一种炒紫苏子特征图谱的构建方法及其在炒制工艺中的应用与流程

本发明属于中药领域，具体涉及一种炒紫苏子特征图谱的构建方法及其在炒制工艺中的应用。

背景技术：

紫苏子为唇形科植物紫苏perillafrutescens(l.)britt.的干燥成熟果实，秋季果实成熟时采收，除去杂质，晒干，紫苏资源在我国分布范围较广，分布于广东、广西、湖北、云南、贵州、四川、台湾、浙江、安徽、福建等省区，紫苏属植物喜温、短日照，适应能力强，目前在我国的东北、西北、东南及西南地区21个省均有种植。其性温，味辛，具有降气化痰，止咳平喘，润肠通便的功能，临床主要用于痰壅气逆，咳嗽气喘，肠燥便秘等。

目前对紫苏子的炮制工艺多为清炒，如中国药典2015版紫苏子饮片项下为“取净紫苏子，照清炒法，炒至有爆声”，天津市中药饮片炮制规范炒紫苏子炮制规范为“将锅加热，取净苏子置锅内，炒至表面顔色加深，嗅有香气逸出时，取出，放凉”。湖南省中药饮片炮制规范为“取净苏子，用文火炒至有爆声，取出，放凉”。上海市中药饮片炮制规范为“取生紫苏子，照清炒法，炒至有爆声”。而上述这些经验性的术语难以进行量化控制，均未对炒制过程进行规范化说明。

本发明通过建立炒紫苏子的特征图谱的测定方法，基于主成分分析，结合特征图谱方法对紫苏子炒制工艺进行研究，优化了紫苏子的炒制工艺，为炒制过程的规范化提供了依据。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于提供一种炒紫苏子特征图谱的构建方法，该方法重现性良好，准确可靠。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种炒紫苏子特征图谱的构建方法，包括如下步骤：

(a)混合对照品溶液的制备：取咖啡酸、迷迭香酸、木犀草素对照品适量，加甲醇制成每ml分别含咖啡酸2μg、迷迭香酸40μg、木犀草素5μg的混合对照品溶液；

(b)供试品溶液的制备：分别取炒紫苏子饮片约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理15-45分钟，放冷，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.1％甲酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；进样量：2μl；柱温为30℃；检测波长为330nm；

(d)炒紫苏子对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立炒紫苏子对照特征图谱，确定具有9个特征峰，峰1、峰2、峰3、峰4、峰x1、峰x2、峰5、峰6、峰7，以峰6为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.32、0.43、0.73、0.88、0.95、0.96、0.97、1.0、1.17，其相对保留时间应在规定值的±10％内。

所述特征峰归属为：峰2为咖啡酸，峰6为迷迭香酸，峰7为木犀草素。

进一步优选的，所述供试品溶液的制备：取炒紫苏子饮片过二号筛，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，超声功率为250w，超声频率为40khz，放冷，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

本发明还提供了一种炒紫苏子特征图谱的构建方法在炒制工艺中的应用，根据构建的炒紫苏子特征图谱方法，对特征峰峰面积进行主成分分析，选择特征值>1的指标为主成分，提取出两个主成分，根据对主成分的影响大小及炒制前后的成分差异，选择考察炒制工艺的指标特征峰分别为：峰x1、峰x2、迷迭香酸和木犀草素，以迷迭香酸含量及基于4个指标特征峰峰面积/称样量标准化值为指标，确定紫苏子的炒制工艺。

优选的，所述炒紫苏子中，迷迭香酸的含量不得低于0.20％。迷迭香酸的含量按照中国药典2015版紫苏子项下[含量测定]进行。以agilentsbc18(4.6mm×150mm，5μm)为色谱柱；以甲醇-0.1％甲酸溶液(40∶60)为流动相；检测波长为330nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000。

优选的，所述紫苏子的炒制工艺为：控制锅温为190℃，电陶炉功率为1000w，炮制时间4分钟，翻炒频率为60次/分钟。

进一步优选的，所述物料温度控制在155℃～160℃。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明针对紫苏子炒制过程存在的问题，建立了炒紫苏子的特征图谱，该方法重现性良好，准确可靠，基于主成分分析，结合建立炒紫苏子的特征图谱的测定方法，优化了紫苏子的炒制工艺，为炒制过程的规范化提供了依据。

附图说明

图1为9批炒紫苏子特征图谱叠加图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1：一种炒紫苏子特征图谱的构建方法

1、仪器与试药

电陶炉(江苏九阳，h22-x3)，炒锅，waters高效液相色谱仪(沃特斯公司，waterse2695)，waters超高效液相色谱仪(沃特世公司，h-class)，agilentsbc18色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)，watersbehc18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，agilentsbc18色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，ymctrait色谱柱(2.1mm×100mm，1.9μm)，，万分之一天平(梅特勒-托利多公司，me204e)，百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，xp26)，电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，hws-28)，数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，超纯水系统(默克股份有限公司，milli-qdirect)。

咖啡酸(批号：110885-201703，纯度：99.7％，中国食品药品检定研究院)；迷迭香酸(批号：110871-201706，纯度：90.5％，中国食品药品检定研究院)；

木犀草素(批号：111520-201605，纯度：99.6％，中国食品药品检定研究院)。

2、色谱条件与供试品溶液的制备

2.1色谱条件：色谱柱：agilentsbc18(2.1mm×100mm，1.8μm)；进样量：2μl；柱温：30℃；检测波长：330nm；以乙腈为流动相a，0.1％甲酸溶液为流动相b，按表1规定进行梯度洗脱，流速：0.3ml/min。

表1梯度洗脱表

2.2供试品溶液的制备：取炒紫苏子饮片(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，放冷，用80％甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3、供试品溶液制备方法考察

3.1提取溶剂考察取炒紫苏子饮片(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、乙醇、80％甲醇、50％甲醇、稀乙醇作为提取溶剂，称定重量，超声处理30分钟，放冷，分别用甲醇、乙醇、80％甲醇、50％甲醇、稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实验结果：其中50％甲醇及稀乙醇对木犀草素提取效率不高，甲醇及乙醇对前6号峰提取效率均不高，整体以80％甲醇提取效率较高，故选取80％甲醇作为提取溶剂。

3.2提取时间考察取炒紫苏子饮片(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，分别超声处理15分钟、30分钟、45分钟，放冷，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实验结果：通过对比不同超声时间的特征图谱，发现15分钟、30分钟、45分钟对色谱峰的提取效率相当，为保证提取充分，故选取超声时间为30分钟。

3.3提取方式考察取炒紫苏子饮片(过二号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，称定重量，分别超声处理30分钟或加热回流30分钟，放冷，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

实验结果：通过对比超声与加热回流两种提取方式的特征图谱，可发现提取方式对特征图谱的影响较小，两者的提取效率相当，因超声方式较为方便，故选择超声提取作为提取方式。

4、色谱条件的确定

4.1最佳吸收波长的确定通过对比254nm、330nm、360nm3种检测波长色谱图、色谱峰的完整体及特征性，254nm、360nm时，色谱峰数量及响应较330nm时较差，最终确定以检测波长330nm时，酚酸类成分及黄酮类成分吸收较好，故选取330nm作为检测波长。

4.2流动相的考察本次实验选取乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸、乙腈-0.2％甲酸、甲醇-0.1％甲酸四种流动相进行比较。乙腈-水、甲醇-0.1％甲酸体系色谱峰分离度较乙腈-0.1％甲酸体系较差，乙腈-0.1％甲酸、乙腈-0.2％甲酸两者相近，发现选取乙腈-0.1％甲酸流动相时，各色谱峰分离度较好，故选取乙腈-0.1％甲酸溶液作为流动相。

5、方法学考察

5.1专属性考察

取炒紫苏子(过二号筛)适量，约0.5g，精密称定，制备供试品溶液，分别取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液，各进样2μl，结果表明，该分析方法能正确检测所指认的特征峰，不受提取溶剂的干扰。

5.2仪器精密度考察

取炒紫苏子供试品溶液，按照上述色谱条件重复进样6次，进样体积2μl，以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的rsd<2％，该仪器精密度良好。

5.3稳定性考察

取供试品溶液，按照上述色谱条件，分别在0，2，4，8，12小时进样，进样体积2μl，以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果，12小时内各色谱峰相对保留时间<1％，相对峰面积的rsd<5％，该供试品溶液在12小时内基本稳定。

5.4重复性考察

取同一批样品约0.5g，精密称定，平行6份，制备供试品溶液，分别进样2μl。以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积，结果，各色谱峰相对保留时间<1％，相对峰面积的rsd<5％，说明该方法重复性较好。

6、耐用性实验

6.1不同色谱柱的考察

取供试品溶液，分别取ymctriartc18(2.1mm×100mm，1.9μm)、watershsst3(2.1mm×100mm，1.8μm)、agilentsbc18(2.1mm×100mm，1.8μm)色谱柱，分别进样2μl。比较色谱峰性能参数，结果表明采用不同粒径色谱柱，各色谱峰色谱分离度均能达到分析要求，且理论塔板数以agilentsbc18较高，因此本方法可以采用上述三种超高效液相色谱柱。

6.2不同柱温的考察

取同一供试品溶液，采用同一色谱柱和液相色谱仪，设置柱温分别为28℃、30℃、32℃，分别进样2μl。以迷迭香酸峰为参照峰，计算其他特征峰相对保留时间及相对峰面积。结果显示不同柱温时，各色谱峰相对保留时间<3％，相对峰面积rsd<5％，结果表明该分析方法不同柱温耐用性良好。

6.3不同流速的考察

取供试品溶液，分别设置流速分别为0.28ml/min、0.30ml/min、0.32ml/min，分别进样2μl。以迷迭香酸峰为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积。结果显示不同流速时各色谱峰相对保留时间rsd在0.16％～3.80％范围内，结果表明该分析方法不同流速耐用性较好。流速小的变动基本能满足系统适用性要求。

7.炒紫苏子特征图谱的建立

将9批炒紫苏子饮片按照上述方法进行测定，得到相对保留时间及相对峰面积结果见表2、3。发现在峰4后，明显产生特征峰x1、x2，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，生成对照图谱，建立炒紫苏子对照特征图谱，如图1所示，确定具有9个特征峰，峰1、峰2、峰3、峰4、峰x1、峰x2、峰5、峰6、峰7，以峰6为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.32、0.43、0.73、0.88、0.95、0.96、0.97、1.0、1.17，其相对保留时间应在规定值的±10％内。其中，峰2为咖啡酸，峰6为迷迭香酸，峰7为木犀草素。

表29批炒紫苏子特征图谱结果(相对保留时间)

表39批炒紫苏子特征图谱结果(相对峰面积)

结果表明，不同试验号样品的相对保留时间rsd值在0.02％～0.74％，偏差较小，相对峰面积rsd值在4.68％～128.07％，波动较大，说明不同炮制工艺间样品特征图谱差异较大，进一步推断，不同炮制工艺对紫苏子化学成分存在一定的影响。

实施例2：炒紫苏子特征图谱的构建方法在炒制工艺中的应用

对9批炒紫苏子饮片9个特征峰峰面积/称样量测定，结果见表4所示。

表49批炒紫苏子特征图谱峰面积/称样量

应用spss20.0软件对炒紫苏子的特征峰峰面积进行主成分分析，选择特征值>1的指标为主成分，结果提取出两个主成分，累积贡献率达到94.56％。结果见表5。其中f8即迷迭香酸对主成分1影响较大，f9木犀草素对主成分2影响较大，结果见表6。由于峰x1、峰x2在炮制前后差异较大，因此以峰x1、峰x2、迷迭香酸及木犀草素为指标考察紫苏子的炮制工艺。最终得到炮制工艺指标值见表7。

表5解释的总方差

提取方法：主成份分析。

表6旋转成份矩阵a

提取方法:主成份。

旋转法:具有kaiser标准化的正交旋转法。

a.旋转在3次迭代后收敛。

表79批不同炒紫苏子样品各指标值

将9份样品的含量、各特征峰的相对峰面积数据，按公式xij’＝xij/xijmax进行标准化处理，xij’为样品中第i类成分j的标准化值，xij为样品中第i类成分j的值，xijmax为样品中第i类成分j的最大值。经文献研究，紫苏子经炒制后，总黄酮含量较生品增加，而迷迭香酸因受热易分解，因此按照炮制工艺选择中的主次地位，赋予不同的加权系数，以标准化后的值xij’加权后求和，及综合评价指标y＝峰x1*10％+峰x2*15％+迷迭香酸*35％+木犀草素*40％)，结果见表8。

表89批不同炒紫苏子样品标准化指标处理结果

进一步将y值代入正交试验表，以电陶炉功率w(a)、炒制时间min(b)和翻炒频率次/min(c)为考察因素，每个因素取3个水平，进行正交设计，正交试验结果见表9，得到方差分析结果见表10。

表9正交试验结果表

表10方差分析表

f0.05(2,2)＝19.00f0.01(2,2)＝99.00

直观分析结果表明，三因素对结果影响的大小顺序为：电陶炉功率>翻动频率>炮制时间。方差分析结果表明，影响因素a的水平变化对于炮制工艺实验结果有显著影响，综合得到最佳炮制工艺为a3b1c2，即控制锅温为190℃，电陶炉功率为1000w，炮制时间4分钟，翻炒频率为60次/分钟。

另平行称取三批紫苏子，按照上述炒制工艺，进行炒制，得到三批样品工艺验证，按照中国药典2015版紫苏子项下[含量测定]进行含量测定，以agilentsbc18(4.6mm×150mm，5μm)为色谱柱；以甲醇-0.1％甲酸溶液(40∶60)为流动相；检测波长为330nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000。结果见表11，特征图谱相对保留时间及相对峰面积见表12、13。

表11炒制工艺验证含量测定结果

表12炒制工艺验证特征图谱结果(相对保留时间)

表13炒制工艺验证特征图谱结果(相对峰面积)

结果表明，三批样品工艺验证迷迭香酸含量测定均值为0.325％，rsd值为1.11％，说明，三批样品含量无明显差异，三批样品相对保留时间rsd值在0.00％～1.30％，说明各特征峰相对保留时间偏差较小，但相对峰面积rsd值波动较大，可能与峰面积较小有关。整体来看，三批样品炮制工艺的重现性较好。

另外，从表2和表3中试验号1～9相对峰面积结果还可以看出，峰1、峰2(咖啡酸)、峰3的相对峰面积均呈现明显下降趋势，峰4、峰5的相对峰面积变化较为平缓，而峰x1、x2的相对峰面积呈现明显梯度性上升趋势，推测两者的峰面积变化与温度有关，存在一个温度拐点。结合试验号1～9物料的出锅温度来看，其中试验号1的出锅温度为110℃，试验号2～3的出锅温度为125℃～130℃，试验号4～5的出锅温度为140℃～145℃，试验号6的出锅温度为157.2℃，试验号7的出锅温度为170℃，试验号6的出锅温度为185℃，试验号6的出锅温度为200℃，推定该温度拐点可能在155℃～160℃。因此，基于主成分分析，结合特征图谱方法对紫苏子炒制工艺进行研究发现，当物料温度为155℃～160℃时，紫苏子炒制工艺较为合理，且紫苏子与炒紫苏子特征图谱能体现两者成分差异，说明“逢子必炒”的合理性及规范化说明。