白术特征图谱构建方法和质量检测方法与流程

本发明属于中药检测
技术领域：
，具体涉及白术特征图谱构建方法和质量检测方法。
背景技术：
：白术为菊科植物白术(atractylodesmacrocephalakoidz)的干燥根茎，是我国传统常用补益类中药，具有健脾益气、燥湿利水、止汗和安胎等功效。随着人民群众健康保健意识的增强，人们对中药产品的质量和安全性等有了更高的要求。目前，白术药材质量标准包括简单的性状、鉴别、常规检查和浸出物测定等方面，还包括高效液相指纹图谱的测定。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的、评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。中国专利文献cn102680631b公开了一种白术药材的检测方法，采用高效液相色谱法对白术药材的水煎液进行指纹图谱的检测，由于水煎液中取得的化学成分比纯有机溶剂提取时更加完全检测的成分更加完全，因此可以得到理想的指纹图谱，对白术进行尽可能全面的成分质量监控。指纹图谱的作用主要是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。色谱专家认为应该分离度越高越好，分出的峰越多越好；信息处理专家也认为给出的数据越多越好。但国际协调会议关于定量分析的精密度和准确度的问题说“分析的结果并非越精密越准确越好，而是达到分析对象的要求即可”，即指纹图谱的峰不是越多越好，而是达到构成指纹特征的目的即可。据报道，白术主要有效成分集中在挥发油及白术内酯两大类成分上，其中苍术酮占挥发油类成分的31％～60％，可作为挥发油的代表物质；内酯类成分中白术内酯ⅰ、白术内酯ⅱ、白术内酯ⅲ含量较高，且具有良好的药理作用。如果以有效成分为指标，将有效成分的指纹图谱技术作为中药的检测手段，这将使以复方配伍为主要特点的中医用药疗效更为可靠、质量更为可控，药效物质基础更为明确，同时，重金属及有害元素、农药残留量等安全性指标在实际应用过程中具有重要的影响，影响用药安全，现有技术并没有针对白术有效性和安全性的全面的质量控制标准。技术实现要素：因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的白术的指纹图谱没有对有效成分进行针对性检测和有效性检测的缺陷，从而提供一种针对白术有效成分的特征图谱构建方法，。本发明要解决的另一个技术问题在于克服现有技术中的白术质量检测针对性和全面性差的缺陷，从而提供一种全面白术质量控制方法，从安全性和有效性两个方面来评价白术药材的质量。因此，本发明公开了一种白术特征图谱构建方法，包括以下步骤，供试品溶液的制备：取白术供试样品制备供试品溶液；参照物溶液的制备：取白术药材制备对照药材参照物溶液；取白术内酯ⅰ和白术内酯ⅲ对照品制备对照品参照物溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照以下程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为45％-55％：55％-45％→45％-55％：55％-45％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为45％-55％：55％-45％→60-70％：40％-30％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为60-70％：40％-30％：60-70％：40％-30％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为60-70％：40％-30％→78％-82％：22％-18％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为78％-82％：22％-18％→83％-87％：17％-13％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为83％-87％：17％-13％→88％-92％：12％-8％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为88％-92％：12％-8％→88％-92％：12％-8％；柱温为25-35℃；流速为0.8-1.2ml/min；检测波长为233-243nm；测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。优选的，还包括白术对照特征图谱的构建，包括对至少15批白术供试样品检测得到的特征图谱，利用国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成白术对照特征图谱，并标记共有特征峰。优选的，所述白术特征图谱包括5个共有特征峰，共有特征峰为：1号峰为白术内酯ⅲ，2号峰为共有特征峰，3号峰为白术内酯ⅱ，4号峰为白术内酯ⅰ，5号峰为苍术酮；以1号峰白术内酯ⅲ为参照峰，各峰号相对保留时间分别为：1号峰：1.00，2号峰：1.74，3号峰：1.84，4号峰：2.16，5号峰：3.07。优选的，所述供试品溶液的制备方法包括以下步骤：取白术供试样品制成粉末，过筛，称定0.3-0.8g，加入溶剂15-25ml，超声或冷浸20-60min，静置，补足减失的溶剂，取上清液滤过，取续滤液；优选的，所述白术供试样品包括白术中药材、白术饮片或麸炒白术饮片；优选的，所述溶剂选自正己烷或者甲醇；所述溶剂体积分数不小于60％；优选的，在所述超声处理步骤中，功率为200-300w，频率为30-50khz；优选的，在所述上清液滤过步骤中所采用的滤膜的微孔大小为0.22-0.45μm。优选的，所述对照药材参照物溶液的制备方法如下：取白术对照药材制成粉末，过筛，精密称定0.3-0.8g，加入溶剂15-25ml，超声或冷浸20-60min，静置，补足减失的溶剂，取上清液滤过，取续滤液；所述对照品参照物溶液的制备方法如下：分别取白术内酯ⅰ和白术内酯ⅲ，精密称定，加溶剂制成每lml含白术内酯ⅰ4-6μg、白术内酯ⅲ8-12μg的混合对照品溶液，即得；优选的，所述溶剂选自正己烷或者甲醇；所述溶剂体积分数不小于60％；优选的，在所述超声处理步骤中，功率为200-300w，频率为30-50khz；优选的，在所述上清液滤过步骤中所采用的滤膜的微孔大小为0.22-0.45μm。优选的，所述色谱条件与系统适用性试验步骤中使用的c18色谱柱选自watersxbridge-c18色谱柱、agilentzorbaxsb-c18色谱柱或kromasil100-5-c18色谱柱。本发明还公开了上述白术特征图谱构建方法在白术药材、白术炮制品或白术相关制品的质量检测中的用途。本发明还公开了一种白术质量检测方法，包括采用上述白术特征图谱构建方法对白术产品进行质量检测，所述白术产品包括白术药材、白术炮制品或白术相关制品。优选的，按照权利要求1-6任一项所述的白术特征图谱构建方法同法操作检测待测白术产品及白术对照药材、对照品，得到相应的特征图谱，将待测白术产品特征图谱与白术对照药材特征图谱、对照品特征图谱相对比，评价其质量。优选的，还包括对白术进行薄层色谱法鉴别的步骤，包括如下步骤：待测溶液和参照药材溶液：取待测白术产品和白术对照药材制成粉末各取0.3-0.8g，加溶剂1-4ml，超声5-40min，滤过，补足溶剂，取滤液，为待测溶液和参照药材溶液；对照品溶液：取白术内酯i对照品、白术内酯ii对照品和白术内酯iii对照品，加溶剂制成浓度为0.5-3mg/ml白术内酯i对照品溶液、0.5-3mg/ml白术内酯ⅱ对照品溶液和0.5-3mg/ml白术内酯ⅲ对照品溶液；鉴别：吸取待测溶液3-10μl、参照药材溶液3-10μl、白术内酯i对照品溶液1-5ul、白术内酯ⅱ对照品溶液1-5ul和白术内酯ⅲ对照品溶液1-5ul分别点于同一薄层板上，以石油醚：丙酮的体积比例为3-4:1的展开剂展开，取出，晾干，喷以5％-10％的香草醛硫酸溶液或硫酸乙醇溶液，在100-110℃加热至斑点显色清晰，置波长为366nm紫外光下检视；优选的，所述白术产品选自白术药材、白术饮片或麸炒白术饮片；优选的，所述溶剂选自甲醇或正己烷；优选的，所述薄层板选用硅胶g板、h板；优选的，所述展开剂石油醚：丙酮的体积比为3.5:1。优选的，还包括对白术进行含量测定的步骤，所述含量测定包括白术内酯ⅰ与白术内酯ⅲ的含量测定，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取白术待测样品制备供试品溶液；参照物溶液的制备：取白术参照药材制成对照药材参照物溶液，取白术内酯ⅰ和白术内酯ⅲ制备对照品参照物溶液；标准溶液的制备：取白术内酯ⅰ和白术内酯ⅲ制成混合标准溶液，并经连续稀释制成白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ的标准溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照以下程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为45％-55％：55％-45％→45％-55％：55％-45％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为45％-55％：55％-45％→60-70％：40％-30％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为60-70％：40％-30％：60-70％：40％-30％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为60-70％：40％-30％→78％-82％：22％-18％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为78％-82％：22％-18％→83％-87％：17％-13％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为83％-87％：17％-13％→88％-92％：12％-8％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为88％-92％：12％-8％→88％-92％：12％-8％；柱温为25-35℃；流速为0.8-1.2ml/min；在波长220nm处检测白术内酯ⅲ，在波长276nm处检测白术内酯ⅰ；测定法：分别精密吸取经连续稀释的标准溶液注入液相色谱仪，测定，绘制标准曲线，计算回归方程；分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液注入液相色谱仪，测定，计算待测白术样品的白术内酯ⅰ和白术内酯ⅲ的含量。优选的，还包括对白术进行重金属、有害元素或农药残留含量测定的步骤，所述重金属及有害元素检查包括重金属铅、镉、砷、汞、铜的含量测定；所述农药残留检测包括总六六六、总滴滴涕和五氯硝基苯的测定。本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明所述的白术特征图谱构建方法，采用乙腈(a)-水(b)为流动相，在该流动相作用下，色谱图基线平稳，通过反复试验得到洗脱程序，严格控制高效液相色谱的条件，采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，根据收集的三维图谱，综合考察，发现233-243nm波长处的各色谱峰相应比较均衡，确定238nm为白术药材指纹图谱的检测波长，在所述的洗脱条件下，克服了由于化学成分复杂造成的干扰以致不能全面的、清楚的对所述白术药材或其炮制品、相关制品的质量进行检测的缺陷，使白术内酯ⅰ、白术内酯ⅱ、白术内酯ⅲ、苍术酮等有效成分的特征色谱峰实现有效的分离，峰形良好且无干扰，其中，白术内酯ⅰ的特征峰与杂质峰的分离度达到1.56，从而实现了全面的、清楚的对所述白术药材和白术饮片进行有效性的质量检测，进一步实现了白术质量的控制，且该质量检测方法具有简单快速、稳定可靠、精密度高、重现性好、易于掌握等优点。2.本发明所述的白术的特征图谱构建方法，采用白术药材和白术饮片作为供试原料，不合格的白术样品不能进入后续的应用程序，从源头对白术样品进行检测，提高质量检测的实际应用价值；将白术样品制成粉末，溶剂选用正己烷和甲醇，溶解效果好，易过滤，提取方式选用超声或冷浸，溶出率高，通过进一步对溶剂用量、提取时间的考察，选择了适于白术药材的有效成分提取方法，使得获得的供试品溶液更有利于药物的质量检测，使得检测得到的色谱更精确、稳定、可靠，且该处理方法具有方便，操作简单等优点。3.本发明所述的白术质量检测方法，包括薄层色谱法鉴别，快速定性地检测白术样品，重金属及有害元素检查、农药残留检测，能够从用药安全的角度对白术进行质量控制，通过白术特征图谱检测方法建立对照指纹图谱和有效成分的含量测定，对白术的特征有效成分进行质量检测，通过对白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ的含量测定，使得对所述白术药材或其炮制品、相关制品的质量检测更全面，保证了所述白术药材或其炮制品、相关制品质量的有效性和可控性；本发明所述的白术药材或其炮制品、相关制品的质量控制方法，通过对白术内酯ⅰ、白术内酯ⅱ、白术内酯ⅲ、苍术酮等5个特征峰进行鉴别，使得对所述白术药材或其炮制品、相关制品的质量检测更全面，有利于对有效成分的全面监控，进一步保证了所述白术药材或其炮制品、相关制品质量的可控性；4.本发明所述的白术药材或其炮制品、相关制品的质量检测方法，通过对供试品溶液进行提取方法、展开剂种类及比例、显色方法等考察，选择了适于所述白术药材或其炮制品、相关制品的薄层鉴别方法，使得检测得到的薄层图谱更清晰、稳定，且该处理方法具有操作简单、方便等优点；5.本发明所述的白术药材或其炮制品、相关制品的质量检测方法，通过对该药材的重金属及有害元素、农药残留量限度的规定，实现了对白术药材或其炮制品、相关制品质量安全性的控制。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例1中对照品的特征图谱；图2是本发明实施例1中对照药材的特征图谱；图3是本发明实施例1中待测白术药材的特征图谱；图4是本发明实施例1中18个白术样品的对照特征图谱；图5是本发明实施例4薄层色谱法鉴定结果；图6是本发明实施例7中276nm波长下的白术内酯ⅰ对照品溶液的液相色谱谱图；图7是本发明实施例7中220nm波长下的白术内酯ⅲ对照品溶液的液相色谱谱图；图8是本发明实施例7中276nm波长下的供试品溶液的液相色谱谱图；图9是本发明实施例7中220nm波长下的供试品溶液的液相色谱谱图；图10是本发明实验例中采用药典方法得到的薄层色谱图；图11是本发明实验例中低温考察实验中的薄层色谱图；图12是本发明实验例中湿度考察实验中18％环境下的薄层色谱图；图13是本发明实验例中湿度考察实验中18％环境下的薄层色谱图；图14是本发明实验例中专属性考察实验中的薄层色谱图；图15是本发明实验例中耐用性考察实验中采用青岛海洋化工分厂硅胶g薄层板鉴别的薄层色谱图；图16是本发明实验例中耐用性考察实验中采用烟台市化学工业研究所硅胶g薄层板鉴别的薄层色谱图；图17是本发明实验例中重现性性考察实验中的薄层色谱图；图18是本发明实验例中重现性性考察实验中的薄层色谱图；图19是本发明实验例中白术药材含量测定实验中白术内酯ⅲ在220nm紫外吸收谱图；图20是本发明实验例中白术药材含量测定实验中白术内酯ⅰ在276nm紫外吸收谱图；图21是本发明实验例中白术药材含量测定实验中甲醇-水为流动相时、检测220nm波长下供试品色谱图；图22是本发明实验例中白术药材含量测定实验中乙腈-水为流动相的检测220nm波长下供试品色谱图；图23是本发明实验例中白术药材含量测定实验中选用梯度洗脱程序(1)、检测276nm波长下供试品色谱图；图24是本发明实验例中白术药材含量测定实验中选用梯度洗脱程序(1)、检测220nm波长下供试品色谱图；图25是本发明实验例中白术药材含量测定实验中选用梯度洗脱程序(2)、检测220nm波长下供试品色谱图；图26是图25的局部放大图；图27是本发明实验例中白术药材含量测定实验中选用梯度洗脱程序(2)、检测276nm波长下供试品色谱图；图28是图27的局部放大图；图29是本发明实验例中白术药材含量测定实验中白术内酯ⅰ标准曲线图；图30是本发明实验例中白术药材含量测定实验中白术内酯ⅲ标准曲线图；图31是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测的三维图谱；图32是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中以甲醇-水为流动相时的特征图谱；图33是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中以乙腈-水为流动相时的特征图谱；图34a是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(1)的供试品色谱图；图34b为图34a的局部放大图；图35a是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中选用梯度洗脱程序(2)的供试品色谱图；图35b为图34a的局部放大图；图36是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中稳定性试验结果；图37是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中精密度试验结果；图38是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中重复性试验结果；图39是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中18批次样品的特征图谱；图40是本发明实验例中白术hplc特征图谱的考察实验中生成的对照特征图谱。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。本发明实施例及实验例采用的实验仪器与试剂见表1.表1实验仪器与试剂统计表实验仪器与试剂型号高效液相色谱仪waterse2695-2998pda色谱柱watersxbridge-c18、agilentzorbaxsb-c18、kromasil100-5-c18甲醇分析纯，北京化工厂正己烷分析纯，北京化工厂乙腈色谱纯，merck，德国水自制超纯水白术内酯ⅰ对照品中国食品药品检定研究院：111975-201501，质量百分数99.9％白术内酯ⅲ对照品中国食品药品检定研究院：111978-201501，质量百分数99.9％白术药材来自于浙江、安徽、河北、河南、湖南、江西等地白术饮片来自于浙江、安徽、河北、等地麸炒白术饮片来自于浙江、安徽、河北、湖北等地实施例1本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括采用白术特征图谱构建方法，对白术产品进行质量检测，包括如下步骤：供试品溶液a的制备：取产自浙江、安徽、湖北、湖南、河北、河南的白术药材样品6份、白术饮片样品6份和麸炒白术饮片样品6份，共18份样品，各自制成粉末，过六号筛，精密称定0.5g，加入甲醇(分析纯)20ml，超声40min，功率为250w，频率为40khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得各样品的供试品溶液a；待测样品的供试品溶液b制备：取需要进行质量检测的白术药材样品，按照上述供试品溶液a的制备方法，制得待测白术药材样品的供试品溶液b；参照物溶液的制备：取白术参照药材制成粉末，过六号筛，精密称定0.5g，加入甲醇(分析纯)20ml，超声40min，功率为250w，频率为40khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液；精密称定白术内酯ⅰ对照品0.5mg、白术内酯ⅲ对照品1mg，加甲醇(分析纯)20-50ml溶解，定容至100ml，制成含白术内酯ⅰ5ug/ml、白术内酯ⅲ10μg/ml的混合对照品溶液，即得对照品参照物溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择watersxbridgec18(4.6×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为50％：50％→50％：50％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为50％：50％→65％：35％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为65％：35％→65％：35％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为65％：35％→80％：20％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为80％：20％→85％：15％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为85％：15％→90％：10％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为90％：10％→90％：10％；柱温为35℃；流速为1ml/min；检测波长为238nm；测定法：分别吸取对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液、18份样品的供试品溶液a和待测白术药材样品的供试品溶液b10ul，注入液相色谱仪，测定得到对照品的特征图谱，如图1所示；对照药材的特征图谱，如图2所示、待测白术药材样品的特征图谱，如图3所示；和18份样品的各自的特征图谱；将得到的18份样品的特征图谱，采用中位数法，时间窗参数为0.30，由国家药典委员会的中药色谱指纹图谱相似度评价系统生成对照特征图谱，(如图4所示)，所述白术样品的对照特征图谱包括5个共有特征峰，共有特征峰为：1号峰为白术内酯ⅲ，2号峰为共有特征峰，3号峰为白术内酯ⅱ，4号峰为白术内酯ⅰ，5号峰为苍术酮；以1号峰为白术内酯ⅲ参照峰，各峰号相对保留时间分别为：1号峰：1.00，2号峰：1.74，3号峰：1.84，4号峰：2.16，5号峰：3.07。对得到的待测白术样品的特征图谱进行分析，将其与对照品特征图谱、对照药材特征图谱和对照特征图谱进行对比，以评价该待测白术药材的质量。实施例2本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括采用白术特征图谱构建方法，对白术产品进行质量检测，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取产自河北的待测白术饮片制成粉末，过六号筛，精密称定0.3g，加入正己烷(分析纯)20ml，超声20min，功率为300w，频率为50khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.22um的滤膜滤过，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：取白术参照药材制成粉末，过六号筛，精密称定0.3g，加入正己烷(分析纯)20ml，超声20min，功率为200w，频率为30khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液；精密称定白术内酯ⅰ对照品0.5mg、白术内酯ⅲ对照品1mg，加正己烷(分析纯)20-50ml溶解，定容至100ml，制成含白术内酯ⅰ4ug/ml、白术内酯ⅲ8μg/ml的混合对照品溶液，即得对照品参照物溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照以下程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为45％：55％→45％：55％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为45％：55％→60％：40％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为60％：40％→60％：40％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为60％：40％→78％：22％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为78％：22％→83％：17％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为83％：17％→88％：12％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为88％：12％→88％：12％；柱温为25℃；流速为8ml/min；检测波长为233nm；测定法：分别吸取对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液和供试品溶液5ul，注入液相色谱仪，测定，得到待测白术饮片的特征图谱，将其与对照品特征图谱、对照药材特征图谱进行对比，以评价该待测白术饮片的质量。实施例3本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括采用白术特征图谱构建方法，对白术产品进行质量检测，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取产自浙江的待测麸炒白术饮片制成粉末，过六号筛，精密称定0.8g，加入甲醇(体积分数为60％)25ml，冷浸60min，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：取白术参照药材制成粉末，过六号筛，精密称定0.8g，加入甲醇(体积分数为60％)25ml，冷浸60min，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液；精密称定白术内酯ⅰ对照品0.5mg、白术内酯ⅲ对照品1mg，加甲醇(体积分数为60％)20-50ml溶解，定容至100ml，制成含白术内酯ⅰ6ug/ml、白术内酯ⅲ12μg/ml的混合对照品溶液，即得对照品参照物溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择kromasil100-5-c18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照以下程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为55％：45％→55％：45％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为55％：45％→70％：30％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为70％：30％→70％：30％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为70％：30％→82％：18％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为82％：18％→87％：13％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为87％：13％→92％：8％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为92％：8％→92％：8％；柱温为35℃；流速为1.2ml/min；检测波长为243nm；测定法：分别吸取对照品参照物溶液、对照药材参照物溶液和供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，得到待测白术饮片的特征图谱，将其与对照品特征图谱、对照药材特征图谱进行对比，以评价该待测麸炒白术的质量。实施例4本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括白术的薄层色谱鉴别步骤，具体包括如下步骤：待测溶液和参照药材溶液：取待测白术产品和白术对照药材制成粉末各取0.5g，加甲醇(分析纯)溶剂2ml，超声15min，功率为250w，频率为50khz，滤过，补足溶剂，取滤液，即得待测溶液和参照药材溶液；所述白术产品为白术药材、白术饮片和麸炒白术饮片按照上述方法分别制成待测白术药材溶液、待测白术饮片溶液和待测麸炒白术饮片溶液；取白术内酯i对照品加甲醇溶剂(分析纯)制成浓度为1mg/ml白术内酯i对照品溶液；取白术内酯ii对照品加甲醇溶剂(分析纯)制成浓度为1mg/ml白术内酯ⅱ对照品溶液；取白术内酯iii对照品加甲醇溶剂(分析纯)制成浓度1mg/ml白术内酯ⅲ对照品溶液；鉴别：吸取参照药材溶液5ul、待测白术药材溶液5μl、待测白术饮片溶液5ul、待测麸炒白术饮片溶液5ul，白术内酯i对照品溶液1μl、白术内酯ⅱ对照品溶液1μl和白术内酯ⅲ对照品溶液1μl分别点于同一硅胶g薄层板上，体积比为3.5:1的石油醚(60～90℃)-丙酮展开剂展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇，在105℃加热至斑点显色清晰，置波长为366nm紫外光下检视，结果如图5所示，其中，1-白术内酯i；2-白术内酯ii；3-白术对照药材；4-白术药材；5-白术饮片；6-麸炒白术饮片；7-白术内酯iii。实施例5本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括白术的薄层色谱鉴别步骤，具体包括如下步骤：待测溶液和参照药材溶液：取待测白术产品和白术对照药材制成粉末各取0.3g，加甲醇(分析纯)溶剂4ml，超声40min，功率为200w，频率为30khz，滤过，补足溶剂，取滤液，即得待测溶液和参照药材溶液；所述白术产品为白术药材、白术饮片和麸炒白术饮片按照上述方法分别制成待测白术药材溶液、待测白术饮片溶液和待测麸炒白术饮片溶液；取白术内酯i对照品加甲醇溶剂(分析纯)制成浓度为0.5mg/ml白术内酯i对照品溶液；取白术内酯ii对照品加甲醇溶剂(分析纯)制成浓度为0.5mg/ml白术内酯ⅱ对照品溶液；取白术内酯iii对照品加甲醇溶剂(分析纯)制成浓度0.5mg/ml白术内酯ⅲ对照品溶液；鉴别：吸取参照药材溶液10ul、待测白术药材溶液10μl、待测白术饮片溶液10ul、待测麸炒白术饮片溶液10ul，白术内酯i对照品溶液5μl、白术内酯ⅱ对照品溶液5μl和白术内酯ⅲ对照品溶液5μl分别点于同一硅胶g薄层板上，体积比为3:1的石油醚(60～90℃)-丙酮展开剂展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇，在110℃加热至斑点显色清晰，置波长为366nm紫外光下检视。实施例6本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括白术的薄层色谱鉴别步骤，具体包括如下步骤：待测溶液和参照药材溶液：取待测白术产品和白术对照药材制成粉末各取0.8g，加正己烷(分析纯)溶剂1ml，超声5min，功率为250w，频率为40khz，滤过，补足溶剂，取滤液，即得待测溶液和参照药材溶液；所述白术产品为白术药材、白术饮片和麸炒白术饮片按照上述方法分别制成待测白术药材溶液、待测白术饮片溶液和待测麸炒白术饮片溶液；取白术内酯i对照品加正己烷溶剂(分析纯)制成浓度为3mg/ml白术内酯i对照品溶液；取白术内酯ii对照品加正己烷溶剂(分析纯)制成浓度为3mg/ml白术内酯ⅱ对照品溶液；取白术内酯iii对照品加正己烷溶剂(分析纯)制成浓度3mg/ml白术内酯ⅲ对照品溶液；鉴别：吸取参照药材溶液3ul、待测白术药材溶液3μl、待测白术饮片溶液3ul、待测麸炒白术饮片溶液3ul，白术内酯i对照品溶液1μl、白术内酯ⅱ对照品溶液1μl和白术内酯ⅲ对照品溶液1μl分别点于同一硅胶h薄层板上，体积比为4:1的石油醚(60～90℃)-丙酮展开剂展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，在100℃加热至斑点显色清晰，置波长为366nm紫外光下检视。实施例7本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括对白术进行含量测定的步骤，所述含量测定包括白术内酯ⅰ与白术内酯ⅲ的含量测定，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取产自浙江的白术药材制成粉末，过六号筛，精密称定0.5g，加入甲醇(分析纯)20ml，超声40min，功率为250w，频率为40khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；参照物溶液的制备：取白术参照药材制成粉末，过六号筛，精密称定0.3g，加入正己烷(分析纯)20ml，超声20min，功率为250w，频率为40khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得对照药材参照物溶液；精密称定白术内酯ⅰ对照品0.5mg、白术内酯ⅲ对照品1mg，加正己烷(分析纯)20-50ml溶解，定容至100ml，制成含白术内酯ⅰ4ug/ml、白术内酯ⅲ8μg/ml的混合对照品溶液，即得对照品参照物溶液；标准溶液的制备：精密称取白术内酯ⅰ对照品10.03mg、白术内酯ⅲ对照品11.50mg，置10ml棕色量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.002mg/ml的白术内酯ⅰ对照品溶液、浓度为1.149mg/ml的白术内酯ⅲ对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各0.5ml于同一10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得含白术内酯ⅰ50.10μg/ml、白术内酯ⅲ57.45μg/ml的混合标准溶液，精密吸取上述混合标准溶液连续稀释制成不同浓度的白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ标准溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择watersxbridgec18(4.6×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为50％：50％→50％：50％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为50％：50％→65％：35％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为65％：35％→65％：35％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为65％：35％→80％：20％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为80％：20％→85％：15％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为85％：15％→90％：10％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为90％：10％→90％：10％；柱温为35℃；流速为1ml/min；在波长220nm检测白术内酯ⅰ，在波长276nm处检测白术内酯ⅲ；测定法：分别吸取经连续稀释不同浓度的标准溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，276nm波长下的所述对照品溶液的液相色谱谱图如图6(白术内酯ⅰ，保留时间为20.33min)，220nm波长下的所述对照品溶液的液相色谱图如图7(白术内酯ⅲ，保留时间为9.39min)所示，分别以白术内酯ⅰ、ⅲ峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，见表2和表3；分别吸取对照品溶液和供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，276nm波长下的所述供试品溶液的液相色谱谱图如图8所示，220nm波长下的所述供试品溶液的液相色谱谱图如图9所示；表2白术内酯ⅰ线性关系的考察白术内酯ⅰ进样量(μg)峰面积1峰面积2平均峰面积0.020041348861332541340700.05013248343176213212280.10026468886426386447630.20041297796126981712838070.30061911332190954319104380.4008250726725117192509493表3白术内酯ⅲ线性关系的考察结果表明，白术内酯ⅰ线性回归方程为y＝6264630.0x+14539.5，r＝0.999899，在0.02004～0.4008μg范围内线性关系良好，所述回归方程的曲线图见图27所示；白术内酯ⅲ线性回归方程为y＝3297818.5x+5079.7，r＝0.999949，在0.02298～0.4596μg范围内线性关系良好，所述回归方程的曲线图见图28所示，均可用外标一点法进行计算白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ的含量；计算得到的白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ含量见下表4。表4样品中白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ的含量样品名白术内酯ⅰ(％)白术内酯ⅲ(％)合计(％)白术0.0110.0170.028实施例8本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括对白术进行含量测定的步骤，所述含量测定包括白术内酯ⅰ与白术内酯ⅲ的含量测定，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取产自河北的白术饮片制成粉末，过六号筛，精密称定0.3g，加入正己烷(分析纯)20ml，超声20min，功率为250w，频率为50khz，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；对照品溶液的制备：精密称定白术内酯ⅰ对照品0.5mg、白术内酯ⅲ对照品1mg，加正己烷(分析纯)20-50ml溶解，定容至100ml，制成含白术内酯ⅰ4ug/ml、白术内酯ⅲ8μg/ml的混合对照品溶液，即得对照品溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择agilentzorbaxsb-c18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照以下程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为45％：55％→45％：55％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为45％：55％→60％：40％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为60％：40％→60％：40％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为60％：40％→78％：22％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为78％：22％→83％：17％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为83％：17％→88％：12％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为88％：12％→88％：12％；柱温为25℃；流速为0.8ml/min；在波长220nm检测白术内酯ⅰ，在波长276nm处检测白术内酯ⅲ；测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液5ul，注入液相色谱仪，测定。根据样品、对照品峰面积及对照品浓度，计算得到的白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ含量见下表5。表5样品中白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ的含量样品名白术内酯ⅰ(％)白术内酯ⅲ(％)合计(％)白术0.0230.0810.104实施例9本实施例提供了一种白术质量检测方法，包括对白术进行含量测定的步骤，所述含量测定包括白术内酯ⅰ与白术内酯ⅲ的含量测定，包括如下步骤：供试品溶液的制备：取产自浙江的麸炒白术饮片制成粉末，过六号筛，精密称定0.8g，加入甲醇(体积分数为60％)25ml，冷浸60min，静置，补足减失的溶剂，取上清液用微孔大小为0.45um的滤膜滤过，取续滤液，即得；对照品溶液的制备：精密称定白术内酯ⅰ对照品0.5mg、白术内酯ⅲ对照品1mg，加甲醇(体积分数为60％)20-50ml溶解，定容至100ml，制成含白术内酯ⅰ6ug/ml、白术内酯ⅲ12μg/ml的混合对照品溶液，即得对照品溶液；色谱条件与系统适用性试验：照高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择kromasil100-5-c18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相a，以水为流动相b，按照以下程序进行梯度洗脱：0-13min，流动相a：流动相b的体积比为55％：45％→55％：45％；13-14min，流动相a：流动相b的体积比为55％：45％→70％：30％；14-20min，流动相a：流动相b的体积比为70％：30％→70％：30％；20-21min，流动相a：流动相b的体积比为70％：30％→82％：18％；21-25min，流动相a：流动相b的体积比为82％：18％→87％：13％；25-26min，流动相a：流动相b的体积比为87％：13％→92％：8％；26-40min，流动相a：流动相b的体积比为92％：8％→92％：8％；柱温为35℃；流速为1.2ml/min；在波长220nm检测白术内酯ⅰ，在波长276nm处检测白术内酯ⅲ；测定法：分别吸取对照品溶液和供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定；根据样品、对照品峰面积及对照品浓度，计算得到的白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ含量见下表6。表6样品中白术内酯ⅰ、白术内酯ⅲ的含量样品名白术内酯ⅰ(％)白术内酯ⅲ(％)合计(％)麸炒白术0.0920.1080.200实施例10本实施例提供了一种白术质量检测方法，还包括对白术进行重金属、有害元素或农药残留含量测定的步骤，选用白术药材(样品1)、白术饮片(样品2)和麸炒白术饮片(样品3)作为待测样品，具体如下；重金属及有害元素含量测定：按照铅、镉、砷、汞、铜测定法(《中国药典》2015版通则2321原子吸收分光光度法或电感耦合等离子体质谱法)测定、镉、砷、汞、铜的含量，，铅不得过5mg/kg；镉不得过0.3mg/kg；砷不得过2mg/kg；汞不得过0.2mg/kg；铜不得过20mg/kg。样品铅、镉、砷、汞、铜含量见下表7。表7样品中铅、镉、砷、汞、铜含量测定结果农药残留含量测定：按照农药残留量测定法(《中国药典》2015版通则2341有机氯类农药残留量测定法-第一法)测定总六六六、总滴滴涕和五氯硝基苯含量，含总六六六(α-bhc、β-bhc、γ-bhc、δ-bhc之和)不得过0.2mg/kg；总滴滴涕(pp'-dde、pp'-ddd、op'-ddt，pp'-ddt之和)不得过0.2mg/kg；五氯硝基苯不得过0.1mg/kg。样品农药残留量结果见下表8。表8样品农药残留量测定结果样品名总六六六(mg/kg)总滴滴涕(mg/kg)五氯硝基苯(mg/kg)样品1未检出(＜0.01)未检出(＜0.01)未检出(＜0.01)样品2未检出(＜0.01)未检出(＜0.01)未检出(＜0.01)样品3未检出(＜0.01)未检出(＜0.01)0.05实验例1、白术薄层色谱法鉴别方法1.1方法优化按照《中华人民共和国药典》2015年版中白术项下薄层鉴别方法对实施例2中的白术药材进行鉴别，如下：取白术药材粉末0.5g，加正己烷2ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取白术对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。吸取上述新制备的两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(50：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，并应显有一桃红色主斑点(苍术酮)。采用药典方法得到的薄层色谱图见图10，图中序号1～6依次代表6种不同产地的供试白术药材。由图中可看出，采用药典方法鉴别白术效果不佳，因此，对其进行优化。(1)提取方法考察药典方法为：取白术药材粉末0.5g，加正己烷2ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。实施例1提取方法为：取白术药材粉末0.5g，加甲醇2ml，超声15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。(2)显色方法考察药典方法为：喷以5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。研究发现，喷以10％的硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，于紫外光灯366nm下有多个明显的荧光斑点，因此选择在紫外光灯366nm下检视。(3)展开剂选择对展开剂的种类及配比进行了摸索，分别选用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、正己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯、石油醚(60～90℃)-丙酮、乙酸乙酯-甲醇-水、石油醚(60～90℃)-二氯甲烷-丙酮等作为展开剂，通过一次展开、二次展开等方式对比，最终选用石油醚(60～90℃)-丙酮为展开剂，比例3.5:1为佳。(4)薄层板考察通过硅胶g板、h板、gf254板考察，确定硅胶g板和h板分离效果佳。1.2方法学考察(1)低温考察按照本发明实施例4中的方案进行操作，在展开时选择在4℃环境下展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(366nm)下检视，结果显示，在4℃下的环境中展开效果良好，见图11，图中1-白术内酯i；2-白术内酯ii；3-白术对照药材；4-白术药材b5；5-白术饮片y7；6-麸炒白术饮片f13；7-白术内酯iii。(2)湿度考察按照本发明实施例4中的方案进行操作，在展开时选择在18％、72％的相对湿度中展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(366nm)下检视，结果显示，在不同的湿度环境中展开效果均较好，见图10(18％)和图11(72％)，图12-13中，1-白术内酯i；2-白术内酯ii；3-白术对照药材；4-白术药材b5；5-白术饮片y7；6-麸炒白术饮片f13；7-白术内酯iii。(3)专属性考察按照本发明实施例4中的方案进行操作，利用甲醇试剂作为空白溶液，点样，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(366nm)下检视，结果显示，甲醇无干扰，证明该方法具有良好的专属性，见图14所示，图中1-甲醇；2-白术内酯i；3-白术内酯ii；4-白术对照药材；5-白术药材,；6-白术饮片；7-麸炒白术饮片；8-白术内酯iii。(4)耐用性考察按照本发明实施例4中的方案进行操作，其中点样板分别选择点样于青岛海洋化工分厂和烟台市化学工业研究所的硅胶g薄层板上，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(366nm)下检视，结果显示，在2种板上均有较好的分离效果，证明该方法具有良好的耐用性，见图15、图16，图15-16中1-甲醇；2-白术内酯i；3-白术内酯ii；4-白术对照药材；5-白术药材,；6-白术饮片；7-麸炒白术饮片；8-白术内酯iii。(5)重现性考察由2名实验人员同时按照本发明实施例4中的方案进行操作，结果证明该方法具有良好的重现性，见图17、图18所示，图15-16中1-甲醇；2-白术内酯i；3-白术内酯ii；4-白术对照药材；5-白术药材,；6-白术饮片；7-麸炒白术饮片；8-白术内酯iii。2.白术药材重金属及有害元素测定2.1.1方法采用原子吸收分光光度法测定白术药材中的铅、镉、砷、汞、铜。具体方法为《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2321铅、镉、砷、汞、铜测定法。2.1.2结果对45个批次白术药材进行了铅、镉、砷、汞、铜测定，测定结果见表9。表9白术药材重金属及有害元素测定结果(ppm，mg/kg)2.2白术药材农药残留量测定2.2.1方法采用气相色谱法测定白术药材中总六六六(α-bhc、β-bhc、γ-bhc、δ-bhc之和)、总滴滴涕(pp'-dde、pp'-ddd、op'-ddt、pp'-ddt之和)、五氯硝基苯。具体方法为《中华人民共和国药典》2015年版四部通则2341有机氯类农药残留量测定法—第一法。2.2.2结果对45个批次白术药材进行了总六六六(α-bhc、β-bhc、γ-bhc、δ-bhc之和)、总滴滴涕(pp'-dde、pp'-ddd、op'-ddt、pp'-ddt之和)、五氯硝基苯测定，测定结果见表10。表10白术药材农药残留量测定结果(ppm，mg/kg)3.白术药材含量测定3.1波长的选择采用全波长扫描方法，考察对照品溶液在190nm～400nm波长下的吸收情况。通过3d光谱图发现，白术内酯ⅲ在220nm(见图19)处有较大的紫外吸收，而白术内酯ⅰ在276nm(见图20)处有较大的紫外吸收。故采用全波长扫描的方法，分别在220nm、276nm提取波长进行含量测定。3.2流动相的选择按照本发明实施例7中的方案进行操作，分别考察了以下两种流动相的组成：甲醇(流动相a)-水(流动相b)、乙腈(流动相a)-水(流动相b)。结果表明，以甲醇-水为流动相时，检测220nm波长下供试品色谱图，基线不稳定(见图21)，而乙腈-水为流动相的检测220nm波长下供试品色谱图，基线平稳(见图22)，故选择乙腈-水为流动相。3.3色谱条件的选择按照本发明实施例7中的方案进行操作，其中梯度洗脱程序分别选择按照按表11梯度洗脱程序(1)、表12梯度洗脱程序(2)(洗脱程序(2)为实施例7中的洗脱程序)洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为220nm(白术内酯ⅲ)；276nm(白术内酯ⅰ)，梯度洗脱程序(1)所得液相色谱图见图23(276nm，保留时间19.55min)-图24(220nm,保留时间12.78min)、梯度洗脱程序(2)所得液相色谱图图25(220nm)，图25的局部放大图26，液相色谱图图27(276nm)，图27的局部放大图28。表11洗脱程序(1)表12洗脱程序(2)时间(分钟)a(％)b(％)0～13505014～20653521～2580～8520～1526～409010由结果可知，梯度洗脱程序(2)所得液相色谱图中白术内酯ⅰ、ⅲ峰形良好且无干扰，其中，白术内酯ⅰ与杂质峰的分离度为1.56。3.3供试品溶液的制备3.3.1提取方法的考察按照本发明实施例7中的方案进行操作，在供试品溶液的制备步骤中，分别采用超声、冷浸两种方法处理30分钟，检测结果见表13。表13提取方法的考察提取方法取样量(g)白术内酯ⅰ(mg/g)白术内酯ⅲ(mg/g)总含量(mg/g)超声0.50320.21230.37910.5914冷浸0.50600.20200.34680.5488结果表明：采用超声提取法提取效率高于冷浸，因此选择超声提取法作为提取方法。3.3.2提取溶剂的考察按照本发明实施例7中的方案进行操作，在供试品溶液的制备步骤中，精密加入不同浓度的甲醇20ml，超声处理30分钟，结果见表14。表14提取溶剂的考察提取溶剂取样量(g)白术内酯ⅰ(mg/g)白术内酯ⅲ(mg/g)总含量(mg/g)60％甲醇0.50670.20940.38250.591980％甲醇0.50230.21740.39100.6084甲醇0.50030.21440.37950.5939结果表明：三种提取方法无显著性差异，根据过滤难易程度，选择甲醇作为提取溶剂。3.3.3提取溶剂的用量按照本发明实施例7中的方案进行操作，在供试品溶液的制备步骤中，精密加入不同体积的甲醇，超声处理30分钟，结果见表15。表15提取溶剂用量的考察溶剂体积取样量(g)白术内酯ⅰ(mg/g)白术内酯ⅲ(mg/g)总含量(mg/g)15ml0.50590.21390.38160.595520ml0.50210.21310.37850.591625ml0.50770.21430.37560.5899结果表明，三组含量无显著性差异。3.3.4提取时间的选择按照本发明实施例7中的方案进行操作，在供试品溶液的制备步骤中，分别超声处理20、30、40、60分钟，结果见表16。表16提取时间的考察提取时间取样量(g)白术内酯ⅰ(mg/g)白术内酯ⅲ(mg/g)总含量(mg/g)20min0.50490.21290.38010.593030min0.50080.21320.37260.585840min0.50250.21650.38730.603860min0.50420.21840.38340.6018结果表明，提取40分钟效果最佳，故选择提取时间为40分钟。3.4方法学考察3.4.1线性关系的考察对照品溶液的配制：(1)白术内酯ⅰ：精密称取白术内酯ⅰ对照品10.03mg(批号111975-201501，含量99.9％)，置10ml棕色量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.002mg/ml的白术内酯ⅰ对照品溶液。(2)白术内酯ⅲ：精密称取白术内酯ⅲ对照品11.50mg(批号111978-201501，含量99.9％)，置10ml棕色量瓶中，以甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.149mg/ml的白术内酯ⅲ对照品溶液。(3)混合标准溶液：分别精密吸取上述(1)～(2)对照品溶液各0.5ml于同一10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得浓度分别为白术内酯ⅰ(50.10μg/ml)、白术内酯ⅲ(57.45μg/ml)的混合标准溶液。标准曲线的制备：分别精密吸取上述混合标准溶液3.0ml、4.0ml于5ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得溶液①(白术内酯ⅰ、ⅲ：30.06μg/ml、34.47μg/ml)和溶液②(白术内酯ⅰ、ⅲ：40.08μg/ml、45.96μg/ml)。精密吸取溶液②2.5ml于5ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得溶液③(白术内酯ⅰ、ⅲ：20.04μg/ml、22.98μg/ml)。分别精密吸取溶液③1.0ml、2.5ml于10ml、5ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得溶液④(白术内酯ⅰ、ⅲ：2.004μg/ml、2.298μg/ml)和溶液⑤(白术内酯ⅰ、ⅲ：10.02μg/ml、11.49μg/ml)。精密吸取溶液⑤2.5ml于5ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得溶液⑥(白术内酯ⅰ、ⅲ：5.010μg/ml、5.745μg/ml)。精密吸取上述标准对照品溶液①～⑥各10μl，按已确定的色谱条件测定峰面积，分别以白术内酯ⅰ、ⅲ峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表17～18和图29～30。表17白术内酯ⅰ线性关系的考察白术内酯ⅰ进样量(μg)峰面积1峰面积2平均峰面积0.020041348861332541340700.05013248343176213212280.10026468886426386447630.20041297796126981712838070.30061911332190954319104380.4008250726725117192509493表18白术内酯ⅲ线性关系的考察白术内酯ⅲ进样量(μg)峰面积1峰面积2平均峰面积0.022987948079379794300.057451912111908471910290.11493847563843653845610.22987683697662067672880.34471147186115111511491510.4596151627115106451513458实验结果表明，白术内酯ⅰ线性回归方程为y＝6264630.0x+14539.5，r＝0.999899，在0.02004～0.4008μg范围内线性关系良好；白术内酯ⅲ线性回归方程为y＝3297818.5x+5079.7，r＝0.999949，在0.02298～0.4596μg范围内线性关系良好，均可用外标一点法进行计算。3.4.2精密度试验精密称取白术样品粉末0.5g(过六号筛)，按照本发明实施例7中的方案操作，进样10μl，连续进样6次，测定2种成分的峰面积，rsd％均小于2％，表明精密度良好，结果见表19。表19精密度试验3.4.3稳定性试验精密称取白术样品粉末0.5g(过六号筛)，按照本发明实施例7中的方案操作，分别在0、2、4、8、12、24小时进样，测定白术内酯ⅰ、ⅲ的峰面积，考察供试品的稳定性，结果表明，供试品溶液中2种成分在24小时内基本稳定，结果见表20。表20稳定性试验样品名白术内酯ⅰ白术内酯ⅲ稳定性-0h293339291964稳定性-2h294332287808稳定性-4h293382287415稳定性-8h292075291342稳定性-12h287853285839稳定性-24h285024282620平均峰面积291001287831rsd％1.31.23.3.4重复性试验取白术样品粉末0.5g(过六号筛)6份，精密称定，按照本发明实施例7中的方案操作，进样10μl，测定白术内酯ⅰ、ⅲ的峰面积并计算含量，结果表明本方法重复性良好，rsd％均小于2％，结果见表21。表21重复性试验(mg/g)3.3.5准确度试验采用加样回收试验，精密称取同一批次白术样品粉末0.25g(其中白术内酯ⅰ含量为0.2019mg/g，白术内酯ⅲ含量为0.3874mg/g)，分别加入混合对照品溶液(白术内酯ⅰ50.00μg/ml、白术内酯ⅲ103.9μg/ml)1.0ml于具塞锥形瓶中，按照本发明实施例7中的方案操作，进样10μl，计算加样回收率，结果见表22～23。表22白术内酯ⅰ回收率试验及其结果表23白术内酯ⅲ回收率试验及其结果结果表明，本方法加样回收率良好。3.3.6耐用性试验取白术样品粉末0.5g(过六号筛)，精密称定，按照本发明实施例7中的方案操作，进样10μl，测定白术内酯ⅰ、ⅲ的峰面积并计算含量，以3根不同的色谱柱检测，结果表明本方法耐用性良好，rsd％均小于3％，结果见表24。表24不同色谱柱测定样品含量色谱柱型号白术内酯ⅰ(mg/g)白术内酯ⅲ(mg/g)watersxbridgec180.2990.608agilentzorbaxsb-c180.3110.613kromasil100-5-c180.3010.605rsd(％)2.0500.632本研究建立了高效液相色谱同时测定白术中白术内酯ⅰ、ⅲ含量的方法。通过对波长的选择、流动相的选择、洗脱条件的摸索，确定最优色谱条件，并对方法学进行了全面考察；通过考察提取方式、提取溶剂及用量、提取时间对白术中白术内酯ⅰ、ⅲ提取结果的影响，优化得到样品前处理条件。该方法简单，测定结果准确可靠、重复性好，实用性强，可用于对白术药材的质量评价。4.白术hplc特征图谱的考察4.1.1波长的选择采用二极管阵列检测器对样品进行全波长检测，根据收集的三维图谱(见图31)，并同时收集238nm波长处的图谱，综合考察，样品在238nm波长处的各色谱峰相应比较均衡，因此最后确定238nm为白术特征图谱的检测波长。4.1.2流动相的选择按照本发明实施例1操作，分别考察了以下两种流动相的组成：甲醇-水、乙腈-水。结果表明，以甲醇-水为流动相时，基线不稳定(见图32)，而乙腈-水为流动相基线平稳(见图33)，故选择乙腈-水为流动相。4.1.3色谱条件的选择按照本发明实施例1中的方案进行操作，其中梯度洗脱程序分别选择按照按表25梯度洗脱程序(1)、表26梯度洗脱程序(2)(洗脱程序(2)为实施例1中的洗脱程序)洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为238nm所得液相色谱图见图34a-b(洗脱程序(1))、图35a-b(洗脱程序(2))。表25洗脱程序(1)时间(分钟)a(％)b(％)0-640607-12554513-20683221-2580-8520-1526-40901040.1-504060表26洗脱程序(2)时间(分钟)a(％)b(％)0～13505014～20653521～2580～8520～1526～40901040.1～505050由结果可知，梯度洗脱程序(2)所得液相色谱图中白术内酯ⅰ、白术内酯ⅱ、白术内酯ⅲ峰形良好且无干扰。4.2方法学考察4.2.1稳定性按照本发明实施例1中的方案进行操作，精密吸取同一白术样品供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0h，2h，4h，8h，12h，24h进样，检测指纹图谱，以1号峰为参照峰(s)，各特征峰相对保留时间的rsd＜3.0％，相对峰面积的rsd＜5.3％，表明供试品溶液在制备后24h内基本稳定，稳定性结果见图36，稳定性相对保留时间计算结果见表27，稳定性相对峰面积计算结果见表28。表27稳定性相对保留时间计算结果s1s2s3s4s50h1.001.741.842.163.072h1.001.741.842.163.064h1.001.741.842.153.058h1.001.741.842.163.0612h1.001.751.842.153.0524h1.001.741.842.153.05rsd％0.000.020.110.090.15表28稳定性相对峰面积计算结果s1s2s3s4s50h1.003.511.030.446.092h1.003.450.970.435.844h1.003.591.040.435.928h1.003.611.050.445.9512h1.003.681.070.466.2024h1.003.581.140.445.99rsd％0.002.205.232.232.134.2.2精密度按照本发明实施例1中的方案进行操作，精密吸取同一白术样品供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱，以1号峰为参照峰(s)，各特征峰相对保留时间的rsd＜3.0％，相对峰面积的rsd＜3.0％，表明仪器精密度良好，精密度结果见图37，精密度相对保留时间计算结果见表29，精密度相对峰面积计算结果见表30。表29精密度相对保留时间计算结果表30精密度相对峰面积计算结果s1s2s3s4s511.003.631.040.477.1421.003.581.080.477.1131.003.601.050.467.1341.003.591.060.477.1051.003.681.060.477.1561.003.631.030.467.11rsd％0.001.001.590.440.304.2.3重复性按照本发明实施例1中的方案进行操作，取同一批白术样品，平行6份，分别进样，记录特征图谱，以1号峰为参照峰(s)，各特征峰相对保留时间的rsd＜3.0％，相对峰面积的rsd＜3.0％，表明该方法的重复性良好，重复性结果见图38，重复性相对保留时间计算结果见表31，重复性相对峰面积计算结果见表32。表31重复性相对保留时间计算结果表32重复性相对峰面积计算结果s1s2s3s4s511.003.511.030.446.0921.003.441.040.435.8131.003.441.040.425.6741.003.480.990.425.8851.003.481.010.425.6961.003.521.040.435.76rsd％0.001.012.151.682.654.3特征图谱采集采用国家药典委员编制的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(v2.0)，对白术各批次特征图谱的检测结果进行了分析。采用中位数法，时间窗参数为0.30，由软件生成对照特征图谱(r指纹图谱)。4.3.1特征峰标定按照本发明实施例1中的方案构建18批白术药材代表性供试品的特征图谱并进行分析，取每批供试品特征图谱中都出现的典型色谱峰作为特征峰。在238nm，共5个特征峰，1号峰为白术内酯ⅲ；2号峰；3号峰：白术内酯ⅱ；4号峰：白术内酯ⅰ；5号峰：苍术酮，各色谱峰分别以1～5的序号表示。4.3.2各批次样品的测定各批次样品的特征图谱见图39，生成的对照特征图谱见图40，相似度见结果见表33。表3318批白术药材相似度计算结果s1s2s3s4s5s6s7s8s9s10s11s12s13s14s15s16s17s18对照图谱s110.4030.3970.4430.3850.5510.3960.4060.4240.450.4310.3930.3960.4720.4080.3850.4020.4230.478s20.40310.9470.9760.9620.9030.9610.9830.9580.9350.9830.9670.9820.9240.9910.9880.9640.9890.99s30.3970.94710.9570.8880.8750.9470.9160.8750.8610.9420.9640.9340.8910.9280.9510.890.9410.943s40.4430.9760.95710.9160.9320.9780.9590.950.9450.9870.9760.9670.9220.9710.9680.9570.9850.986s50.3850.9620.8880.91610.8550.9190.9690.9250.9020.9370.8990.9480.9210.9680.9630.9240.9470.959s60.5510.9030.8750.9320.85510.8860.8910.8970.9090.9220.8840.890.9230.9020.8780.8810.9140.932s70.3960.9610.9470.9780.9190.88610.9340.9120.9140.9660.980.9440.8860.9570.9690.9380.9710.969s80.4060.9830.9160.9590.9690.8910.93410.9790.9570.9730.9280.9720.9250.9880.9710.9740.9830.985s90.4240.9580.8750.950.9250.8970.9120.97910.9890.9640.8970.9490.8880.9740.9320.9920.9710.973s100.450.9350.8610.9450.9020.9090.9140.9570.98910.9510.8850.9170.8670.9530.9090.9840.960.962s110.4310.9830.9420.9870.9370.9220.9660.9730.9640.95110.970.9850.9380.980.9710.9630.9880.991s120.3930.9670.9640.9760.8990.8840.980.9280.8970.8850.9710.9510.8890.9490.970.9160.9680.961s130.3960.9820.9340.9670.9480.890.9440.9720.9490.9170.9850.95110.9450.9770.9720.9470.9740.979s140.4720.9240.8910.9220.9210.9230.8860.9250.8880.8670.9380.8890.94510.9220.9170.8670.9180.939s150.4080.9910.9280.9710.9680.9020.9570.9880.9740.9530.980.9490.9770.92210.9820.9790.990.991s160.3850.9880.9510.9680.9630.8780.9690.9710.9320.9090.9710.970.9720.9170.98210.9450.9790.98s170.4020.9640.890.9570.9240.8810.9380.9740.9920.9840.9630.9160.9470.8670.9790.94510.9790.975s180.4230.9890.9410.9850.9470.9140.9710.9830.9710.960.9880.9680.9740.9180.990.9790.97910.994对照图谱0.4780.990.9430.9860.9590.9320.9690.9850.9730.9620.9910.9610.9790.9390.9910.980.9750.99414.3.3对照特征图谱的建立各批次样品的特征图谱中应呈现5个特征峰，以s1、s2、s3、s4、s5为标记。结果如图40。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12