王不留行和炒王不留行的UPLC图谱的建立方法及应用与流程

本发明是关于一种建立王不留行和炒王不留行的uplc图谱的方法以及鉴别王不留行与炒王不留行的应用方法。
背景技术：
：王不留行为石竹科植物麦蓝菜vaccariasegetalis(neck.)garcke的干燥成熟种子，它的异名为不留行、王不流行、剪金花、金剪刀草、禁宫花、麦蓝子。王不留行含有多种化学成分，如三萜皂苷、环肽、黄酮、生物碱、酚酸、类固醇和挥发油等，其中含量最高的是三萜皂苷，其次是黄酮和环肽。目前，王不留行在药典中的炮制方法为清炒法。自古有“逢子必炒”的说法，而目前认为子类中药炒后其生物利用度可能增加。关于炒王不留行炮制机理研究的报道不多。有研究表明，炒制后，王不留行的浸出物含量有较大幅度上升。但其中主要药效成分在炮制及溶出过程中如何变化及其水煎溶出率是否都能増加目前并未有定论。且目前对(炒)王不留行特征图谱的研究文献较少。黄懿，欧阳波等人采用高效液相色谱法对不同产地的炒王不留行的指纹图谱进行相关性研究，结果显示不同产地10批样品的炒王不留行图谱与对照指纹图谱比较相似度均大于0.99(黄懿,欧阳波等,不同产地炒王不留行hplc指纹图谱及含量测定研究[j].湖南:《中南药学》,2017,15(7):879-882)。陈琳等人采用高效液相色谱法建立炒王不留行配方颗粒的指纹图谱，为炒王不留行配方颗粒质量标准提供依据(陈琳,胡昌江,冯建,等,炒王不留行配方颗粒高效液相指纹图谱研究[j].《亚太传统医药》,2013,(4):16-18.doi:10.3969/j.issn.1673-2197.2013.04.009)。《香港中药材标准》中采用hplc建立了王不留行特征图谱方法。孙兆林等人用uplc法测定了黄酮苷类成分含量在王不留行炮制后的变化，炮制后，王不留行黄酮苷(vaccarin)含量大幅度下降(孙兆林,阴钺玲,薛睿,uplc法测定炮制前后王不留行中vaccarin含量[j].《亚太传统医药》,2015(20):20-21)。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法，该方法具有良好的重复性和准确性。本发明的另一目的在于提供一种鉴别样品为王不留行或是炒王不留行的方法。一方面，本发明提供了一种王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法，该方法包括：供试品溶液的制备：取王不留行或炒王不留行供试品粉末，加入75％乙醇，超声处理，过滤，取滤液，即得供试品溶液；高效液相色谱仪检测：采用waters高效液相色谱仪，对供试品溶液进行检测，建立uplc图谱。根据本发明的具体实施方案，本发明的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法中，供试品溶液的制备过程中，供试品粉末与乙醇的比例为：1g供试品粉末：75％乙醇25ml。优选地，所述供试品粉末过三号筛。根据本发明的具体实施方案，本发明的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法中，供试品溶液的制备过程中，超声处理的条件为：功率250w，频率33khz，超声处理30分钟。根据本发明的具体实施方案，本发明的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测过程中，以ymctriartc18为色谱柱。优选地，ymctriartc18色谱柱规格为：100mm×2.1mm，1.9μm。根据本发明的具体实施方案，本发明的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测时，进样量为1μl。根据本发明的具体实施方案，本发明的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测过程中，以乙腈-水为流动相进行梯度洗脱，流速为每分钟0.35ml；柱温为35℃；检测波长为219nm。更具体地，该高效液相色谱仪检测过程中，以乙腈为流动相a，以水溶液为流动相b，按以下条件梯度洗脱：0～5.5min，10％→15％a；5.5～11min，15％→30％a；11～16.5min，30％→70％a；16.5～16.51min，70％→10％a；16.51～23min，10％a。本发明的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法，所制备得到的供试品溶液稳定性好，uplc检测分离度较好，大大缩短了检测时间，并具有良好的重复性和准确性。另一方面，本发明还提供了一种鉴别样品为王不留行或是炒王不留行的方法，该方法包括：按照本发明所述的王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法制备样品的供试品溶液并建立uplc图谱；根据样品的uplc图谱的特征峰，鉴别样品为王不留行或是炒王不留行。本案发明人在研究中，按照本发明所述的方法建立了大量王不留行药材及炒王不留行饮片的uplc图谱，进行分析研究发现，以王不留行黄酮苷为参照峰，相对保留时间在1.25±10％范围内的特征峰(本发明中称之为峰3)的相对峰面积，于王不留行和炒王不留行中具有显著不同。王不留行药材峰3相对峰面积范围为0.068～0.149，而炒王不留行饮片峰3相对峰面积范围为0.183～0.411，炒王不留行饮片峰3相对峰面积比王不留行大，说明王不留行经过炮制后，峰3峰面积相应增大。由峰3可将王不留行和炒王不留行进行区分。从而根据本发明的具体实施方案，本发明的鉴别样品为王不留行或是炒王不留行的方法还包括：以王不留行黄酮苷为参照峰，计算相对保留时间在1.25±10％范围内的特征峰的相对峰面积，根据该相对峰面积鉴别样品为王不留行或是炒王不留行。更具体地，所述相对峰面积在0.068～0.149范围内，鉴别样品为王不留行；所述相对峰面积在0.183～0.411范围内，鉴别样品为炒王不留行。综上所述，本发明提供了王不留行或炒王不留行的uplc图谱的建立方法，所制备得到的供试品溶液稳定性好，uplc检测分离度较好，大大缩短了检测时间，并具有良好的重复性和准确性。本发明还提供了鉴别样品为王不留行或是炒王不留行的方法，该鉴别方法能简便且准确可靠地区分王不留行与炒王不留行。附图说明图1为20批不同来源/批次的王不留行药材重叠色谱图。其中，峰1：刺桐碱，峰2(s)：王不留行黄酮苷。图2为王不留行药材对照特征图谱。图3为20批不同来源/批次炒王不留行饮片重叠色谱图。其中，峰1：刺桐碱，峰2(s)：王不留行黄酮苷。图4为炒王不留行饮片对照特征图谱。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。实施例11材料1.1仪器及试剂仪器：waters高效液相色谱仪(沃特斯公司)，ymctriartc18(2.1×100mm，1.9μm)，万分之一天平(梅特勒-托利多公司，me204e)，百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，xp26)。试剂：乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)为分析级、甲醇(广东光华科技股份有限公司)为分析级，乙腈(默克股份有限公司)为色谱级、水为超纯水(默克股份有限公司，mili-qdirect)。试药：刺桐碱(上海源叶生物科技有限公司，含量：98.0％，批号：p26n6f6550)，王不留行黄酮苷(中国食品药品检定研究院，含量：99.7％，批号：111853-201704)。2.方法与结果2.1王不留行uplc特征图谱2.1.1色谱条件以ymcc18(100mm×2.1mm，1.9μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以水溶液为流动相b，按梯度洗脱(0～5.5min，10％→15％a；5.5～11min，15％→30％a；11～16.5min，30％→70％a；16.5～16.51min，70％→10％a；16.51～23min，10％a)；流速为每分钟0.35ml；柱温为35℃；检测波长为219nm；进样量为1μl。2.1.2对照品溶液的制备分别取刺桐碱对照品、王不留行黄酮苷对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含刺桐碱32μg的溶液，加70％甲醇制成每1ml含王不留行黄酮150μg的溶液，即得。2.1.3供试品溶液的制备取王不留行粉末约1g(过三号筛)，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75％乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率33khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2王不留行特征图谱方法学验证2.2.1精密度实验取王不留行供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下重复进样6次。以王不留行黄酮苷为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，4个共有峰的相对保留时间与相对峰面积rsd均小于3％，表明仪器精密度良好。2.5.2稳定性试验取王不留行供试品溶液，按“2.1”项所述色谱条件分别在0、2、4、6、12、24h进样分析。以王不留行黄酮苷为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，4个共有峰的相对保留时间与相对峰面积rsd均小于3％，表明该样品在24h内稳定。2.5.3重复性试验取王不留行供试品溶液6份，按“2.1.3”项供试品溶液的配制方法处理，按“2.1”项所述色谱条件测定。以王不留行黄酮苷为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，4个共有峰相对保留时间与相对峰面积rsd均小于3％。表明该方法重复性良好。2.3样品测定取20批王不留行药材样品及炒王不留行饮片样品，按“2.1.3”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“2.1”项下确定的色谱条件，进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对20批王不留行药材及炒王不留行饮片特征图谱进行共有峰标识，并生产对照图谱。20批王不留行药材重叠色谱图见图1，王不留行药材对照特征图谱见图2，20批炒王不留行饮片重叠色谱图见图3，炒王不留行饮片对照特征图谱见图4。20批王不留行与炒王不留行共有峰相对峰面积结果见表1和表2。表1：20批王不留行药材特征图谱(相对峰面积)表2：20批炒王不留行饮片特征图谱(相对峰面积)20批王不留行与炒王不留行特征图谱相对峰面积范围见表3。表3：王不留行药材与炒王不留行饮片特征峰相对峰面积范围峰号王不留行药材炒王不留行饮片峰10.829～1.3330.901～1.539峰2(s)1.0001.000峰30.068～0.1490.183～0.411峰40.129～0.2470.128～0.283峰50.048～0.0820.062～0.122由表3数据比较结果可以看出，王不留行药材和炒王不留行饮片中，王不留行药材峰3相对峰面积范围为0.068～0.149，而炒王不留行饮片峰3相对峰面积范围为0.183～0.411，炒王不留行饮片峰3相对峰面积比王不留行大，说明王不留行经过炮制后，峰3峰面积相应增大。由峰3可将王不留行和炒王不留行进行区分。峰3相对峰面积落在0.068～0.149范围内即为王不留行，落在0.183～0.411范围内，即为炒王不留行。当前第1页12