一种木香药材UPLC指纹图谱的构建方法及其应用与流程

本发明属于药物分析及药物质量控制技术领域，具体涉及一种木香药材指纹图谱的构建方法及其应用。

背景技术：

木香为菊科木香属植物木香aucklandialappadecne.的干燥根，其性辛、苦，温。归脾、胃、大肠、三焦、胆经。木香生品具有行气止痛，健脾消食之功效。明代《本草纲目》曰：云木香“凡人理气药只生用，不见火，若实大肠，宜面煨熟用”，是治疗胃肠疾病的常用药。始载于《神农本草经》，列为上品。历代本草也均有记载，药用历史悠久。木香原产于印度，因曾引种到云南，故又称云木香，在云南、四川、甘肃、广西、西藏、陕西及中南诸省均有引种栽培。目前云南产量最大，为道地品种。现为《中国药典》收载品种。现代中药学表明，木香含有萜类、甾体、配糖体、生物碱、糖、氨基酸、脂肪酸及其酯等成分。

近年来，木香药材种植产地不断增加，大部分文献都以木香脂溶性成分木香烃内酯及去氢木香烃内酯含量作为木香质量评价指标，水溶性成分检测鲜有报道。中药成分复杂，仅以几个化合物的含量作为质量的评价指标亦是不全面的。中药指纹图谱是指中药材或中药制剂经适当处理后采用一定的分析手段，得到能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。由于uplc具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点，所以目前在中药指纹图谱技术中uplc已经得到广泛应用。因此，本发明建立了木香uplc指纹图谱，并在指纹图谱的条件下同时检测其水溶性成分3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的含量，并结合相似度分析、聚类分析和主成分分析对不同产地木香药材的质量进行了全面、有效的评价。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种木香药材uplc指纹图谱的构建方法，该方法为木香药材的质量控制提供了较为全面、有效的快速评价方法。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种木香药材uplc指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：

(a)对照品溶液的制备：

取紫丁香苷、绿原酸、木香烃内酯、去氢木香烃内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含紫丁香苷、绿原酸、木香烃内酯、去氢木香烃内酯20μg、10μg、15μg、15μg的溶液；精密称取3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品，用80％甲醇制成每1ml含3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸20.3454μg的溶液；

(b)供试品溶液的制备：

取木香药材粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60-80％甲醇25-50ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，再称定重量，用60-80％甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(c)超高相液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.30ml/min；柱温为30℃；检测波长为254nm，进样体积为1μl，梯度洗脱表见下表：

(d)指纹图谱的建立：

将多批木香药材的色谱图，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行共有峰标识，建立木香药材的对照指纹图谱，确定具有8个共有峰，以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸为参照峰s峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：0.43、峰2：0.49、峰3：0.95、峰4：1.00、峰5：1.05、峰6：1.21、峰7：1.67、峰8：1.69，相对保留时间在规定值的±10％之内；

(e)相似度评价：比较不同产地各批次木香药材的色谱图与对照指纹图谱的相似度；

(f)聚类分析：运用spss20.0软件对不同产地的木香药材进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式，得到不同产地的木香药材的聚类结果；

(g)主成分分析：以8个共有峰的峰面积为数据，用spss20.0软件对其进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差，确定主成分，计算权重值，判定在区分各产地木香指纹图谱中占了决定性作用的各峰，并针对主成分对木香药材进行综合评价，得到不同产地的木香药材的质量分析结果。

优选的，步骤(b)供试品溶液的制备：取木香药材粉末，过四号筛，0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足损失的重量，摇匀，用0.22um滤膜过滤，取续滤液，即得。

优选的，步骤(g)中，区分各产地木香指纹图谱中占了决定性作用的各峰分别为：峰4：3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸、峰2：绿原酸和峰3。

作为本发明进一步优选的技术方案，所述的一种木香药材uplc指纹图谱的构建方法，还包括步骤(h)3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的含量测定，采用超高液相色谱仪测定，其中色谱条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.30ml/min；柱温为30℃；检测波长为327nm，进样体积为1μl，梯度洗脱表见下表：

本发明还提供了上述木香药材uplc指纹图谱的构建方法在木香药材质量检测中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明建立了木香药材的uplc指纹图谱，运用相似度分析、聚类分析和主成分分析对不同产地的木香药材uplc指纹图谱进行了分析，并首次在指纹图谱的条件下同时检测其水溶性成分3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的含量。本发明运用3种指纹图谱分析方法以及以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量作为指标，较全面地评价了不同产地木香的质量，为木香的质量控制研究奠定基础。

附图说明

图1为13批木香药材uplc指纹图谱叠加图；

图2为13批木香药材uplc指纹图谱共有模式图；

图3为13批木香药材的聚类分析结果图；

图4为主成分分析的碎石图；

图5为旋转空间中的成分图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

1、仪器与试药

1.1仪器waters超高效液相色谱仪(沃特斯公司)，agilent超高效液相色谱仪(安捷伦公司)，ymctraitc18(100mm×2.1mm，1.9μm)色谱柱，万分之一天平(梅特勒-托利多公司，me204e)，百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，xp26)。数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药木香药材来源于全国4个产地，经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为木香aucklandialappadecne.的干燥根，具体信息见表1。绿原酸(含量：99.3％，批号：110753-201716)，紫丁香苷(批号：111574-201605)，3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸(含量：97.3％，批号：111782-201706)对照品来自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱级、水为超纯水，其他试剂为分析纯。

表1木香药材来源

2、方法与结果

2.1对照品溶液的制备取紫丁香苷、绿原酸、木香烃内酯、去氢木香烃内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含紫丁香苷、绿原酸、木香烃内酯、去氢木香烃内酯20μg、10μg、15μg、15μg的溶液；精密称取3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品5.227mg，置25ml量瓶中，用80％甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含203.4543μg的贮备液；精密吸取1.0ml贮备液置10ml容量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸20.3454μg的溶液。

2.2供试品溶液的制备取木香药材粉末，过四号筛，0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足损失的重量，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3超高相液相色谱测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，其中色谱条件为：以ymctrait(100mm×2.1mm，1.9μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.30ml/min；柱温为30℃；指纹图谱检测波长为254nm，进样体积为1μl，梯度洗脱表见表2。

表2梯度洗脱表

3、供试品溶液制备方法考察

3.1提取溶媒考察

本次实验研究主要考察了甲醇、80％甲醇、乙醇、稀乙醇，4种提取溶媒对木香药材特征图谱的影响。取木香药材(s11)约0.5g，精密称定，平行4组，每组2份，置于具塞锥形瓶中，依次分别加入甲醇、80％甲醇、乙醇、稀乙醇各25ml，称定重量，超声(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足损失的重量，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。按“2.3”项下色谱条件，进样，测定，结果见表3。

表3提取溶媒考察结果

结果表明，采用上述溶剂，色谱峰的数量相差不大，但以80％甲醇、稀乙醇“总特征峰面积/取样量”最大，表明80％甲醇、稀乙醇提取能力相当，综合考虑溶剂提取能力、溶液稳定性及溶剂效应，80％甲醇是较为合适的溶剂。

3.2提取溶剂方式考察

本次实验研究主要考察了超声与回流提取两种处理方式对木香药材特征图谱的影响。取木香药材(s11)约0.5g，精密称定，平行2组，每组2份，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，分别超声(功率250w，频率40khz)30分钟、加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足损失的重量，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。按“2.3”项下色谱条件，进样，测定，结果见表4。

表4不同提取方式考察结果

结果表明，采用超声处理和加热回流两种提取方式的结果相差不大，考虑到操作的简便性，采用超声处理提取方式。

3.3提取时间考察

本次实验研究主要考察超声处理15分钟、30分钟、45分钟对木香药材特征图谱的影响。取木香药材(s11)约0.5g，精密称定，平行3组，每组2份，置于具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，分别超声(功率250w，频率40khz)15、30、45分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足损失的重量，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。按“2.3”项下色谱条件，进样，测定，结果见表5。

表5不同提取时间考察结果

结果显示，不同提取时间对特征图谱影响不大，为保证提取完全，选择超声处理30分钟。

3.4不同料液比的考察

本次实验研究主要考察了料液比为0.5g:25ml、0.5g:50ml、0.5g:100ml这3种料液比对木香药材特征图谱的影响。取木香药材(s11)约0.5g，精密称定，平行3组，每组2份，置于具塞锥形瓶中，依次分别加入25ml、50ml、100ml的甲醇，称定重量，超声处理(250w，40khz)30分钟，放冷，再称定重量，分别用甲醇补足损失的重量，摇匀，0.22μm滤膜过滤，取续滤液即得。按“2.3”项下色谱条件，进样，测定，结果见表6。

表6不同料液比考察结果

由表可知，三种料液比“总特征峰面积/取样量×体积”相差不大，结果表明，这三种料液比提取能力相当，木香药材提取完全。考虑到色谱峰的响应，选择0.5g：25ml。

4、色谱条件优化

4.1检测波长的确定

采用pda检测器进行全波长扫描，比较了238nm、254nm、280nm、327nm波长下各色谱峰的响应，结果发现254nm波长下基线平稳，峰信息量较大，各色谱峰峰型较好，327nm下含量测定指标成分3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸响应较高，分离度均较好。故选择254nm作为木香药材指纹图谱检测波长，327nm作为3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量测定波长。

4.2流动相的选择

分别考察了乙腈-0.1％甲酸、乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.05％磷酸和乙腈-水4种流动相体系，结果发现乙腈-水分离效果较差，乙腈-0.05％磷酸各色谱峰分离效果最好。

4.3柱温的考察

分别考察了25℃、30℃和35℃3个柱温对木香指纹图谱及含量测定的影响，结果发现3个柱温对木香药材3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量测定基本无影响，对指纹图谱相对保留时间基本无影响，而对相对峰面积影响较大，主要对峰2(绿原酸)和峰3的相对峰面积具有较大影响，25℃柱温不好控制，35℃时7、8号峰分离效果比30℃差。因此，选择柱温为30℃。

4.4色谱柱的考察

分别考察了agilentsbc18(100mm×2.1mm,1.8μm)、ymctraitc18(100mm×2.1mm,1.9μm)和watershsst3(100mm×2.1mm,1.8μm)3款色谱柱，经比较发现，ymctraitc18柱分离效果最好，峰型更好。

5、方法学考察

5.1精密度实验取木香供试品(s11)溶液，按“2.3”项色谱条件下重复进样6次。以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，8个共有峰的相对保留时间rsd均小于2％，相对峰面积rsd均小于5％，表明仪器精密度良好。

5.2稳定性试验取木香供试品(s11)溶液，按“2.3”项所述色谱条件分别在0、1、2、4、8、12h进样分析。以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，8个共有峰的相对保留时间rsd均小于2％，相对峰面积rsd均小于5％，表明该样品在12h内稳定。

5.3重复性试验取木香药材(s11)6份，按“2.2”项供试品溶液的配制方法处理，按“2.3”项所述色谱条件测定。以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，8个共有峰相对保留时间rsd均小于2％，相对峰面积rsd均小于5％。表明该方法重复性良好。

6、木香药材指纹图谱的建立

6.1共有峰的确定取13批木香药材样品，按“2.2”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“2.3”项下确定的色谱条件，进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对13批木香药材特征图谱进行共有峰标识，并生产对照指纹图谱。结果见图1，图2。确定具有8个共有峰，峰1：紫丁香苷(syringin)，峰2：咖啡酸(caffeicacid)，峰4(s)：3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸(3,5-o-dicaffeoylquinicacid)，峰7：木香烃内酯(costunolide)，峰8：去氢木香烃内酯(dehydrocostuslactone)；以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸为参照峰s峰，各特征峰的相对保留时间分别为：峰1：0.434、峰2：0.485、峰3：0.948、峰4：1.000、峰5：1.051、峰6：1.213、峰7：1.673、峰8：1.689，相对保留时间在规定值的±10％之内。

6.2各产地药材指纹图谱相似度评价以4个产地木香生成的共有模式(s0)为对照指纹图谱，13批次木香药材与对照指纹图谱的相似度范围为0.797～0.994，除了s2(云南大理)和s5(云南迪庆)与对照指纹图谱相似度小于0.9以外，其他各批次药材与对照指纹图谱的相似度均在0.9以上，说明其他各产地药材表现出了良好的相似度。其中四川的三批样品相似度较接近，质量稳定；云南的6批相似度差异较大，质量各异；重庆的3批相似度有差异，质量各异。结果见表7所示。

表7木香样品指纹图谱相似度评价

6.3木香样品聚类分析运用spss20.0软件对4个产地木香样品进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以夹角余弦作为样品相似度的距离公式。聚类分析将木香样品分为6类，ⅰ类包括s7、s8、s9、s11、s13，即四川样品与一批重庆及湖北样品聚为一类；ⅱ类包括s1、s4、s12，即两批云南样品及一批重庆样品聚为一类；ⅲ类包括s3、s6，即2批云南样品聚为一类；ⅳ类包括s10；ⅴ类包括s5；ⅵ类包括s2，即一批重庆样品及两批云南样品各聚为一类。总体看来，四川的木香药材质量大体相近，其他产地的差别较大，表明即使是同一产地所产木香药材，质量也不尽相同，与相似度分析的评价结果相一致。具体结果见图3。

6.4主成分分析

6.4.1共有峰主成分分析以13批样品中的8个共有峰的峰面积为数据，用spss20.0软件对其进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差，见表8，碎石图见图4。由表8可知，前2个成分的特征值大于1，即5.290和1.853，对总方差的累积贡献率达89.288％，故选择成分1和2作为第一和第二主成分，可代表木香指纹图谱共有峰的大部分信息。同时结合观察碎石图可见主成分分析中特征值的变化情况，图中曲线存在一个明显的拐点，说明前2个主成分的分析结果基本显示出了不同批次木香药材之间的相似度和差异性。初始因子载荷矩阵见表9，由表9可见，第一主成分主要反映了来自原始指标色谱峰1，2，3，4，5和6的信息，第二主成分主要反映了来自原始指标色谱峰7和峰8的信息，故仅用前2个主成分就可表示原uplc数据的主要信息。以第一、第二主成分为变量，得到二维投影图，见图5。以x轴为例，在投影图中选取距离原点较远的几个点，得到第一主成分中变量的权重值，权重值越大，该化合物在木香药材中的作用越大。其中，前3名变量的权重值分别为0.981、0.978、0.959，对应峰4(3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸)、峰2(绿原酸)和峰3。与上述分析结果一致，即可判定峰4，2，3在区分各产地木香指纹图谱中占了决定性作用。

表8主成分特征值及方差

表9主要因子载荷矩阵表

6.4.2不同产地木香药材的综合评价针对前2个主成分对木香药材进行综合评价，计算综合得分，结果见表10。排名前3的样品中，云南3批；排名前6的样品中，云南、四川各3批，分别占其总样品数的50％及100％；排名前9的样品中，云南、四川、重庆产地的样品各4、3、2批。总体来说，云南产地的木香药材质量不是很均匀，综合排名居首和尾；四川产地的木香整体上质量较优且稳定。

表10综合得分排序表

7、3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量测定

目前，对于木香药材大部分选用木香烃内酯和去氢木香烃内酯做为其含量测定指标，评价木香药材质量。木香烃内酯和去氢木香烃内酯为脂溶性成分较难转移至煎液中，而3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸因其亲水性较强，能很好的转移至煎液中。因此，本实验首次建立3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量测定方法。

7.1色谱条件

对照品的制备和供试品溶液的制备同指纹图谱中的制备方法。

色谱条件如下：以ymctrait(100mm×2.1mm，1.9μm)为色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.05％磷酸为流动相b进行梯度洗脱，流速为0.30ml/min；柱温为30℃；检测波长为327nm，梯度洗脱表见表。

7.2方法学考察

7.2.1线性关系考察分别精密吸取3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品贮备溶液5ml、2ml、1ml、0.5ml、0.2ml置10ml容量瓶中，加80％甲醇稀释至刻度，摇匀，同对照品贮备液分别按照“7.1”项下色谱条件依次进样1μl，记录色谱峰面积。以对照品峰面积为纵坐标(y)，对照品浓度为横坐标(x)。线性回归方程及相关系数为y＝13773.76366x+7181.03356，r2＝0.99997。结果表明，在4.0691μg/ml～203.4543μg/ml浓度范围内，3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸浓度与峰面积呈良好的线性关系。

7.2.2精密度考察精密吸取3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品溶液(质量浓度20.3454μg/ml)1μl，按“7.1”项所述色谱条件下重复进样6次。结果表明，3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的rsd为0.13％，表明仪器精密度良好。

7.2.3稳定性考察精密称取木香药材(s11)约0.5g，按照“2.2”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按照“7.1”项下色谱条件，分别在0，1，2，4，8，12小时进样，进样体积1μl，结果表明，样品中3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的rsd为0.60％，表明供试品溶液在12小时内稳定。

7.2.4重复性考察取木香药材(s11)6份，按“2.2”项供试品溶液的配制方法处理，按“7.1”项所述色谱条件测定，并计算3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的含量。结果表明，样品中3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量的rsd为0.97％，表明该分析方法的重复性良好。

7.2.5准确度考察取已测定含量木香药材(s11)约0.25g，精密称定，分为3组，每组平行称定3份，三组分别按1:0.5、1:1、1:1.5加入3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸对照品，按“2.2”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液9份。每份精密吸取1μl按“7.1”项下色谱条件测定，计算3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸加样回收率，结果见表11。实验结果显示3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸回收率为93.04％，表明回收率良好。

表11准确度实验结果(n＝9)

7.3样品测定取13批不同产地木香药材，按照“2.2”项下确定的供试品溶液制备方法进行处理，按“7.1”项下色谱条件测定，并计算3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸的含量结果见表12。

表12木香药材中3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量测定结果

本发明以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸为木香含量测定指标成分，从13批木香样品中可知，云南产地药材含量差异较大，而四川、重庆、湖北各产地含量差异并不大。

综上所述，本发明运用3种指纹图谱分析方法以及以3,5-o-二咖啡酰基奎宁酸含量作为指标，较全面地评价了不同产地木香的质量，为木香的质量控制研究奠定基础。