一种动物体内药物残留的检测方法与流程

本发明公开涉及药物检测的
技术领域：
，尤其涉及一种动物体内药物残留的检测方法。
背景技术：
：随着我国畜牧业的繁荣和发展，药物(包括药物添加剂)的使用日益广泛。药物不仅可用于治疗和预防动物疾病，还可以促进动物的生长繁殖和提高生产性能，提高畜禽的经济价值，保障畜牧业的发展。出于治疗及预防的目的，药物被应用于现代畜禽养殖的一些环节中，但是药物的不合理应用及不遵守正确的休药期导致药物及其代谢产物在动物体内滞留或蓄积，并以残留的方式进入人体，危害人类健康。如何进行药物残留的有效监控己经成为国际社会关注的焦点问题。目前，在进行动物性产品中药物残留的检测方法，大多以动物可食组织作为检测对象，但由于动物可食组织基质复杂，导致样品前处理方法操作繁琐，耗时较长，试剂需要量大，回收率低，现有的检测方法多为检测一类或几类药物，存在检测效率低的问题。因此，如何研发一种新的检测方法，以解决上述问题，成为人们亟待解决的问题。技术实现要素：鉴于此，本发明提供了一种动物体内药物残留的检测方法，以至少解决现有检测方法以动物可食组织作为检测对象，存在样品前处理方法操作繁琐，耗时较长，试剂需要量大，回收率低等问题，而且现有的检测方法多为检测一类或几类药物，存在检测效率低的问题。本发明提供的技术方案，具体为，一种动物体内药物残留的检测方法，该方法以动物尿液作为检测对象，具体包括如下步骤：1)样品前处理：量取样品放置于塑料离心管中，加入提取液后，涡旋振荡、离心，收集上清液；将所述上清液过primehlb固相萃取柱净化、浓缩、定容后，备用；2)定性分析：运用uplc-ms/ms-qtrap法对经过样品前处理的待检测动物尿液样品进行筛查，采用液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的增强子离子扫描功能，建立mrm-ida-epi筛查方法，获得待检测动物尿液样品中各目标药物母离子的ms2谱图；用已知数据库中各药物的标准ms2谱图与获得待检测动物尿液样品中各目标药物母离子的ms2谱图分别进行对比，获得相似度值，并匹配两者的特征碎片离子，进而判断待检测动物尿液样品中是否含有目标药物；3)定量分析：分别称取各药物标准品，依据相似相溶原理选择溶剂分别配制1mg/ml的标准储备液，备用；按照步骤1)中样品前处理方法对空白样品进行处理后，用空白样品基质溶液稀释标准储备液，制成混合标准储备溶液；将混合标准储备溶液定容后，得到空白样品基质溶液，配制浓度为0.5ng/ml～100ng/ml的系列匹配标准工作溶液；运用uplc-ms/ms-qtrap法，采用液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪对系列匹配标准工作溶液和经过样品前处理的待检测动物尿液样品分别进行测定，获得以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标的绘制标准曲线，以此标准曲线来计算待检测动物尿液样品中目标药物的残留量。优选，所述提取液为含有甲酸的乙腈与甲醇的混合溶液，其中，乙腈与甲醇的体积比为1:1，且甲酸的体积浓度为0.2％。进一步优选，所述药物为阿苯哒唑、噻苯哒唑、奥芬达唑、依诺沙星、洛美沙星、司帕沙星、奥比沙星、氟罗沙星、吡哌酸、萘啶酸、西诺沙星、恩诺沙星、氟甲喹、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、噁喹酸、沙拉沙星、达氟沙星、培氟沙星、磺胺甲二唑、磺胺苯酰、磺胺吡唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺多辛、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺醋酰、甲氧苄啶、林可霉素、替米考星、吉他霉素、交沙霉素、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、甲硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝咪唑、替硝唑、奥硝唑、甲苯咪唑、群勃龙、甲基睾丸酮、安宫黄体酮、地塞米松、甲基强的松龙、地夫可特、更昔洛韦、阿昔洛韦、金刚烷胺、利巴韦林、阿比多尔、咪喹莫特、克伦特罗、沙丁胺醇、特布他林、莱克多巴胺、西马特罗、喷布特罗、苯唑西林、氨苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、青霉素g、头孢氨苄、地西泮、氯丙嗪、氯羟吡啶以及3-甲基喹噁啉-2羧酸中的一种或多种。进一步优选，所述步骤1)中样品前处理具体为：量取样品2.00ml，置于塑料离心管中，加入提取液6ml，液涡旋振荡提取，6000r/min离心5min，收集上清液；将上清液直接过primehlb固相萃取柱净化，取4ml流出液在40℃条件下氮吹至近干，加入1.0ml20％的甲醇水溶液定容后，过0.22um微孔滤膜，备用。进一步优选，所述步骤2)中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子扫描；采集模式：多反应监测；信息关联扫描：强度阈值100cps；增强子离子扫描：质量数采集范围m/z50～1000da；电喷雾电压：5500v；雾化气压力：50psi；气帘气压力：30psi；辅助气压力：60psi；离子源温度：550℃；入口电压：10v；碰撞气能量：20、35、50v；扩展碰撞能量：15v。进一步优选，所述步骤3)中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的色谱条件为：色谱柱：watersbehc18反相色谱柱；柱温：40℃；进样体积：10μl；流速：0.2ml/min；流动相：流动相a：0.01mol/l乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)，b：甲醇，梯度洗脱程序：0min，95％a；1min，95％a；4min，83％a；6min，83％a；12min，60％a；17min，5.0％a；20min，5.0％a；20.1min，95％a；25min，95％a；所述步骤3)中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子扫描；采集模式：多反应监测；电喷雾电压：5500v；雾化气压力：50psi；气帘气压力：30psi；辅助气压力：60psi；离子源温度：550℃；入口电压：10v。进一步优选，所述待检测动物尿液样品为猪尿液。本发明提供的动物体内药物残留的检测方法，该方法以动物尿液作为检测对象，利用提取液进行待检测样品的提取，并将提取后获得的上清液经primehlb固相萃取柱净化，以完成样品前处理，然后应用超高效液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪，建立了动物尿液中85种药物同时筛查、确证的检测方法，该检测方法具有操作简单、通量高效、定性准确、灵敏度高等特点，适合用于动物尿液中多种药物的筛查、确证，可极大的提高检测效率，避免假阳性样品的检出。应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。附图说明此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明公开实施例提供的一种待检测猪尿液中疑似样品的ms2谱图；图2为本发明公开实施例提供的克伦特罗的标准ms2谱图；图3为本发明公开实施例提供的85种药物的总离子流图。具体实施方式这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的方法的例子。鉴于现有技术中，在进行动物体内药物残留检测时，只能以动物可食组织作为检测对象，存在样品前处理方法操作繁琐，耗时较长，试剂需要量大，回收率低等问题，而且现有的检测方法只能检测一类或几类药物，还存在检测效率低的问题，因此，本实施方案首次尝试以动物尿液作为检测对象，简化样品的前处理方法，而且通过uplc-ms/msqtrap质谱特有的mrm-ida-epi筛查功能，实现85种药物同时筛查和确证。其中，本申请发明人之所以考虑采用尿液作为检测动物体内药物残留检测的原因主要在于：一方面是考虑动物尿液具有基质简单，前处理操作简单，检测结果回收率高，重现性好，检出限低等优点；另一方面尿液中的药物残留代谢与动物肌肉和脏器中的药物残留具有一定关联性，通过检测动物尿液中的药物残留可以间接反映动物可食性组织中药物残留的情况，避免动物胴体的资源浪费。具体的检测方法如下：一、样品前处理：1、样品提取：准确量取2.00ml样品，置于塑料离心管中，6ml体积浓度为0.2％的甲酸乙腈：甲醇(1：1)溶液涡旋振荡提取，6000r/min离心5min，收集上清液。2、样品净化：将上清液直接过primehlb固相萃取柱净化，取4ml流出液在40℃条件下氮吹至近干，加入1.0ml20％的甲醇水溶液定容后，过0.22um微孔滤膜，备用。二、定性分析：uplc-ms/ms-qtrap法定性测定：采用mrm-ida-epi筛查确证方法，可实现定性定量一次性完成。先采用液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪经过样品前处理的待检测动物尿液样品进行探测扫描，系统自动判断探测扫描采集的信号强度是否超过ida条件设置中的各项设置值，即判断是否出现色谱峰。当满足预设置值时，系统快速(<1ms)自动切换为线性离子阱模式，进行增强子离子扫描(epi)，并获得探测扫描所得母离子的高质量ms2谱图，用已知数据库中药物的标准ms2谱图与获得待检测动物尿液样品中各目标药物母离子的ms2谱图分别进行对比后，获得相似度值，并且匹配两者的特征碎片离子，进而判断待检测畜禽肉制品样品中是否含有目标药物。三、定量分析：采用uplc-ms/ms-qtrap法定量测定：对基质匹配标准工作溶液和待检测样品进行测定，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，以此标准曲线来计算供试样品中目标药物的含量。其中，定量分析中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪采用的色谱条件为：acquitywatersbehc18柱(2.1×100mm，1.7μm)，流动相a：0.01mol/l乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)；b：甲醇，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1，流速0.2ml/min，柱温40℃，进样体积10μl。表1.液相色谱梯度洗脱程序时间(min)流速(ml/min)流动相流动相b％00.2a％95510.295540.2831760.28317120.26040170.2595200.259520,10.2955250.2955其中，液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪采用的质谱条件为：电离模式：电喷雾正离子esi(+)；检测方式：多反应监测扫描(mrm)；电喷雾电压(is)：5500v；雾化气压力(gs1)：50psi；气帘气压力(cur)：30psi；辅助气压力(gs2)：60psi；离子源温度(tem)：550℃；入口电压(ep)：10v。85种药物的保留时间及质谱采集参数见表2，总离子流图见图3。表2.待测化合物的保留时间及质谱参数定量离子。本实施方案提供的检测动物尿液中药物残留的方法与现有技术相比，具有以下优良效果：(1)本实施方案建立了一种分析动物尿液中85种药物残留的uplc-ms/ms-qtrap筛查、确证方法，实现了动物尿液中多种药物的同时检测、确证，相比以往采用动物可食组织作为检测对象时，不仅可实现青霉素类药物(苯唑西林、氨苄青霉素、氯唑西林、双氯西林、青霉素g、头孢氨苄)以及抗病毒类药物(更昔洛韦、阿昔洛韦、金刚烷胺、利巴韦林、阿比多尔、咪喹莫特)的检出，而且对于激素等其他类药物的检出种类也实现了扩充，例如激素类(群勃龙、甲基睾丸酮、甲基强的松龙、地夫可特)，及其他类药物共30种的检出。(2)本实施方案采用含0.2％甲酸的甲醇：乙腈(1:1)的混合溶液提取，并首次采用primehlb固相萃取柱净化尿液样品，primehlb固相萃取柱与传统的固相萃取柱相比较，其净化特点在于提取液直接上样，流出液即为所要溶液，一步通过式净化省去了活化、淋洗、洗脱等操作步骤，实现了动物尿液中85种药物同时提取、净化，具有简便、高效、快速等优点，并且带来高而稳定的回收率和杰出的批次间重现性。(3)本实施方案采用选择性好，抗干扰能力强的uplc-msms-qtrap方法检测，稳定性好，灵敏度高，准确度和精密度均符合多残留分析方法的要求，同时具有筛查、确证功能，可避免假阳性样品的检出。选择mrm-ida-epi功能，在ida中设置相关的判定标准，连接液相，输入液相的采集条件，进行数据采集，一旦mrm采集的信号强度超过判定标准值，就会触发epi进行增强子离子扫描采集ms2图，对采集的图谱打开其可疑峰(通过保留时间、峰形等判断)的ms2图，进行已知谱库搜索等操作，同谱库的质谱数据进行对比，得到相应的匹配数据，用以进行判断残留的检出，进而实现快速筛查和确证的目的。(4)本实施方案由于样品基质、前处理方式简单，对于样品中的药物损失较小，实验证明相对以往的检测方法，本实施方案降低了大多数药物的检出限和定量限，方法灵敏度高，回收率高，重现性好，符合多残留分析的要求。具体实施例下面以具体的实施例对本发明进行更进一步的解释说明，但并不用于限制本发明的保护范围。下面采用上述方法对猪尿液中85种药物的残留进行测定及可疑峰筛查。1.仪器和试剂主要仪器：acquitytm超高效液相色谱仪(美国waters公司)；absciexqtrap5500四极杆-离子阱质谱仪(美国ab公司)。主要试剂：85种标准品的纯度均≥98.0％，购自dr.ehrenstorfergmbh公司、农业部环境保护科研监测所(天津)、国家标准物质中心等标准品生产厂商及研究机构。2.标准溶液配制：准备标准储备液：分别称取各标准品适量，分别用甲醇、水配制为1mg/ml的标准储备液，置于棕色瓶中4℃下保存备用。准备基质匹配标准工作溶液：为了消除基质效应对定量测定的影响，用空白样品溶液稀释混合标准储备溶液。对空白样品按下述相同前处理方式处理，用空白样品基质溶液稀释混合标准储备溶液，定容得到空白样品基质溶液，配制浓度为0.5ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的系列匹配标准工作溶液。3.色谱质谱分析条件：色谱分析条件：watersbehc18反相色谱柱；流动相a：0.01mol/l乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)，b：甲醇，采用梯度洗脱，流速0.2ml/min，梯度洗脱程序：0min，95％a；1min，95％a；4min，83％a；6min，83％a；12min，60％a；17min，5.0％a；20min，5.0％a；20.1min，95％a；25min，95％a；柱温40℃；进样体积10μl。质谱分析条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子扫描；采集模式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压(is)：5500v；雾化气压力(gs1)：50psi；气帘气压力(cur)：30psi；辅助气压力(gs2)：60psi；离子源温度(tem)：550℃；入口电压(ep)：10v。其中，85种化合物的保留时间及质谱采集参数见表2，总离子流图见图1。4.样品前处理方法：样品提取：准确量取样品2.00ml，置于塑料离心管中，并加入6ml体积浓度为0.2％的甲酸乙腈：甲醇(1：1)溶液涡旋振荡提取，6000r/min离心5min。样品净化：将上清液直接过primehlb固相萃取柱净化，取4ml流出液在40℃条件下氮吹至近干，加入1.0ml20％的甲醇水溶液定容后，过0.22um微孔滤膜，待测。5.定量分析及方法的有效性评价：线性、检出限和定量限：对系列浓度的基质匹配标准溶液进行测定，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。然后对供试样品进行测定，得到各化合物的定量离子的峰面积，代入标准曲线，计算得85种药物的含量。向空白样品中添加不同质量的标准溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比分别计算出方法的检出限和定量限。85种药物的检出限在0.01～6.06μg/kg之间，定量限在0.03～18.2μg/kg之间，各化合物的线性回归方程、检出限、定量限见表3。表3.化合物的线性回归方程、相关系数r、检出限、定量限准确度和精密度：在2.0、5.0、20μg/kg三个浓度水平做加标回收实验，每个浓度水平做6个平行样品，分别进行样品前处理和仪器分析，并按照加标量和测定值计算回收率。猪尿液中85种药物的平均回收率和相对标准差(rsd)见表4。由表4可以看出，85种药物在猪尿液中的平均回收率在53.4％～106％之间，相对标准偏差在2.2％～13.4％之间，符合多残留分析的要求。表4.猪尿液中不同添加水平下的回收率和相对标准偏差(n＝6)6.可疑峰定性筛查分析举例采用analyst软件进行高通量的未知物快速筛查。检测实际样品，在mrm扫描模式下发现疑似目标物，通过比对实际样品检测结果和数据库中三种能量下的碎片、丰度比、保留时间等信息进行化合物确证。质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子扫描；采集模式：多反应监测(mrm)；信息关联扫描(ida)：强度阈值100cps；增强子离子扫描(epi)，质量数采集范围m/z50～1000da；电喷雾电压(is)：5500v；雾化气压力(gs1)：50psi；气帘气压力(cur)：30psi；辅助气压力(gs2)：60psi；离子源温度(tem)：550℃；入口电压(ep)：10v；碰撞气能量(ce)：20、35、50v；扩展碰撞能量(ces)：15v。选择ms2谱图并且使图形最大化，右击鼠标，点击searchlibrary，软件会自动给出筛查的结果。fit值(匹配值)是用标准物质谱图与可疑样品谱图进行对比后获得的相似度值，满分为100，fit值越大可信度越高说明化合物的可能性越大；revfit值(反相匹配值)是用可疑样品谱图与标准物质谱图进行对比后获得的相似度值；purity值(纯度值)是综合前两种结果得到的数值。图1为样品中可疑峰的ms2谱图，图2为克伦特罗标准品的ms2谱图，具体的谱图筛查结果见表5。表5.谱库筛查结果从表5可明显看出，库中克伦特罗(clenbuterol)得分高，排列最靠前，并且特征碎片离子都与样品中匹配，由此可判断此样品中含有克伦特罗，进一步提高了对结果确证的信心，避免了假阳性结果的产生。本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本
技术领域：
中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述的内容，可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。当前第1页12