一种带有半自动推送装置的25羟基维生素D检测试剂盒的制作方法

本申请涉及血清中的25-羟基维生素D检测领域，具体为一种带有半自动推送装置的25羟基维生素D检测试剂盒。

背景技术：

人体内功能性维生素D主要包括维生素D3和维生素D2，25- 羟基维生素D是衡量维生素D营养状态的最佳指标。维持正常的维生素D水平对调节钙、磷代谢至关重要。在维生素D缺乏的情况下，人体仅能吸收大约10-15％的钙和60％的磷，1,25-二羟基维生素D 通过与维生素D受体结合，可提高肠道对钙磷的吸收效率，使钙吸收增加至30-40％，磷增加至80％左右。维生素D具有传统意义上的骨骼效应，缺乏可能会导致儿童佝偻病、成人骨质疏松症、软骨症、肌无力，增加老人跌倒和骨折的风险。因此，25-羟基维生素D的检测可评估患者体内维生素D的营养状况，对维生素D缺乏的临床判断、治疗管理和生理评估具有辅助诊断的意义。

试剂盒以氘6-25-羟基维生素D3(以下称25(OH)VD3-d6)为内标，采用液相色谱-串联质谱仪对经复溶与有机溶剂提取的样品(包括：5个校准品、2个质控品和待测血清样品)中25-羟基维生素D2 (以下称25(OH)VD2)和25-羟基维生素D3(以下称25(OH)VD3) 进行检测，并记录各检测样品的色谱图及25(OH)VD2和25(OH)VD3 的峰面积与内标峰面积。通过对各检测样品中25(OH)VD2和 25(OH)VD3与相应内标峰面积的比值进行计算，对5个校准品25(OH)VD2和25(OH)VD3的标示浓度(x)与相应峰面积的比值(y) 绘制校准曲线与拟合校准曲线方程，再将其他检测样品中25(OH)VD2 和25(OH)VD3峰面积与相应内标峰面积的比值代入拟合的校准曲线方程，即可计算出不同检测样品中25(OH)VD2和25(OH)VD3的浓度。

CN202522564U公开了一种25羟基维生素D检测试剂盒，包括盒体，盒体内主要有：具有放置试剂瓶的下凹瓶位、位于下凹瓶位上的试剂瓶、以及置于塑料框架中的微孔板，所述微孔板的微孔内包被有高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体层，所述高特异性鼠25羟基维生素D单克隆抗体的量为0.1～0.5μg；所述试剂瓶包括装有浓度为0.1μg/ml的生物素标记的25羟基维生素D的试剂瓶和装有工作浓度为0.5～2.0μg/ml的辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白的试剂瓶本实用新型25羟基纤维素D检测试剂盒灵敏度约为5nmol/L，线性范围大于同类试剂盒，精密度和准确度均在试剂盒要求范围内，操作方法比同类试剂盒简单，操作时间短。

但是操作过程中，由于现有试剂盒内部成分复杂，基本组件试剂瓶往往有多个，每个在外形上较为类似，难以分辨。如遇到使用者疏忽大意，会出现加错试剂的情况，影响试剂盒的使用。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述不足，本实用新型的目的在于提供一种带有半自动推送装置的25羟基维生素D检测试剂盒。

为实现以上目的，本实用新型提供的一种带有半自动推送装置的25羟基维生素D检测试剂盒，采用如下技术方案：

一种带有半自动推送装置的25羟基维生素D检测试剂盒，包括推送室和取用室，所述推送室和取用室的上部通过隔板隔开、下部相通，所述推送室与隔板相对的面横向固定有弹簧，试剂瓶按照使用顺序从取用室往推送室排列，最后一个排列的试剂瓶所在位置为初始位置，在所述初始位置的试剂瓶紧挨弹簧。

优选的，所述取用室能够放置一个试剂瓶。

优选的，所述试剂瓶采用方形横截面设计，增加试剂瓶与弹簧之间的接触面积，保证弹簧对试剂瓶的推送。

在本申请的一种优选实施方式中，所述取用室长6cm，宽6cm，高度与试剂盒相同，为30cm。

在本申请的一种优选实施方式中，所述推送室长34cm，宽6cm，高度与试剂盒相同，为30cm。

优选的，所述隔板高度为20cm。

优选的，所述弹簧横向固定在离试剂盒底面6cm高的位置。

优选的，所述试剂瓶为长5.5cm，宽5.5cm，高9cm的正方形截面试剂瓶。

进一步优选的，在所述取用室和推送室的试剂瓶，彼此紧密排列在试剂盒底面，当试剂瓶全部就位在取用室和推送室时，弹簧处于压缩状态。

优选的，所述弹簧为金属结构。

与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

(1)本实用新型采用半自动推送装置，提高了试剂盒使用过程体验，简化了流程，避免了使用错误问题，适用于各种类型的使用者。同时为使用者提供高特异性，高灵敏度，高准确度，能满足市场的快速维生素D检测需求。

(2)本实用新型推送室和取用室，设计简便，工艺简单。与半自动推送装置和试剂瓶配合，优化了实验流程。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本实用新型的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本申请试剂盒结构示意图；

图2为取用室结构示意图；

图3为推送室结构示意图；

图4为试剂瓶结构示意图；

图5为25OHVD在25-100ng/mL的校准曲线图；

图6为25OHVD3在25-100ng/mL的校准曲线图；

图中附图标记：1-推送室，2-取用室，3-隔板，4-弹簧，5-试剂瓶，6-初始位置。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本实用新型进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本实用新型，但不以任何形式限制本实用新型。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本实用新型的保护范围。

实施例1

如图1所示，一种带有半自动推送装置的25羟基维生素D检测试剂盒，包括推送室1和取用室2，所述推送室和取用室的上部通过隔板3隔开、下部相通，所述推送室与隔板相对的面横向固定有弹簧 4，试剂瓶5按照使用顺序从取用室往推送室排列，最后一个排列的试剂瓶所在位置为初始位置6，在所述初始位置6的试剂瓶紧挨弹簧 4。

如图2所示，所述取用室能够放置一个试剂瓶5；所述取用室长 6cm，宽6cm，高度与试剂盒相同，为30cm；所述隔板高度为20cm。

如图3所示，所述推送室长34cm，宽6cm，高度与试剂盒相同，为30cm；所述弹簧横向固定在离试剂盒底面6cm高的位置。

如图4所示，所述试剂瓶为长5.5cm，宽5.5cm，高9cm的正方形截面试剂瓶。所述试剂瓶采用方形横截面设计，增加试剂瓶与弹簧之间的接触面积，保证弹簧对试剂瓶的推送，所述弹簧为金属结构。

所述试剂盒可以按照以下方法制作，按照图1、图2和图3的设计，用30cm长，40cm宽的纸板在底部隔开6cm宽的区域，再用另一20cm长，6cm宽的纸板将该区域分割成上部分开，下部打通的两个半独立区域，左边即取用室，取用室长6cm，宽6cm，高30cm，用于实验人员取用当前操作步骤需要使用的试剂瓶。正常情况下，取用室只有一个试剂瓶。试剂瓶取出后，下一个待使用试剂瓶会自动推入取用室。右边即推送室，推送室长34cm，宽6cm，高30cm，用于放置需要使用的试剂瓶，每个试剂瓶按说明书所示操作步骤，以从左至右顺序依次摆放。取用室最右端装有弹簧装置，用于推动试剂瓶在其中的移动。紧挨着弹簧的位置为初始位置，该位置为当前试剂瓶使用完毕后，放回试剂盒的位置。其中弹簧固定于试剂盒右侧面，离底面6cm 高的位置，用于产生向左的推动力。在试剂瓶全部在取用室和推送室时，弹簧处于压紧状态。当取用了一个试剂瓶，弹簧压力减小，将下一个试剂瓶推入取用室。弹簧为市售金属制弹簧。

在所述取用室和推送室的试剂瓶，彼此紧密排列在试剂盒底面，当试剂瓶全部就位在取用室和推送室时，弹簧处于压缩状态。当取用室的试剂瓶被取出使用，弹簧压力释放，将下一个待使用的试剂瓶推入取用室。当取用室的试剂瓶使用完毕后，由使用者将弹簧压紧，空出空间，将该试剂瓶重新排到初始位置。松开弹簧，弹簧得以继续工作。如此往复。每次使用一个试剂瓶，弹簧装置会自动将下一个试剂瓶压入使用舱，供实验人员取用，从而避免拿错试剂瓶的问题。使用过的试剂瓶，需要将其放置到初始位置，以供下次使用。本实用新型普遍适用于那些每个试剂瓶在使用流程中仅使用一次的试剂盒。

本实施例试剂盒的检测性能评估：

试剂盒以氘6-25-羟基维生素D3(以下称25(OH)VD3-d6)为内标，采用液相色谱-串联质谱仪对经复溶与有机溶剂提取的样品(包括：5个校准品、2个质控品和待测血清样品)中25-羟基维生素D2 (以下称25(OH)VD2)和25-羟基维生素D3(以下称25(OH)VD3) 进行检测，并记录各检测样品的色谱图及25(OH)VD2和25(OH)VD3 的峰面积与内标峰面积。通过对各检测样品中25(OH)VD2和

25(OH)VD3与相应内标峰面积的比值进行计算，对5个校准品

25(OH)VD2和25(OH)VD3的标示浓度(x)与相应峰面积的比值(y) 绘制校准曲线与拟合校准曲线方程，再将其他检测样品中25(OH)VD2 和25(OH)VD3峰面积与相应内标峰面积的比值代入拟合的校准曲线方程，即可计算出不同检测样品中25(OH)VD2和25(OH)VD3的浓度。

试剂盒中对于校准品、质控品和血清样品的处理方法过程具体为：用移液枪(200μL)分别吸取100μL校准品溶液(A1、A2、A3、 A4、A5)、质控品溶液(B6、B7)和血清样品于1.5mL的离心管中，加入10μL浓度为1μg/mL的25OHVD3-d6内标溶液(IS)和10μL 浓度为1mol/L的NaOH水溶液(pH调节剂)(以上两者是用10μL 量程的移液枪移取)，涡旋30秒钟；再加入1mL甲基叔丁基醚(MTBE) (用1mL量程的移液枪移取)，涡旋4分钟；高速(25000g)离心3 分钟后用移液枪(1mL量程)吸取上清液820μL至另一1.5mL离心管中，在40℃氮气下吹干；再加入100μL 80％甲醇水溶液(200μL 量程的移液枪移取)，涡旋4分钟；高速(25000g)离心3分钟后转移到200μL的V型底内衬管中(200μL量程的移液枪移取)，放入配套的1.5mL的进样瓶中，进样30μL分析。

1、校准曲线的建立及定量限(LOQ)评估将用BSA水溶液配制的一系列浓度的25OHVD标准品(1、2、3、4、5、10、25、 50、100ng/mL)按照上述HPLC-MS/MS条件进行测定，以标准溶液浓度为x轴，标准品和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x*x”权重得回归方程，建立校准曲线。将样品与内标的峰面积比代入校准曲线方程，计算样品25OHVD的浓度。以信噪比S/N大于10，变异系数CV小于20％为定量限(LOQ)。

用上述方法测定5-100ng/mL的校准品建立校准曲线， 25OHVD2的回归方程为y＝0.00551x+0.00189，相关系数r＝0.9991；25OHVD3的回归方程为y＝0.00748x+0.00127，相关系数r＝0.9918，25OHVD2和25OHVD3在5-100ng/mL范围内呈良好的线性关系，如图5和图6所示。25OHVD2和25OHVD3 的LOQ分别为2ng/mL和3ng/mL，见下表1所示，方法具有较高的灵敏度，能够满足临床低水平维生素D准确定量分析的要求。

表1

2、精密度测试对含有低、高浓度25OHVD2的混合血清以及低、中、高浓度25OHVD3的混合血清进行4次重复分析，每次每种血清重复分析3份，每份重复进样2次，以考察方法的批内和批间精密度。

采用LC-MS/MS对低、中、高浓度样本进行重复处理测试， 25OHVD2和25OHVD3的批内精密度范围分别为3.60％-4.64％和 2.91％-6.35％，批间精密度范围为6.58％-9.64％和8.85％-9.48％。见下表2。

表2

3、准确度验证加样回收率试验取95μL的上述5种混合血清样品，分别加入浓度为1μg/mL的25OHVD2和25OHVD3 标准品溶液各5μL，每种样品重复处理2份，每份进样检测3次，计算加样回收率。

采用LC-MS/MS对加样后的5种不同浓度的混合血清样品进行重复检测6次，25OHVD2和25OHVD3的回收率分别为 100.42％-106.08％和90.10％-96.63％。见下表3。结果表明25OHVD2 和25OHVD3在本研究处理过程中基本没有损失，检测数据可靠。

表3

4、稀释一致性实验取50μL的上述5种混合血清样品，分别加入50μL的BSA水溶液，每种样品重复处理2份，每份进样检测3次，计算样品稀释后的浓度。

采用LC-MS/MS对稀释后的5种不同浓度的混合血清样品进行重复检测6次，25OHVD2和25OHVD3的准确度分别为 97.65％-97.86％和96.65％-102.99％。见下表4。结果表明本研究中的稀释方法没有问题。

表4

以上对本实用新型的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本实用新型并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本实用新型的实质内容。