，此时，对应甲氨喋呤的检测离子以及其他条件如表二，表二：

(4)定量检测：

采用维生素b12标准品制作标准曲线：

以标准溶液浓度为x轴，标准品和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“i/x”权重得回归方程；

获取检测结果，代入回归方程得到血清或血浆中b12的含量。

在维生素b12的提取步骤当中，有以下几种可选的提取当值：

1、采用蛋白释放剂还原维生素b12结合蛋白中的二硫键，利用强碱破坏维生素b12和结合单元的氢键和组氨酸的配位键从而将维生素b12游离出来；

2、在缓冲液中利用高温条件控制蛋白质变性，从而将维生素b12从维生素b12结合蛋白中游离出来；

3、利用蛋白酶水解蛋白，将维生素b12从维生素b12结合蛋白中游离出来、

其中，第一种提取方式中，蛋白释放剂可选择dtt(二硫代苏糖醇)或tcep(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐)，强碱可选择氧化钠或氢氧化钾。

第二种提取方式中，缓冲剂可选择乙酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，蛋白变性的条件选择为：水浴100℃加热或121℃高压灭菌器。

第三种提取方式中，蛋白酶可选择胰腺蛋白酶或木瓜蛋白酶。

在维生素b12的稳定步骤，采用氰基离子将钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等)转化为较稳定的氰钴胺素，稳定的原理如图2。与化学免疫方法的前处理步骤不同的是，在本发明的实施例中，只需要提供氰基离子而不需要提供显色离子，因为本发明检测原理是通过液相色谱质谱的方式进行检测，而不需要采用化学免疫法，故本发明的氰基离子可选择为：用氰化钾或氰化钠或含氰基的络合物溶液，降低样品前处理的难度和成本。

值得一提的是，维生素b12的提取和维生素b12的稳定步骤可同步进行，提高检测效率。

在净化浓缩氰钴胺素步骤当中，也可选择两种方式进行净化：

1、通过hlb固相萃取柱除盐、净化、浓缩。

2、选择维生素b12免疫亲和净化柱净化浓缩。

hlb指的是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，选择的规格条件如下：1cc/30mg，厂家不限。活化平衡：500-1000μl甲醇活化，500-1000μl超纯水平衡。

维生素b12免疫亲和净化柱采用高特异性的单克隆抗体，抗体对维生素b12具有高亲和性，当样品提取液通过免疫亲和柱时，维生素b12与抗体结合，加水洗脱非键合成分，加甲醇将抗体吸附的维生素b12洗脱下来。

另外，本发明提供一种液相色谱串联质谱测定维生素b12的试剂盒，如表三：

相较现有技术，本发明具有以下的有益效果：

1、本发明提供的测定维生素b12的方法及试剂盒采用液相色谱串联质谱检测人体内维生素b12的含量，避免采用免疫方法进行检测，从而避免了免疫方法检测时产生的各种问题。

2、相较检测食品中维生素b12的试剂盒和方法，对氰钴胺素进行了净化浓缩，适用于检测血清和血浆中低浓度的维生素b12。

3、本试剂盒检测特异性高，在较短时间内即可获取准确的维生素b12的浓度，在生物检测领域中有极大的应用。

附图说明

图1是根据维生素b12的化学结构图。

图2是根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒的维生素b12检测原理图。

图3.是根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒的维生素b12定量标准工作曲线。

图4根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒的维生素b12标准品的色谱图。

图5根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒的维生素b12内标甲氨喋呤的色谱图。

图6根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒的人血清样品中维生素b12的色谱图。

图7根据本发明的另一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒的人血清样品中维生素b12的色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

本发明提供具体实施例验证本发明的方法的可行性：

一、材料：

1.1方法学研究实验的样本：血清、血浆，来自于杭州度安医学检验实验室；

1.2仪器

氮吹机(md200，杭州奥盛仪器有限公司)；96孔板(u型0.2ml，博纳艾杰尔)；离心机(1-14k,sigma)；离心管(1.5ml,axygen)；色谱系统，质谱系统，(watersxevotqd/i-class三重四级杆质谱仪，waters公司)；

1.3试剂耗材：

hlb固相萃取柱，1cc/30mg；色谱柱：polarc18；氰化钾溶液(1mg/ml，含2％氢氧化钠，百灵威)；二硫苏糖醇(1mol/l,用ph5.2浓度为0.01mol/l的乙酸钠作为溶液自配制，阿拉丁)；1％-2％冰醋酸溶液；5％甲醇；含有甲酸的乙酸铵水溶液；含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液。

1.4标准品：维生素b12标准品，(氰钴胺素100mg，麦克林)；

1.5内标物：0.1μg/ml甲氨喋呤，(0.2％氨水甲醇作为溶剂配制浓度为1mg/ml的甲氨喋呤储备液，用甲醇稀释至10μg/ml，然后用含有甲酸的乙酸铵水溶液稀释至0.1μg/ml，标准品购自百灵威)；

1.6质控样品：(自配制)；

二、样品前处理：

样品前处理后，用固相萃取法对试剂提取液中的维生素b12进行富集并除去杂质，高效液相色谱串联质谱测定，以甲氨喋呤为内标定量，该方法检测速度快，且可用于检测人血清或血浆中的维生素b12。

标准溶液的制备：配制1mg/ml的氰钴胺素甲醇储备液(含0.1％乙酸)，用含0.1％乙酸的甲醇分别稀释至2ng/ml、4ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、100ng/ml、200ng/ml工作储备液，分别移取10μl上述工作储备液至1.5ml离心管中，分别加入190μlpbs缓冲液，混匀，制成浓度为0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml的标准曲线。

质控样品的制备：用含0.1％乙酸的甲醇分别稀释1mg/ml的氰钴胺素甲醇储备液至4ng/ml、12ng/ml、24ng/ml，分别移取10μl上述工作储备液至1.5ml离心管中，分别加入190μlpbs缓冲液，混匀，制成浓度为0.2ng/ml、0.6ng/ml、1.2ng/ml的质控样品。

实施例1：

样品前处理：

精密量取标准溶液，质控样品，或人血清置于洁净离心管中；以10:1的体积比例加入内标(0.1μg/ml甲氨喋呤)，加入2.5-4体积倍内标的氰化钾(1mg/ml，含2％氢氧化钠)溶液，加入0.5体积倍内标的二硫苏糖醇溶液，混匀3-5分钟，避光超声15-30分钟；

加入1％-2％冰醋酸溶液中和样品，混匀2分钟，12000rpm/min离心5分钟。取上清液上样至活化平衡好的hlb固相萃取柱，待样品流出后，5％甲醇水洗杂，干燥1-2min，用甲醇分两次洗脱，氮吹，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min，进样lc-ms-ms。

另外，如果是采用离心浓缩仪要换为50％甲醇水分两次洗脱，50％甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干后，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min，进样lc-ms-ms。

具体而言，精密量取标准溶液，质控样品，或人血清200μl置于洁净离心管中；加入内标(0.1μg/ml甲氨喋呤)20μl，加入50μl-200μl氰化钾(1mg/ml，含2％氢氧化钠)溶液或一定浓度的含氰根的络合物，加入10μl二硫苏糖醇溶液，混匀3-5分钟，避光超声15-30分钟。加入1％-2％冰醋酸溶液中和样品，混匀2分钟，12000rpm/min离心5分钟。取上清液上样至活化平衡好的hlb固相萃取柱，待样品流出后，分别加入1ml超纯水(也可省略此部)，1ml5％甲醇水洗杂，干燥1-2min(注意将固相萃取柱上残留的水分清除干净，对后续氮吹的时间影响很大)，600μl甲醇(如果有离心浓缩仪要换为50％甲醇水洗脱)分两次洗脱，氮吹(50％甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干)，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min，进样lc-ms-ms。

实施例2：

样品前处理：精密量取标准溶液，质控样品，或人血浆置于洁净离心管中；以10:1的体积比例加入内标(0.1μg/ml甲氨喋呤)，加入40-60体积倍内标的0.1m/lph4.0-4.6之间的乙酸钠缓冲液(含一定浓度氰化钠)，混匀3-5分钟，100℃水浴30分钟，放于冰浴冷却，12000rpm/min离心5分钟。

取上清液上样至活化平衡好的hlb固相萃取柱，待样品流出后，分别加入超纯水(也可省略此步骤)，5％甲醇水洗杂，干燥1-2min(注意将固相萃取柱上残留的水分清除干净，对后续氮吹的时间影响很大)，用甲醇分两次洗脱，氮吹，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min，进样lc-ms-ms。

具体而言，精密量取标准溶液，质控样品，或人血清200μl置于洁净离心管中；加入内标(0.1μg/ml甲氨喋呤)20μl，加入800μl-1200μl0.1m/lph4.0-4.6之间的乙酸钠缓冲液(含一定浓度氰化钠)，混匀3-5分钟，100℃水浴30分钟，放于冰浴冷却。12000rpm/min离心5分钟。取上清液上样至活化平衡好的hlb固相萃取柱，待样品流出后，分别加入1ml超纯水(也可省略此部)，1ml5％甲醇水洗杂，干燥1-2min(注意将固相萃取柱上残留的水分清除干净，对后续氮吹的时间影响很大)，600μl甲醇(如果有离心浓缩仪要换为50％甲醇水洗脱)分两次洗脱，氮吹(50％甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干)，复溶，涡旋混匀5min，移取至96孔板，离心5min，进样lc-ms-ms。

三、液相色谱串联质谱检测：

色谱条件：

色谱柱：polarc18；流动相：a液：含有甲酸的乙酸铵水溶液，b液:含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液；流速：0.4ml/min，柱温为35℃，进样20μl；等度洗脱。

质谱条件：

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子模式；离子喷雾电压：5500v；离子源温度(tem)：500℃；气帘气(cur)：20psi；碰撞气(cad)：9psi；离子源雾化气(gs1)：55psi；离子源加热辅助气(gs2)：60psi；扫描模式：mrm。

维生素b12以及内标的mrm方法设置

四、数据处理：

4.1获取维生素标准品的色谱图

获取维生素b12标准品的色谱图如图4所示，作为标准曲线的定量下限。

4.2获取维生素b12内标内标甲氨喋呤的色谱图。

获取维生素b12内标甲氨喋呤的色谱图如图5所示，其色谱峰保留时间与维生素b12接近，可以很好的校准样品前处理过程中和色谱分离过程产生的波动，提高分析结果的准确度。

4.3获取维生素b12的定量标准工作曲线：

获取不同浓度的维生素b12标准曲线进行测定，得到检测数据，以标准溶液浓度为x轴，标准和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x”权重得回归方程：y＝0.01672x+0.099974，其线性系数为0.99974，如图3所示，线性拟合方程，线性良好，满足定量要求。

五、检测结果：

5.1检测结果1：

以实施例1制备得到的样品进行检测，检测得到的色谱图如图6，由图6可知，色谱峰形较好，保留时间与维生素b12标准品对应，测定值为0.41ng/ml。

5.2检测结果2：

以实施例2制备得到的样品进行检测，检测得到的色谱图如图7，由图7可知，色谱峰形较好，保留时间与维生素b12标准品对应，测定值为0.59ng/ml。

六、该方法的可行性检测：

6.1、检出限：

配制0.03ng/ml的维生素b12标准溶液，上仪器进行测定，重复测定3次，计算信噪比均值，结果为4。该方法仪器检出限为0.03ng/ml。

6.2精密度：

0.2ng/ml、0.6ng/ml、1.2ng/ml浓度的批内批间精密度度均在15％以内，符合临床检测对精密度的要求。

6.3准确度：

0.2ng/ml、0.6ng/ml、1.2ng/ml浓度的批内批间准确度均在质控样品标示值的±15％以内，符合临床检测对准确度的要求。

七、液相色谱串联质谱测定维生素b12的试剂盒：

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。