一种结构光照明超分辨显微成像系统的制作方法

本实用新型涉及超分辨显微成像领域，具体而言，涉及一种结构光照明超分辨显微成像系统。

背景技术：

为了突破衍射极限，科学家在近二十多年来提出了多种超分辨显微成像方法，如基于单分子定位技术的超分辨显微成像方法，包括光激活定位显微技术(PALM)和随机光学重构显微技术(STORM)；另外还有一类是基于照明光场特殊强度分布的超分辨率显微成像方法，包括受激发射损耗显微技术(STED)和结构光照明显微技术(SIM)。PALM和STORM显微镜可以实现宽场成像，但是每幅图像仅含有少量荧光分子，重构一幅图像需要采集大量的图像，耗时很长难以实现实时显微成像观察。而STED超分辨显微成像方式需要对图像进行逐点扫描同样难以实现实时超分辨成像。此外，这三种超分辨显微技术需要一些特殊染料标记样品，并非适用于所有生物样品的观察。

结构光照明显微技术(SIM)使用特殊调制的光场照明待测样品，从而获取样品图像的高频信息，通过空间频谱处理的方式将所得高频信息进行拼接从而增大显微系统的光学传递函数(OTF)，再将频谱进行傅里叶变换和重构即可获得样品的超分辨图像。由于它属于宽场成像方式，且只需要采集有限的几幅图像即可重构出超分辨图像，因此具有更高的时间分辨率。如果采用3D结构光(采用多光束干涉产生具有三维周期分布的结构照明光场)照明样品，结构光照明显微技术(SIM)还可以实现样品的三维超分辨成像。相比于其它三种超分辨显微成像技术，SIM具有成像速度快、光路结构简单、对荧光分子无特殊要求、能够应用于活体细胞实时动态三维成像的优势，因而在生物医学成像领域引起了广泛关注，是应用前景广泛的超分辨荧光显微技术。

在SIM仪器装置方面，结构光照明超分辨显微镜是常规荧光显微镜在匀场照明的基础上、通过改变照明光的空间结构来实现的。通过改变照明光的空间结构记录的图像包含更多高频信息，利用特定的算法将这些信息分离出来，重构出超分辨图像。因此，结构光的发生装置是这类超分辨显微镜的关键，其余成像部分跟普通的荧光显微镜类似。早期直接利用两束激光束干涉产生余弦结构光，通过压电陶瓷驱动的反射镜改变光路来改变结构光的相位角，这种装置速度慢、精度低、稳定性差。之后，光栅、数字微镜芯片(DMD)、空间光调制器(SLM)作为结构光调制器被应用于结构光照明荧光显微镜。其中，空间光调制器型结构的光照明超分辨显微镜利用空间光调制器可以使结构条纹产生和控制的速度和精度得到提高，可以用于活体细胞成像。

目前国内结构光照明超分辨显成像系统多数停留在试验样机阶段，尚无商品化的结构光照明超分辨显微镜面世。市场上存在的结构光照明超分辨显微成像系统主要来自尼康(Nikon)、蔡司(Zeiss)和GE等国外公司。这些设备虽然功能完备、集成度高，但结构复杂、成本高昂。

技术实现要素：

本实用新型实施例提供了一种结构光照明超分辨显微成像系统，以至少解决现有结构光照明超分辨显成像系统结构复杂、成本高昂的技术问题。

根据本实用新型的实施例，提供了一种结构光照明超分辨显微成像系统，包括显微成像系统本体，显微成像系统本体包括有依次连接的光源模块、照明光路模块、显微成像模块、图像采集模块；其中：

光源模块，用于波长选择与输出功率调制，提供合适波长和功率的激发光；

照明光路模块，用于在2D成像模式或3D成像模式下将激发光转换成具有高调制度的衍射光束；

显微成像模块，用于使衍射光束发生干涉产生正弦条纹结构光，再使用正弦条纹结构光照射被测样品，激发出被测样品中的荧光，然后进行荧光成像；

图像采集模块，用于对显微成像模块的荧光成像进行超分辨图像采集。

进一步地，光源模块包括：至少一组激光生成组件、声光可调谐滤波器、安全开关、第一半波片、第一光纤耦合器；激光生成组件包括：激光器、声光调制器、第一二向色镜；激光器、声光调制器、第一二向色镜、声光可调谐滤波器、安全开关、第一半波片、第一光纤耦合器依次位置设置，一个以上的激光器产生的激光依次经过声光调制器、第一二向色镜、声光可调谐滤波器、安全开关、第一半波片后通过第一光纤耦合器进行耦合输出激发光。

进一步地，激光生成组件的数量为四个，四个激光器分别是波长为488nm、561nm、532nm、638nm的激光器。

进一步地，照明光路模块包括：第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、偏振分光镜、第三半波片、空间光调制器、傅里叶透镜、可变液晶相位延迟器、消色散1/4波片、滤光光阑装置、第二透镜、第一透镜；第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、偏振分光镜、第三半波片、空间光调制器依次位置设置，偏振分光镜、傅里叶透镜、可变液晶相位延迟器、消色散1/4波片、滤光光阑装置、第二透镜、第一透镜依次位置设置，激发光依次经过第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、偏振分光镜后形成具有合适口径的线偏振光束，线偏振光束依次经过第三半波片、空间光调制器后发生衍射形成衍射光束；衍射光束经过傅里叶透镜后进行聚光、经过可变液晶相位延迟器及消色散1/4波片后进行衍射光偏振方向的调制、并由滤光光阑装置根据2D成像模式或3D成像模式对衍射光进行选择性通过，最终经过第二透镜、第一透镜进入显微成像模块。

进一步地，滤光光阑装置位于傅里叶透镜的后焦面上；滤光光阑装置在2D成像模式下允许±1级衍射光进入后续光路，在3D成像模式下允许±1级和0级衍射光进入后续光路。

进一步地，滤光光阑装置包括底座、翻转架、第一圆片光阑、第二圆片光阑、电机、圆柱光阑；翻转架设置在底座上，第一圆片光阑、第二圆片光阑设置在翻转架上，圆柱光阑与电机轴向连接，圆柱光阑通过角度转动并选择性与第一圆片光阑、第二圆片光阑配合实现滤光光阑装置在2D成像模式下允许±1级衍射光进入后续光路、在3D成像模式下允许±1级和0级衍射光进入后续光路。

进一步地，电机设置为与水平面向上倾斜角度6.5°，圆柱光阑上开设有相对称的两个圆柱光阑孔组，圆柱光阑孔组包括三个间隔60°呈放射状的长条孔，第一圆片光阑上开设有中心圆孔及与六个间隔60°以中心圆孔为中心呈放射状的第一短条孔，第二圆片光阑上开设有六个间隔60°呈放射状的第二短条孔。

进一步地，显微成像模块包括：第二二向色镜、显微物镜、倍率转换器、管镜；进入显微成像模块的光束经第二二向色镜反射后进入显微成像模块的主光路，然后聚焦于显微物镜后焦面，经过显微物镜重新变为平行光，平行光在被测样品面发生干涉，产生正弦条纹结构光并照明被测样品，激发出被测样品中的荧光，被测样品发出的荧光经过显微物镜收集、第二二向色镜滤除杂光、倍率转换器放大、管镜聚焦后进入图像采集模块。

进一步地，图像采集模块包括科学级相机。

进一步地，显微成像系统本体还包括有机箱、被动隔振平台；

机箱，用于提供暗室，屏蔽外界电磁干扰、人为干扰；

被动隔振平台，用于承载光源模块、照明光路模块、显微成像模块，减弱外界振动对系统的干扰。

本实用新型实施例中的结构光照明超分辨显微成像系统，采用模块化的结构布局，便于设备的运输、集成和调试，易于商品化；可与常规荧光显微镜兼容，互换性、稳定性好，成本低；可实现2D成像(包含全内反射成像)、3D成像两种成像方式的切换，分别取得更高分辨率和三维超分辨成像的有益效果；采用一种以上的激发光，并可以根据实际需要，替换或者扩展，应用范围广。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本实用新型的进一步理解，构成本申请的一部分，本实用新型的示意性实施例及其说明用于解释本实用新型，并不构成对本实用新型的不当限定。在附图中：

图1为本实用新型的模块图；

图2为本实用新型的光路示意图；

图3为本实用新型中滤光光阑装置的结构图；

图4为本实用新型中第一圆片光阑的开孔示意图；

图5为本实用新型中第二圆片光阑的开孔示意图；

图6为本实用新型中圆柱光阑的开孔示意图；

图7为本实用新型中滤光光阑装置的工作过程示意图；

图8为本实用新型的连接结构图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本实用新型方案，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本实用新型一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本实用新型保护的范围。

需要说明的是，本实用新型的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本实用新型的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

根据本实用新型实施例，提供了一种结构光照明超分辨显微成像系统，包括显微成像系统本体，参见图1及图8，显微成像系统本体包括有依次连接的光源模块7、照明光路模块8、显微成像模块9、图像采集模块10；其中：

光源模块7，用于波长选择与输出功率调制，提供合适波长和功率的激发光；

照明光路模块8，用于在2D成像模式或3D成像模式下将激发光转换成具有高调制度的衍射光束；

显微成像模块9，用于使衍射光束发生干涉产生正弦条纹结构光，再使用正弦条纹结构光照射被测样品，激发出被测样品中的荧光，然后进行荧光成像；

图像采集模块10，用于对显微成像模块9的荧光成像进行超分辨图像采集。

本实用新型实施例中的结构光照明超分辨显微成像系统，采用模块化的结构布局，便于设备的运输、集成和调试，易于商品化；可与常规荧光显微镜兼容，互换性、稳定性好，成本低；可实现2D成像(包含全内反射成像)、3D成像两种成像方式的切换，分别取得更高分辨率和三维超分辨成像的有益效果；采用一种以上的激发光，并可以根据实际需要，替换或者扩展，应用范围广。

作为优选的技术方案中，光源模块7包括：至少一组激光生成组件、声光可调谐滤波器、安全开关、第一半波片、第一光纤耦合器；激光生成组件包括：激光器、声光调制器、第一二向色镜；激光器、声光调制器、第一二向色镜、声光可调谐滤波器、安全开关、第一半波片、第一光纤耦合器依次位置设置，一个以上的激光器产生的激光依次经过声光调制器、第一二向色镜、声光可调谐滤波器、安全开关、第一半波片后通过第一光纤耦合器进行耦合输出激发光。

具体的，参见图2，四路激光器(激光器1、激光器2、激光器3、激光器4)发出的光经各自对应的声光调制器(声光调制器1、声光调制器2、声光调制器3、声光调制器4、)后经四个二向色镜(二向色镜1、二向色镜2、二向色镜3、二向色镜4)的反射或者透射作用，传输至主光路，再经声光可调谐滤波器、安全开关、半波片1传输至光纤耦合器1中。其中，声光调制器用于控制各自光路的通断，声光可调谐滤波器进一步对出射光波长和出射光强进行调制，从而控制了照明光的波长与照明光强。这样，光源模块7完成了激发光波长的选择和功率的控制。

作为优选的技术方案中，激光生成组件的数量为四个，四个激光器分别是波长为488nm、561nm、532nm、638nm的激光器。需要指出的是，本实用新型中虽然只用了波长分别为488nm、561nm、532nm、638nm的激光器，但不局限于这四种激光器，可以根据不同的荧光染色剂，替换或者扩展激光器，使得系统的应用范围更广。

作为优选的技术方案中，照明光路模块8包括：第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、偏振分光镜、第三半波片、空间光调制器、傅里叶透镜、可变液晶相位延迟器、消色散1/4波片、滤光光阑装置、第二透镜、第一透镜；第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、偏振分光镜、第三半波片、空间光调制器依次位置设置，偏振分光镜、傅里叶透镜、可变液晶相位延迟器、消色散1/4波片、滤光光阑装置、第二透镜、第一透镜依次位置设置，激发光依次经过第二光纤耦合器、扩束镜、第二半波片、偏振分光镜后形成具有合适口径的线偏振光束，线偏振光束依次经过第三半波片、空间光调制器后发生衍射形成衍射光束；衍射光束经过傅里叶透镜后进行聚光、经过可变液晶相位延迟器及消色散1/4波片后进行衍射光偏振方向的调制、并由滤光光阑装置根据2D成像模式或3D成像模式对衍射光进行选择性通过，最终经过第二透镜、第一透镜进入显微成像模块9。

具体的，参见图2，激发光经保偏单模光纤传输至光纤耦合器2中，再经扩束镜及半波片2后，传输至偏振分光镜中，这一过程主要用于产生具有合适口径的线偏振光束。线偏振光束经半波片3后射入空间光调制器，发生衍射，从而实现对光束的亮暗二阶调制。衍射光束经傅里叶透镜即透镜3聚光并经过一个偏振调制单元，该偏振调制单元由可变液晶相位延迟器和消色散1/4波片构成，用于调制衍射光的偏振方向，保证大照明角度情况下样品面上的条纹调制度。

作为优选的技术方案中，滤光光阑装置位于傅里叶透镜的后焦面上；滤光光阑装置在2D成像模式下允许±1级衍射光进入后续光路，在3D成像模式下允许±1级和0级衍射光进入后续光路。

具体的，参见图2，2D成像模式下，光路中位于傅里叶透镜后焦面的滤光光阑装置只允许±1级衍射光进入后续光路；3D成像模式下，光路中位于傅里叶透镜后焦面的滤光光阑装置允许±1级和0级衍射光进入后续光路。通过滤光光阑装置的衍射光经透镜2和透镜1后进入显微成像模块9。这样，照明光路模块8完成了不同成像模式的具有较高调制度的衍射光束的生成。

作为优选的技术方案中，滤光光阑装置包括底座1、翻转架2、第一圆片光阑3、第二圆片光阑4、电机5、圆柱光阑6；翻转架2设置在底座1上，第一圆片光阑3、第二圆片光阑4设置在翻转架2上，圆柱光阑6与电机5轴向连接，圆柱光阑6通过角度转动并选择性与第一圆片光阑3、第二圆片光阑4配合实现滤光光阑装置在2D成像模式下允许±1级衍射光进入后续光路、在3D成像模式下允许±1级和0级衍射光进入后续光路，实现2D成像模式和3D成像模式的转换。

作为优选的技术方案中，参见图4-6，电机5设置为与水平面向上倾斜角度6.5°，圆柱光阑6上开设有相对称的两个圆柱光阑孔组，圆柱光阑孔组包括三个间隔60°呈放射状的长条孔，第一圆片光阑3上开设有中心圆孔及与六个间隔60°以中心圆孔为中心呈放射状的第一短条孔，第二圆片光阑4上开设有六个间隔60°呈放射状的第二短条孔。

具体的，参见图3-6，滤光光阑装置是实现结构光照明超分辨显微成像系统2D成像模式和3D成像模式的核心，滤光光阑装置通过以下方式实现：

滤光光阑装置主要由电动式翻转架2、第一圆片光阑3、第二圆片光阑4、电机5、圆柱光阑6、底座1组成。其中第一圆片光阑3中间开有如图4所示的小孔，第二圆片光阑4中间开有如图5所示的小孔，圆柱光阑6上开有如图6所示的小孔。第一圆片光阑3和第二圆片光阑4固定在电动式翻转架2的两个孔位上，可以随电动式翻转架2翻转，切换位置。圆柱光阑6固定在摆动式电机5上，可沿固定轴往复转动。摆动式电机5安装时轴线倾斜6.5°。

具体的，滤光光阑装置工作过程如图7所示：2D成像模式下，将第二圆片光阑4切换至主光路中，当小圆筒圆柱光阑6沿轴线转动-10.5°时，滤光光阑只允许60°(即-120°)方向上的衍射光斑通过；当小圆筒圆柱光阑6沿轴线转动0°时，滤光光阑只允许0°方向上的衍射光斑通过；当小圆筒圆柱光阑6沿轴线转动10.5°时，滤光光阑只允许-60°(即-120°)方向上的衍射光斑通过。3D成像模式下，需要0级衍射光斑通过，故将中间开孔的第一圆片光阑3切换至主光路中，滤光光阑装置工作过程同2D成像模式下的滤光光阑装置工作过程。

作为优选的技术方案中，显微成像模块9包括：第二二向色镜、显微物镜、倍率转换器、管镜；进入显微成像模块9的光束经第二二向色镜反射后进入显微成像模块9的主光路，然后聚焦于显微物镜后焦面，经过显微物镜重新变为平行光，平行光在被测样品面发生干涉，产生正弦条纹结构光并照明被测样品，激发出被测样品中的荧光，被测样品发出的荧光经过显微物镜收集、第二二向色镜滤除杂光、倍率转换器放大、管镜聚焦后进入图像采集模块10，图像采集模块10包括科学级相机。

具体的，参见图2，进入显微成像模块9的光束经二向色镜5反射后进入显微成像模块9的主光路，然后聚焦于显微物镜后焦面，经过显微物镜重新变为平行光，两束光(或者三束光)在样品面发生干涉，产生正弦结构光并照明被测样品，样品发出的荧光经过显微物镜收集，二向色镜5滤除杂光，倍率转换器的放大，管镜的聚焦，最终完成在科学级相机靶面上成像。需要指出的是，本实用新型中显微成像模块9的光路结构与常规的荧光显微镜结构类似，因此可用常规荧光显微镜(如奥林巴斯IX83科学级倒置荧光显微镜)替代，有助于系统的快速实现，提高系统的稳定性，并降低系统实现的成本。

作为优选的技术方案中，参见图8，显微成像系统本体还包括有机箱11、被动隔振平台12；

机箱11，用于提供暗室，屏蔽外界电磁干扰、人为干扰，光源模块7、照明光路模块8、显微成像模块9及图像采集模块10均设置在机箱11内；

被动隔振平台12，用于承载光源模块7、照明光路模块8、显微成像模块9、图像采集模块10，减弱外界振动对系统的干扰。

作为优选的技术方案中，参见图8，显微成像系统本体还包括有：

电子学模块13，为各机电器件供电，协调各个器件，通过有效的控制方式、合理的时序完成图像采集工作；

工作站14，控制及数据处理。

本实用新型的有益技术效果如下：

1.采用模块化的结构布局，便于设备的运输、集成和调试，易于商品化；

2.与常规荧光显微镜兼容，互换性、稳定性好，成本低，可以降低相关研究的门槛；

3.采用四色基本波长(488nm、561nm、532nm、638nm)的激发光，并可以根据实际需要，替换或者扩展，应用范围广。

4.采用了一种全新的滤光光阑装置，既可以实现2D成像(包含全内反射成像)、3D成像两种成像方式的切换，又可以有效地滤除杂光，能够进一步提高系统的分辨率。

上述本实用新型实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

在本实用新型的上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。

在本申请所提供的几个实施例中，应该理解到，所揭露的技术内容，可通过其它的方式实现。其中，以上所描述的系统实施例仅仅是示意性的，例如单元的划分，可以为一种逻辑功能划分，实际实现时可以有另外的划分方式，例如多个单元或组件可以结合或者可以集成到另一个系统，或一些特征可以忽略，或不执行。另一点，所显示或讨论的相互之间的耦合或直接耦合或通信连接可以是通过一些接口，单元或模块的间接耦合或通信连接，可以是电性或其它的形式。

作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部单元来实现本实施例方案的目的。

另外，在本实用新型各个实施例中的各功能单元可以集成在一个处理单元中，也可以是各个单元单独物理存在，也可以两个或两个以上单元集成在一个单元中。上述集成的单元既可以采用硬件的形式实现，也可以采用软件功能单元的形式实现。

集成的单元如果以软件功能单元的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，可以存储在一个计算机可读取存储介质中。基于这样的理解，本实用新型的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分或者该技术方案的全部或部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质中，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可为个人计算机、服务器或者网络设备等)执行本实用新型各个实施例方法的全部或部分步骤。而前述的存储介质包括：U盘、只读存储器(ROM，Read-Only Memory)、随机存取存储器(RAM，Random Access Memory)、移动硬盘、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。