红外光谱学系统的制作方法
发明领域
本发明涉及用于执行红外光谱学分析的设备和方法，并且特定来说，但不排它地，用于执行atr-ftir光谱学分析。
背景技术：
傅里叶变换红外(ftir)光谱学是化学科学中常用的一种技术，以便用于识别化学键的离散振动。这种技术使用中红外(mir)区域(4000到400cm-1)中(即在与化学键振动的频率范围相同的频率范围内)的光。
已知生物分子在该波长范围内主动振动，并且因此ftir光谱学适用于生物学应用。当用mir光辐射生物样品时，该能量中的一些被样品吸收。给定样品的吸收曲线代表样品中存在的化学键，并且可以被用于表征复杂的生物材料。
使用ftir光谱学的特定类型的分析的示例是对增生性疾病(例如，癌症)的研究，所述疾病由不受控制和不受调节的细胞增生引起，并且在一些情况下可以导致肿瘤的形成。
在ftir光谱学中使用三种主要采样模式：透射、透反射和衰减全反射(atr)。
在“透射”模式中，mir光直接通过或透射穿过已经沉积在ir透明基板(例如，caf2或baf2)上的给定样品。由于该模式依赖于通过样品的ir光束，因此存在对最大样品厚度和水含量的限制。
在“透反射”模式中，样品沉积在ir反射性载玻片(例如，低辐射或金属涂覆的)上。mir光通过样品，并且然后其被朝向检测器往回反射。由于光束有效地通过样品两次，样品厚度对路径长度和因此信号强度具有直接影响。如果样品中总是存在水，这也允许水的进一步吸收。由于光与基板的反射性表面的不确定的相互作用，在本领域中存在一些对与这种采样形式的关注。
“衰减全反射”(atr)采用内反射元件(ire)，ir光束通过所述内反射元件。样品直接沉积到ire上，并且与其维持紧密接触。这些ire可以由包含金刚石、锗、硒化锌或硅的多种不同的材料制成。每种材料在折射性质方面略有不同。当ir光以超过定义的角度(被描述为临界角)通过ire时，光通过该介质在内部反射。当光束遇到ire和样品界面时，这会导致产生穿透到样品中的倏逝波。这种穿透的深度取决于光的波长、ire和样品的折射率以及入射角：然而，通常在0.5μm到2μm之间的区域中。然后，光束被ire朝向检测器反射。
atr-ftir的一个益处是水吸光度对ir光谱的影响减小，从而允许对含水样品进行诊断或分析。这对于本质上将含有水的生物样品特别重要。尽管水分子在这种采样模式中仍然吸收，但倏逝波的穿透深度远小于透射和透反射ftir光谱学的路径长度。因此，少得多的水被采样，从而允许基于样品的吸光度仍然被监测。
因此，这种技术很好地适用于分析生物样品，特别是生物流体。已知这些信息丰富并且已被示出适合用于检测患者人群中的疾病。已经示出，这种技术能够使用来自433名患者队列的血清来诊断一系列严重程度的脑肿瘤(hands等人，2016年；hands等人，2014年)。
最近，在wo2014/076480中已经描述了通过对血液样品执行衰减全反射——傅里叶变换红外(atr-ftir)光谱学分析来诊断脑癌的方法。与传统atr-ir(其中样品放置在基板上，所述基板然后被带到与atr晶体接触)相反，atr晶体被用作样品的基板。该方法提供了护理点和非破坏性诊断测试。然而，在实施光谱学分析之前，需要仔细制备血液样品，并且在atr晶体可以重新用于分析另一个样品之前彻底清洁和干燥atr晶体，这既费时又昂贵。
因此，尽管atr-ftir适合用于分析生物样品，但是显着的仪器限制是atr-ftir光谱仪或用于ftir光谱仪的atr附件通常由单个ire组成。由于样品直接放置在该ire上，这将这种技术限制为单个样品方法，其中在可以使用仪器分析下一个样品之前，需要制备、分析样品，从ire中移除样品，后续接着彻底清洁ire。在像血清一样的生物流体的情况下，由于需要干燥样品以发掘微妙的生物分子信息，因此该过程显着延长。这花费的时间取决于体积，但已经确定对于1μl血清斑点为8分钟。因此，这种方法不能被视为高通量的。这种限制的原因包含当前ire的高成本，以及针对特定附件的工程要求。
us7255835(franzen等人)公开了一种用于在ftir显微镜中获取溶解的样品的红外光谱的设备和方法。
技术实现要素：
根据本发明的第一方面，提供了一种用于光谱仪中的样品载玻片，其中所述样品载玻片包括：
多个样品接收部分，所述多个样品接收部分设置在所述载玻片的样品侧上，和
多个光束接收部分，所述多个光束接收部分设置在所述载玻片的光束接收侧上，每个光束接收部分与相应的样品接收部分相反地布置，并且其中，每个光束接收部分被配置成用作内反射元件(ire)。
提供具有多个样品接收部分的样品载玻片允许从单个载玻片执行多次测量的可能性，而不必在连续测量之间移除和替换所述样品载玻片，特别是当与本发明的第二方面中所描述的装置结合使用时。这可以避免像当前实践那样在连续测量之间移除、清洁和干燥ire，因此准许高通量atr-ftir分析。
所述样品接收部分可以被对准，例如可以相对于所述载玻片纵向地对准。所述样品接收部分可以限定或可以布置为一行样品接收部分。在另一个实施例中，所述样品接收部分可以提供为或可以限定多行样品接收部分。每行可以包括多个对准的样品接收部分。
所述样品载玻片可以包括被布置成一行的多个样品接收部分。举例来说，载玻片可以包括被布置成一行的四个样品接收部分。这可以允许一个样品接收部分被用于背景测量，并且三个样品接收部分被用于来自患者的三次测量。将了解，取决于希望从单个载玻片进行的测量的数量，可以设想任何数量的样品接收部分。
所述样品载玻片可以包括多个样品接收部分，所述多个样品接收部分被布置成多行(例如，成网格图案)。举例来说，所述载玻片可以包括24个样品接收部分，所述24个样品接收部分被布置成6个4行(4×6)，例如，类似于24孔板布置。举例来说，所述载玻片可以包括96个样品接收部分，所述96个样品接收部分被布置成12个8行(8×12)，例如，类似于96孔板布置。这可以允许每行中的一个样品接收部分被用于背景测量，并且对于每行，多个样品接收部分被用于来自患者的多次测量。将了解，取决于希望从单个载玻片进行的测量的数量，可以设想任何数量的样品接收部分用于这样的网格状或孔板状布置。
可替选地，具有被布置成一行的多个样品接收部分的多个载玻片可以组合，例如，可以彼此相邻(例如，横向地和/或纵向地)放置。该布置可以允许使用多个“单行”载玻片形成具有被布置成多行的多个样品接收部分的网格图案。
一个或多个样品接收部分可以例如相对于所述载玻片的表面(例如，相对于所述载玻片的样品侧上的外表面)限定凹入部分或者可以由凹入部分组成。可替选地，或另外，一个或多个样品接收部分可以例如相对于所述载玻片的表面(例如，相对于所述载玻片的样品侧上的外表面)由升高部分包围。通过这样的设置，可以减少或避免相邻样品接收部分之间的交叉污染的风险。
通常，一个或多个样品接收部分(例如，样品接收部分)可以被配置成在使用中接收或支撑干燥样品。在实施例中，一个或多个样品接收部分(例如，上述样品接收部分)可以被配置成接收液体样品，例如生物流体，例如血液或血清，并且可以被干燥以便支持干燥样品以供在光谱仪中使用。
方便地，所述样品载玻片可以包括(多个)内反射元件ire/所述(多个)内反射元件ire。所述样品载玻片可以被配置成用作(多个)ire/所述(多个)ire。
所述载玻片的光束侧可以包括多个光束接收部分。通常，每个光束接收部分可以设置在与所述样品侧上的相应样品接收部分相反的光束侧上。
每个光束接收部分可以被配置成用作ire。
所述光束接收部分可以被配置成准许辐射光束穿透所述载玻片的光束侧上的光束接收部分的表面。有利地，所述光束接收部分可以被配置成准许辐射光束以一定角度穿透所述载玻片的光束侧上的光束接收部分的表面，使得所述辐射光束可以在相应样品接收部分的内表面上反射，并且可以被准许穿过所述光束侧上的光束接收部分的表面以离开所述载玻片。
所述/每个光束接收部分可以包括或可以限定多个凹槽和/或棱镜，优选地多个细长凹槽和/或棱镜，例如，多个对准的、平行的和/或相邻的凹槽和/或棱镜。
每个凹槽可以具有或可以限定第一凹槽面和第二凹槽面。所述/每个第一凹槽面可以被布置成允许辐射光束(例如，向内)穿透其表面。所述/每个第二凹槽面可以被布置成允许辐射光束(例如，向外)穿透其表面。
每个棱镜可以具有或可以限定第一棱镜面和第二棱镜面。所述/每个第一棱镜面可以被布置成允许辐射光束(例如，向内)穿透其表面。所述/每个第二棱镜面可以被布置成允许辐射光束(例如，向外)穿透其表面。
通常，凹槽的第一凹槽面可以对应于相邻棱镜的第一棱镜面。凹槽的第二凹槽面可以对应于相邻棱镜的第二棱镜面。
在实施例中，所述棱镜可以例如相对于所述载玻片在其所述光束侧上的表面(例如，平坦表面)向外突出。在另一个实施例中，所述棱镜可以例如相对于所述载玻片在其所述光束侧上的表面(例如，平坦表面)凹入。可替选地，所述棱镜的外部部分可以例如相对于所述载玻片在其所述光束侧上的表面(例如，平坦表面)向外突出，并且所述棱镜的内部部分可以例如相对于所述载玻片在其所述光束侧上的表面(例如，平坦表面)凹入。
所述载玻片可以例如在样品侧与光束侧之间具有在100μm到1000μm的范围内，例如在200μm到800μm的范围内，例如在300μm到700μm的范围内的厚度。在一些实施例中，所述载玻片可以例如在样品侧与光束侧之间具有大约380μm、525μm或675μm的厚度。
所述/每个凹槽或棱镜可以具有在50μm到500μm的范围内，例如在50μm到300μm的范围内，例如在100μm到250μm的范围内的宽度，例如最大宽度。在一些实施例中，所述/每个凹槽或棱镜可以具有大约100μm、150μm、200μm或250μm的宽度，例如最大宽度。
所述/每个凹槽或棱镜可以具有在50μm到500μm的范围内，例如50μm到300μm的范围内，例如70μm到200μm的范围内的深度，例如最大深度。在一些实施例中，所述/每个凹槽或棱镜可以具有大约70μm、100μm、140μm或175μm的深度，例如最大深度。
相邻凹槽可以具有在0μm到200μm的范围内，例如在10μm到150μm的范围内，例如在25μm到100μm的范围内的间距。在一些实施例中，相邻凹槽可以具有大约25μm、50μm或100μm的间距。当相邻凹槽之间的间距存在时，相应棱镜的最外区域包括例如在其尖端或最外区域处的水平和/或平坦部分。
表面(例如第一面和/或第二面或/每个凹槽或棱镜)可以例如相对于所述载玻片例如在其光束侧上的表面以在30°到75°(例如35°到55°)的区域中的角度延伸。将了解，为给定载玻片选择的准确角度可以取决于为制造所述载玻片而选择的材料和/或取决于所述辐射光束的预期入射角。举例来说，凹槽面和/或棱镜面的角度可以取决于所使用的特定材料和/或其晶体结构。当所述载玻片由<100>硅材料制成时，第一面和/或第二面或所述/每个凹槽或棱镜可以例如相对于所述载玻片例如在其光束侧上的表面以在40°到75°(例如45°到65°)的区域中(例如大约55°，例如54.74°)的角度延伸。当所述载玻片由<110>硅材料制成时，第一面和/或第二面或所述/每个凹槽或棱镜可以例如相对于所述载玻片例如在其光束侧上的表面以在30°到50°(例如30°到40°)的区域中(例如大约35°，例如35.3°)的角度延伸。
所述样品载玻片可以由适合用作ire的材料(举例来说，锗、金刚石、硒化锌或硅)制成。有利地，所述样品载玻片可以由硅制成。硅的使用可以大大降低与所述载玻片的制造相关联的成本，并且可以允许所述载玻片用作一次性载玻片，因此避免在使用之前和/或在使用之后清洁和干燥所述载玻片的需要。
所述样品载玻片可以包括载玻片保持器，可以设置在载玻片保持器之上或之内，或者可以附接到载玻片保持器。
所述载玻片保持器可以被配置成接收和/或保持所述样品载玻片。
使用载玻片保持器来保持所述样品载玻片可以有助于防止或减少用户与所述样品载玻片之间的接触，因此减少与处理所述载玻片相关联的污染。当所述样品载玻片包括或用作所述(多个)内反射元件时，这是特别有利的。使用载玻片保持器还可以为所述样品载玻片提供额外结构完整性，因此降低所述载玻片的损坏或机械故障的风险。
通常，所述载玻片保持器可以由聚合物材料(例如，abs(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)，聚碳酸酯，聚丙烯等)制成。可替选地，所述载玻片保持器可以由金属材料(例如，铝)制成。
有利地，所述载玻片保持器可以具有与显微镜载玻片的标准尺寸对应的尺寸。通常，所述保持器的尺寸可以是大约75×25×1mm。这可以通过符合现有的处理程序并且避免需要改变通用程序而帮助将所述样品载玻片用于传统实验室中。
所述载玻片保持器可以设置有适合用于接收标识符(例如，与在所述保持器中接收的载玻片和/或所述样品相关联的唯一标识符)的标签区域。所述样品标识符可以包括或可以是条形码、qr码或类似物，并且可以含有与所述样品和/或受试者相关联的信息。
所述样品保持器可以设置有可以为用户提供关于一个或多个样品接收区域或孔的信息的孔标记，例如，用于相应背景孔或多个相应背景孔的一个或多个标记，以及用于相应样品孔的一个或多个标记。
所述样品保持器可以具有样品侧和光束侧。
在其样品侧上，所述载玻片保持器可以包括或可以限定具有足以暴露一个或多个样品接收部分的尺寸的至少一个窗口或开口。在实施例中，所述载玻片保持器可以包括或可以限定多个窗口或开口，每个窗口或开口对应于所述载玻片的相应样品接收部分。所述窗口或开口可以是与它们相应的样品接收部分的尺寸类似的尺寸。提供单独的窗口可以在所述载玻片的相邻样品接收部分之间提供另外的物理屏障，因此进一步降低了相邻样品接收部分之间交叉污染的风险。一个或多个窗口或开口(例如，每个窗口或开口)可以具有大约1到10mm×1到10mm的尺寸。通常，一个或多个窗口或开口(例如，每个窗口或开口)可以具有大约5mm×5mm的尺寸。
在其光束侧上，所述载玻片保持器可以包括或可以限定具有足以暴露所述载玻片的光束接收部分的尺寸的至少一个窗口或开口。在实施例中，所述样品保持器可以包括或可以限定在其光束侧上的窗口或开口，所述窗口或开口具有足以暴露所述载玻片的多个光束接收部分的尺寸。在另一个实施例中，所述样品保持器可以包括或可以限定在其光束侧上的多个窗口或开口，每个窗口或开口对应于所述载玻片的相应的光束接收部分。所述窗口或开口可以是与它们相应的光束接收部分的尺寸类似的尺寸，例如大约1到10mm×1到10mm，例如，5mm×5mm。
根据本发明的第二方面，提供了一种与光谱仪一起使用的装置，所述装置包括：
载物台，所述载物台被配置成接收样品载玻片；和
移动机构，所述移动机构被配置成相对于所述装置的样品测量位置移动所述样品载玻片。
有利地，所述样品载玻片可以被配置成接收多个样品。所述样品载玻片可以包括多个样品接收部分。提供被布置成相对于所述样品测量位置移动所述样品载玻片的移动机构允许在不必在连续测量之间移除和替换所述样品载玻片的情况下分析多个样品。当所述样品载玻片包括或包含一个或多个ire或一个或多个ire部分时，这是有利的，因为这避免了在连续测量之间移除、清洁和干燥所述ire或ire部分的需要。
所述样品载玻片可以包括样品侧和光束侧。
所述样品侧可以包括或可以限定多个样品接收部分。在实施例中，所述样品接收部分可以被对准，例如可以相对于所述载玻片纵向地对准。所述样品接收部分可以限定或可以布置为一行样品接收部分。在另一个实施例中，所述样品接收部分可以提供为或可以限定多行样品接收部分。每行可以包括多个对准的样品接收部分。
所述样品载玻片可以是根据本发明的第一方面的样品载玻片，其特征同样适用于根据第二方面的装置，并且因此仅仅为了简洁起见，这里不再重复其中描述的特征。
所述载物台被配置成接收样品载玻片。
所述载物台可以被配置成接收和/或固定所述样品载玻片。
当所述样品载玻片设置在载玻片保持器之上或之内，或者附接到载玻片保持器时，所述载物台可以被配置成接收和/或固定所述载玻片保持器。
所述移动机构可以被配置成移动所述载物台。所述样品载玻片和/或载玻片保持器可以相对于所述载物台是静止的。在这样的事例中，可以通过移动所述载物台来引起相对于所述样品测量位置移动所述样品载玻片。
所述移动机构可以被配置成移动所述样品载玻片。所述样品载玻片可相对于所述载物台移动。在这样的事例中，可以通过移动所述样品载玻片本身来引起相对于所述样品测量位置移动所述样品载玻片。
所述移动机构可以被配置成提供单向移动。当使用具有被布置成一行的多个样品接收部分的样品载玻片时，这可能是特别有利的。
所述移动机构可以被配置成例如在基本上平行于接收所述(多个)样品的载玻片的表面的平面中提供举例来说沿着两个垂直轴线的双向移动。当使用具有被布置成多行(例如成网格图案)的多个样品接收部分的样品载玻片时，这可能是特别有利的。
所述移动机构可以被配置成提供或允许在横向(例如，基本上垂直)于所述载玻片(例如，基本垂直于其上表面)的方向上的移动。这可能是有利的，因为它可以允许在不需要调节所述(多个)光学元件的情况下调节所述样品相对于所述光束的位置。
举例来说，所述移动机构可以被配置成提供或允许沿着所述载玻片的纵向轴线和/或在与一行/所述行样品接收部分大体对准的方向上和在横向(例如，垂直)于所述载玻片(例如，基本上垂直于其上表面)的方向上的移动。
可替选地，移所述动机构可以被配置成提供或允许多方向(举例来说，沿着三个垂直轴线，例如沿着平行于接收所述(多个)样品的载玻片的表面的平面中的两个垂直轴线和沿着基本上垂直于那个平面的第三轴线)移动。
可以提供至少一个马达。所述移动机构可以包括所述(多个)马达。所述移动机构(例如(多个)马达)可以由致动器致动和/或控制。所述致动器可以手动地和/或自动地控制。
在使用中，所述移动机构(例如所述马达)可以引起所述样品载玻片、载玻片保持器和/或载物台移动达与两个相邻样品接收部分之间的距离对应的距离，例如达两个相邻样品接收部分的中心区域之间的距离。通过这样的设置，在使用中，所述移动机构可以允许样品载玻片顺序地移动，以便使其样品接收部分和/或光束接收部分与所述样品测量位置处/中的辐射光束/所述辐射光束对准。这可以允许使用传统atr-ftir光谱仪对多个样品进行自动和/或高通量测量。
所述装置可以进一步包括至少一个光学元件，所述至少一个光学元件被配置成将由光谱仪/所述光谱仪产生的辐射光束引导到该装置的样品测量位置。
至少一个光学元件可以设置在光学隔间内。光学隔间可以包括一个或多个光学元件，通常是多个光学元件。
一个或多个光学元件可以包括或可以是一个或多个反射镜。
光学元件可以被布置成将由光谱仪产生的辐射光束引导(例如，反射)到样品测量位置/所述样品测量位置。
光学元件可以被布置成将由样品载玻片反射的辐射光束(例如，通过其ire)引导(例如，反射)到光谱仪的检测器。
该装置，例如其光学隔间，可以具有入口，以允许由光谱仪产生的辐射光束进入光学隔间。该装置，例如其光学隔间，可以具有出口，以允许由样品载玻片反射的辐射光束(例如，通过其ire)离开光学隔间。
该装置可以被配置成使得当装置安装或配装在光谱仪/所述光谱仪上时，所述装置的样品测量位置位于或基本上位于其中在使用所述光谱仪期间将使用传统反射配件或atr配件来放置样品的位置。举例来说，所述装置被配置成使得所述样品测量位置被布置成接收所述光谱仪的辐射光束。因此，所述装置可以被认为是与传统光谱仪一起使用的配件。
所述装置(例如，光学隔间)可以被配置成使得入口和出口与所述辐射光束的法线方向对准，即，与当所述装置不存在时所述辐射光束的方向对准。因此，所述装置可以被认为是与传统光谱仪一起使用的配件。
在实施例中，所述光学隔间可以具有多个反射镜(例如，三个反射镜)，所述多个反射镜被配置成以预定的入射角将所述辐射光束引导到所述ire，并且使所修改光束朝向所述检测器往回返回。所述反射镜可以是平坦的、弯曲的或其组合。在实施例中，所述光学隔间可以包括3个反射镜，例如将所述辐射光束从所述入口反射到所述样品测量位置的平面镜，以及3个反射镜，例如将所述辐射光束返回到所述出口的平面镜，例如三个不同的平面镜。在另一个实施例中，所述光学隔间可以包括一个或多个曲面镜或者平面镜和曲面镜的组合，并且还可以任选地包括一个或多个透镜或聚焦元件。本领域普通技术人员将了解，所述光学元件(例如，反射镜)可以被布置成以期望的角度将所述辐射光束引导或传递到所述样品测量位置，所述角度可以取决于所述载玻片和其(多个)ire部分的配置和材料。
所述光学元件中的一个或多个可以是可调节的。通过这样的设置，可以调节所述辐射光束在所述载玻片上的入射角。这可以允许使用具有不同配置的载玻片和/或由不同材料制成的载玻片。
关于本发明的任何其它方面描述的特征同样适用于根据第二方面的装置，并且因此为了简洁起见在这里不再重复。
根据本发明的第三方面，提供了一种与光谱仪一起使用的装置，所述装置包括：
至少一个光学元件，所述至少一个光学元件被配置成将由所述光谱仪产生的辐射光束引导到所述装置的样品测量位置。
载物台，所述载物台被配置成接收样品载玻片；和
移动机构，所述移动机构被配置成相对于所述样品测量位置移动所述样品载玻片。
所述装置(例如，光学隔间)可以被配置成使得入口和出口与所述辐射光束的法线方向对准，即，与当所述装置不存在时所述辐射光束的方向对准。因此，所述装置可以被认为是与传统光谱仪一起使用的配件。
关于本发明的任何其它方面描述的特征同样适用于根据第三方面的装置，并且因此仅仅为了简洁起见，这里不再重复。
根据本发明的第四方面，提供了一种用于测量样品的方法，所述方法包括：
将装置联接到光谱仪，
将具有多个样品接收部分的样品载玻片放置在所述装置的载物台上；
相对于所述样品测量位置移动所述样品载玻片，以便顺序地分析、测量或检测设置在所述载玻片上的多个样品。
术语“联接”在本文中应理解为意指所述装置可与光谱仪一起使用。通常，在使用中，所述装置可以物理连接到所述光谱仪，举例来说，可以放置/安放到所述光谱仪的一部分上，可以插入于所述光谱仪的内部部分内，和/或可以任选地固定或附接到所述光谱仪，举例来说，以降低分析期间断开连接和/或移动的风险。
术语“分析”在本文中将被理解为包含测量、检测、处理或类似物。因此，术语“分析”在本文中将被理解为指代通过ftir光谱测定法测量或检测样品，并且还可以任选地包含但未必是举例来说使用多变量分析、处理算法、机器学习和/或主成分分析(pca)进一步处理所测量的信息。举例来说，pca的使用允许数据集之间的变量被比较、可视化和/或突出显示，因此识别样品之间的可能变化，例如生物变化。
所述装置可以具有包括入口和出口的光学隔间，其中所述入口被布置成允许由所述光谱仪产生的辐射光束进入所述光学隔间，并且所述出口被布置成允许由样品载玻片反射的辐射光束到离开所述光学隔间。
所述方法可以包括将由所述光谱仪产生的辐射光束从所述入口引导到所述装置的样品测量位置。
所述方法可以包括将由所述样品载玻片反射的辐射光束从所述样品测量位置引导到所述装置的出口。
所述光谱仪可以是ir光谱仪，例如ftir光谱仪，通常是atr-ftir光谱仪，例如配备有或联接到atr元件的ftir光谱仪。
所述方法可以使用傅里叶变换ir(ftir)光谱学分析。在ftir中，ir光谱可以在400到4000波数(cm-1)的区域中收集。通常，所述ir光谱可以具有10cm-1或更小的分辨率，通常为大约8cm-1或4cm-1。所述ftir光谱学分析可以采用至少10次扫描、至少15次扫描或至少30次扫描。所述ftir光谱学分析可以采用最多100次扫描、最多50次扫描或最多40次扫描。举例来说，可以使用32次扫描。扫描可以被共同添加。如技术人员将了解的，可以选择扫描的数量以优化数据内容和数据采集时间。
所述方法可以使用衰减全反射(atr)-ir光谱学分析。在一些实施例中，所述光谱学分析可以是atr-ftir。
所述方法可以包括将一个或多个样品放置在所述样品载玻片上。所述方法可以包括将样品放置在所述载玻片的一个或多个样品接收部分上。至少一个样品(例如，多个样品)可以包括生物样品，例如生物流体，例如血液或血清。通常，当在所述载玻片上提供所述(多个)样品时，所述(多个)样品可以呈液体形式。至少一个样品(例如，多个样品)可以包括非生物样品。
所述方法可以包括干燥一个或多个样品(例如，多个样品)。通常，所述方法可以包括干燥所述样品载玻片上的一个或多个样品。方便地，所述方法可以包括在将所述样品载玻片放置在所述装置的载物台上之前干燥所述样品载玻片上的一个或多个样品。这可以改进所述载玻片的可处理性。
所述方法可以包括在优化条件下干燥所述(多个)样品。已经发现，令人惊讶地，所述干燥条件可能影响在后续分析期间获得的光谱。特定来说，已经发现，某些干燥条件可以导致分析的改进的再现性和/或所述光谱中的锐度和/或强度。
所述方法可以包括在大约30℃到36℃，例如约33℃到36℃，例如约34.5℃到35.5℃，例如约35℃的温度下干燥所述(多个)样品和/或样品载玻片。
所述方法可以包括在气流(例如，空气流)下(例如在受控气流条件下)干燥所述(多个)样品和/或样品载玻片。流速可以在约5m3/h到200m3/h，例如约10m3/h到125m3/h，例如约15m3/h到115m3/h的范围内。所述流速可以是至少10m3/h，例如至少15m3/h，例如至少50m3/h，例如至少90m3/h。
所述方法可以包括使气体(例如，空气)流过所述(多个)样品，举例来说，达预定的时间长度。
所述方法可以包括干燥所述(多个)样品和/或样品载玻片，使得所述样品和/或样品载玻片的干燥时间是大约1到5分钟，例如1到3分钟，例如大约2分钟。
关于本发明的任何其它方面描述的特征同样适用于根据第四方面的方法，并且因此为了简洁起见在这里不再重复。
根据本发明的第五方面，提供了一种用于测量样品的方法，该方法包括：
将装置联接到光谱仪，所述装置具有包括入口和出口的光学隔间，其中所述入口被布置成允许由所述光谱仪产生的辐射光束进入所述光学隔间，并且所述出口被布置成允许所述辐射光束由样品载玻片反射以离开所述光学隔间，
将具有多个样品接收部分的样品载玻片放置在所述装置的载物台上；
相对于所述样品测量位置移动所述样品载玻片，以便顺序地分析、测量或检测设置在所述载玻片上的多个样品。
通常，在使用中和/或在测量期间，与相应的样品接收部分相关联的一个或多个样品(例如，每个样品)可以是干燥的。
关于本发明的任何其它方面描述的特征同样适用于根据第五方面的方法，并且因此为了简洁起见在这里不再重复。
根据本发明的第六方面，提供了一种制备用于ir光谱分析的样品的方法，所述方法包括在气流条件下干燥在样品载玻片上的一个或多个样品。
已经发现，令人惊讶地，所述干燥条件可能影响在后续分析期间获得的光谱。特定来说，已经发现，某些干燥条件可以导致分析的改进的再现性和/或所述光谱中的锐度/强度。
所述方法可以包括将一个或多个样品放置在所述样品载玻片上。所述方法可以包括将样品放置在所述载玻片的一个或多个样品接收部分上。至少一个样品(例如，多个样品)可以包括生物样品，例如生物流体，例如血液或血清。通常，当在载玻片上提供所述(多个)样品时，所述(多个)样品可以呈液体形式。
所述方法可以包括在大约30℃到36℃，例如约33℃到36℃，例如约34.5℃到35.5℃，例如约35℃的温度下干燥所述样品和/或样品载玻片。
所述方法可以包括在受控气流条件下干燥所述样品和/或样品载玻片。流速可以在约5m3/h到200m3/h，例如约10m3/h到125m3/h，例如约15m3/h到115m3/h的范围内。流速可以是至少10m3/h，例如至少15m3/h，例如至少50m3/h，例如至少90m3/h。
所述方法可以包括使气体(例如，空气)流过所述(多个)样品，举例来说，达预定的时间长度。
所述方法可以包括干燥所述样品和/或样品载玻片，使得所述样品和/或样品载玻片的干燥时间是大约1到5分钟，例如1到3分钟，例如大约2分钟。
关于本发明的任何其它方面描述的特征同样适用于根据第六方面的方法，并且因此为了简洁起见在这里不再重复。
附图说明
现在将仅通过示例方式并且参考附图来描述本发明的各个方面，其中：
图1是atr-ir光谱学的原理的示意性表示；
图2是示出了用于执行atr-ir光谱学分析的单个ire的传统装置的示意性表示；
图3是根据本发明的实施例的样品载玻片的侧视图；
图4是图3的样品载玻片的左侧视图；
图5是图3的样品载玻片的俯视图；
图6是图3的样品载玻片的仰视图；
图7是图3的样品载玻片的立体透视图；
图8是根据本发明的样品载玻片的替代实施例的立体透视图；
图9是示出了由ire反射的辐射光束的图3的样品载玻片的横截面视图；
图10是示出了由ire反射的辐射光束的图8的样品载玻片的横截面视图；
图11是示出了保持图3的样品载玻片的保持器的上侧的立体透视图；
图12是示出了保持图3的样品载玻片的保持器的下侧的立体透视图；
图13是示出保持根据本发明的另一个实施例的样品载玻片的保持器的上侧的立体透视图；
图14是示出图13的保持器下侧的立面透视图；
图15是示出根据本发明的实施例的与光谱仪一起使用的装置的立体透视图。
图16是图15的装置的俯视图；
图17是图15的装置的光学隔间的示意性横截面视图；
图18a是示出了对于在30°到80°的范围内的ire最佳入射角的研究的atr-ftir光谱；
图18b是示出了对于在30°到50°范围内的ire最佳入射角的研究的atr-ftir光谱；
图18c是示出了在光谱预处理之后在30°到50°的范围内的ire最佳入射角的研究的atr-ftir光谱；
图19是示出了在分析之前用于干燥样品的温度的效应的atr-ftir光谱；
图20是示出了在分析之前被施加以干燥样品的气流的效应的atr-ftir光谱；
图21是示出了在分析之前被施加以干燥样品的温度和气流的组合效应的atr-ftir光谱；
图22是示出对应于针对不同温度羟基吸光度峰值的曲线下的平均面积的表格；
图23是示出对应于针对不同温度酰胺i基团的吸光度峰值的平均强度的表格；
图24是示出对应于针对不同温度羟基吸光度峰值的测量值的标准偏差的表格；
图25是示出对应于针对不同温度酰胺i基团的吸光度峰值的测量值的标准偏差的表格；
图26是根据本发明的实施例的用于分析样品的方法的示意图；
图27是示出根据本发明的另一个实施例的样品载玻片和保持器的上侧的立体透视图；
图28是根据本发明的另一个实施例的与光谱仪一起使用的装置的前侧的立体透视图；
图29是图28的装置的后侧的立体透视图；
图30示出了传统的specacquestatr-ftir配件；
图31示出了装配有根据本发明的实施例的装置的图30的配件；
图32示出了具有图27的样品载玻片和保持器的图28到图29的装置；
图33示出了使用图3的样品载玻片(图33(a)到图33(c))与金标准金刚石atr配件(图33(d))的三个ftir仪器之间的光谱质量的比较；
图34示出了ftir光谱仪中的sire集成的替代方法和相关snr1值，描绘了：(a)在改装的atr配件上的图3的样品载玻片；和(b)在镜面反射配件上的图3的样品载玻片；
图35图示了gbm(红色)和非癌症(蓝色)患者的主成分分析(pca)散点图，其中标示了个别患者以便观察sire孔之间的可变性；
图36是示出了某些尺寸参数的根据本发明的样品载玻片的实施例的横截面视图；
图37示出了针对宽度、间距和厚度的各种组合的研究的所有36个单独ire设计的信噪比(snr)；
图38示出了从不同厚度设计获得的光谱的比较；
图39示出了在凹槽之间具有不同的距离的ire设计的峰值强度的比较；
图40示出了从根据本发明的实施例的多孔硅载玻片和传统金刚石ire获得的光谱之间的比较；
图41是图36的样品载玻片的特定实施例的横截面视图；
图42到图44图示了接受黑素瘤治疗的三个不同患者的主成分分析(pca)散点图；并且
图45到图49图示了关于细菌样品使用根据本发明实施例的方法实施的光谱分析的结果。
具体实施方式
参考图1，示出了atr-ir光谱学的原理的示意性表示。在图2中，在传统设置的背景下图示了这些原理，从而示出了用于执行atr-ir光谱学分析的单个ire。
如图1和图2中所示，“衰减全反射”(atr)采用内反射元件(ire)10，ir光束20通过内反射元件(ire)10。样品30直接沉积到ire10上。ire的特定折射性质取决于制造ire的材料，所述材料可以是举例来说金刚石、锗、硒化锌或硅。如图1中所示，当ir光束20以高于临界角的角度θ1通过ire10时，光束20在其与样品30接触的上表面12上通过该介质内部地反射。当光束20遇到ire和样品界面12时，这导致倏逝波14的产生，倏逝波14穿透到样品30中。该穿透的深度取决于ire10和样品30的折射率，并且通常在0.5μm到2μm的范围内。然后含有关于样品30的信息的光束20由ire10朝向检测器反射。
图3到图6图示了根据本发明的实施例的通常标示为100的样品载玻片的实施例的各种视图。
如图3和图5中最佳示出的，在这个实施例中，载玻片100具有设置在载玻片100的样品侧115上并且被布置成一行的四个样品接收部分111、112、113、114。提供具有多个样品接收部分111到114的样品载玻片100允许在不必在连续测量之间移除和替换样品载玻片100的情况下从单个载玻片100执行多次测量的可能性。这可以避免像当前实践那样在连续测量之间移除、清洁和干燥ire，因此准许高通量atr-ftir分析。
在这个实施例中，载玻片100在其样品侧115上的表面116基本上是平坦的。然而，在其它实施例中，样品接收部分111到114中的一个或多个可以例如相对于载玻片100的上表面116限定凹入部分或者可以由凹入部分组成。可选地，或另外，样品接收部分111到114中的一个或多个可以例如相对于载玻片100的上表面116由升高部分包围。
如图6中最佳所示，样品载玻片100还具有设置在载玻片100的光束侧125上的四个光束接收部分121、122、123、124。每个光束接收部分121到124与相应的样品接收部分111到114相反地布置。有利地，每个光束接收部分121到124被配置成用作内反射元件(ire)。举例来说，在这个实施例中，一个样品接收部分121可以被用于背景测量，并且三个样品接收部分122、123、124被用于受试者的样品的三次测量，或用于测量来自一个或多个受试者的三个单独样品。
有利地，载玻片100含有并且用作执行atr-ftir分析所需的内反射元件((多个)ire)。
如图4和图6中最佳所示，光束接收部分121到124被配置成准许辐射光束穿透载玻片100的光束侧125上的光束接收部分121到124的表面。
每个光束接收部分121到124限定/具有多个细长凹槽126和棱镜127。方便地，每个光束接收部分121到124限定/具有多个对准的、平行的和相邻的凹槽126和棱镜127。
如图4、图9和图10中最佳所示，每个凹槽126具有第一凹槽面128和第二凹槽面129。每个棱镜127还具有对应于第一凹槽面的第一棱镜面128和对应于第二凹槽面129的第二棱镜面129。
每个第一凹槽面128或第一棱镜面128被布置成允许辐射光束20向内穿透相应棱镜127的表面。每个第二凹槽面129或第二棱镜面129被布置成允许辐射光束20向外穿透相应棱镜127的表面。
在图7和图9的实施例中，棱镜127相对于载玻片100在其光束侧125上的下表面117向外突出。
在图8和图10的实施例中，棱镜127相对于载玻片100在其光束侧125上的下表面117凹入。
可以设想替代实施例，其中棱镜127的外部部分可以相对于载玻片100在其光束侧125上的下表面117向外突出，并且棱镜127的内部部分可以相对于下表面117凹入。
在本文中所描述的实施例中，制造载玻片100的厚度(t)以测试多种配置和尺寸，并且以以下厚度测试每种类型的载玻片：380μm、525μm和675μm。
设想并且实验了凹槽126和棱镜127的各种尺寸，如下表格1所图示：
表格1
如图36到图41所表示，对用作用于载玻片100的ire元件的光束接收部分121到124的结构和设计实施了进一步的研究。
如图36中所示，用作ire元件的每个光束接收部分121到124具有厚度(t)，并且凹槽126具有宽度(w)并且由间距(s)分开。针对100μm、150μm、200μm和250μm的宽度(w)，25μm、50μm和100μm的间距(s)和380μm、525μm和675μm的厚度(t)执行了测试。所有载玻片均由硅制成。
预期更大的凹槽宽度(w)可以允许更多的ir光联接到ire元件(光束接收部分121到124)中，并且因此提高了信号通量和强度。还认为降低(多个)相邻凹槽之间的间距可以减少ire孔下方的光散射，从而减少由在检测器处重新组合的杂散光引起的噪声。最后，随着ire厚度(t)的降低，信号质量有望得到提高。这是因为通过ire(光束接收部分121到124)的ir光束的有效路径长度减小了，因此防止特定ir能量带被吸收到ire本身的材料中，这将导致特定波数处的信号丢失。
通过取酰胺i带区域(1625cm-1到1675cm-1)的平均信号值
在图37中示出了指示所有36个单独ire设计(表示宽度、间距和厚度的每个组合)的信噪比(snr)的结果。颜色指示所研究的3个厚度(红色＝380μm、绿色＝525μm、蓝色＝675μm)。
从图37得出结论，380μm的厚度将产生具有更为可期望的snr的光谱。这是一个意想不到的结果，因为尽管预计ire的厚度与低于1500波数的更高信息含量有关，但信噪比的显着提高证明了380微米方法的优越性。
在图38中示出了从不同厚度的设计获得的光谱的比较。对于这个实验，在每种情况下，凹槽之间的(多个)间距和凹槽宽度(w)保持恒定。
从图38中可以看出，380μm厚的ire的峰值较高，指示光谱强度较高。还可以看出，在较薄的ire中，可以在酰胺1和2带区域处观察到提高的信号强度。通过单向anova和tukey事后比较进一步证实了较薄的硅ire在较厚元件上方的改进，这确认了从380μm厚的ire获得的光谱与从525μm和675μm厚的ire获得的光谱之间存在显着差异(对于95％置信区间，p<0.001)。使用minitab实施统计分析。
图39中示出了在v形凹槽之间具有不同距离的ire设计的峰值强度的比较(绿色＝25μm、蓝色＝50μm、红色＝100μm)。
这并未表明凹槽宽度(w)和间距(s)对snr的显着影响。在snr与凹槽宽度(w)或凹槽之间的间距(s)之间似乎不存在可辨别的关系。然而，当在参数宽度和间距保持恒定的情况下观察光谱强度时，似乎是，凹槽之间的较小间距导致较大的信号强度(图39)。该观察结果在所有t和w值处都是一致的。
硅自然吸收某些红外频率范围的光。更具体地说，硅可以截止低于1500cm-1波数的信号，因为允许光束足够长时间行进穿过硅。可以通过降低光束行进穿过硅晶体的距离减少这种效应。图40示出了从本发明的多孔硅ire获得的光谱与从specac有限公司获得的传统金刚石ire之间的比较。
从图40可以看出，仍然可以使用硅ire获取低于1500cm-1的信号。然而，仍然可以观察到硅晶格吸收的效应。在使用硅ire获得的光谱中，在约610cm-1波数处可以看到波谷。这是预期的，并且指示信号由于内部晶格振动而丢失。
使用硅作为用于制造载玻片100的材料是特别有利的，因为这大大降低了与载玻片100的制造相关联的成本，并且允许载玻片100作为一次性载玻片使用和销售，因此避免了在使用之前和/或之后清洁和干燥载玻片的需要。
基于以上观察，制作了根据本发明的载玻片的有利实施例，如图41所图示，其具有四个5×5mm的光束接收部分121到124，并且具有380μm的厚度。凹槽宽250μm，其中凹槽之间的间距为25μm。
另外，研究了第一面128和第二面129或凹槽126和棱镜127的最佳角度，如参考图18更详细地解释的。发现由硅制成的载玻片100的适合角度对于<100>硅载玻片为约54.74°，对于<110>硅载玻片为约35.3°。将了解，为给定载玻片选择的准确角度可以取决于为制造载玻片而选择的材料，和/或取决于辐射光束的预期入射角。
现在参考图9和图10，分别示出了图7和图8的样品载玻片100的横截面视图，示出了由载玻片100的ire结构反射的辐射光束20。将理解，出于图示的目的，示出了光束的路径，并且实际的光束路径可以偏离图9和图10中所示的路径。举例来说，在不希望受理论束缚的情况下，据认为，在光束20已经进入载玻片100(举例来说，穿过棱镜127的第一面128的表面)之后，光束20可以在载玻片100的内表面116上反射并且离开载玻片100之前沿着棱镜127的方向行进，举例来说，穿过另一个棱镜127的第二面129。
参考图11和图12，示出了保持器130的上侧和下侧，保持器130被配置用于保持图3的样品载玻片100。
使用载玻片保持器130来保持样品载玻片100可以帮助防止或减少用户与样品载玻片100之间的接触，因此减少与处理载玻片100相关联的污染，这是特别有利的，因为样品载玻片100包括并且用作(多个)内反射元件。使用载玻片保持器130还为样品载玻片提供了额外的结构完整性，因此降低了载玻片100的损坏或机械故障的风险。
有利地，载玻片保持器130具有与显微镜载玻片的标准尺寸对应的尺寸，通常为大约75×25×1mm。这可以通过符合现有的处理程序并且避免需要改变通用程序而帮助将样品载玻片100用于传统实验室中。
样品保持器具有样品侧136和光束侧137。
在其样品侧136上，载玻片保持器130具有四个窗口131到134，每个窗口对应于并且具有与载玻片100的相应样品接收部分111到114类似的尺寸。通常，每个窗口131到134和样品接收部分111到114具有大约5mm×5mm的尺寸，这可以允许每个样品接收部分111到114在使用中保持大约1-10μl的样品。
在其光束侧137上，载玻片保持器130具有窗口135，窗口135具有足以暴露载玻片100的光束接收部分121到124的尺寸。在替代实施例中，可以设想，载玻片保持器130可以包括或者可以限定在其光束侧137上的多个窗口，每个窗口或开口对应于载玻片100的相应的光束接收部分121到124。
载玻片保持器130设置有标签区域138，标签区域138适合用于接收标识符139，标识符139可以与接收在保持器130中的载玻片100相关联并且与沉积在载玻片100上的样品相关联。
图27中示出了标示为130b的保持器的另一个实施例。图27的保持器130b大体类似于图11的保持器130，相同的部件由相同附图标记标示，由后缀“b”补充。图27的保持器130b具有箭头a，箭头a示出了保持器130b和载玻片100b在使用中的移动方向，以将与其相应的样品接收部分111b-114b相反的光束接收部分(未示出)中的每一个与光谱仪的光束顺序地对准。保持器130b还具有标记0、1、2、3，以允许容易地标示和参考每个样品接收部分111b到114b。
现在参考图13和图14，分别示出了根据本发明的另一个实施例的保持器230和对应的样品载玻片200的上侧和下侧。在这个实施例中，载玻片200具有96孔板配置，即，具有被布置成12个8行的96个样品接收部分211。每个孔接收部分211在载玻片200的光束侧227上具有对应的光束接收部分221。
在其样品侧236上，载玻片保持器230具有96个窗口231，每个窗口对应于并且具有与载玻片200的相应样品接收部分211类似的尺寸。
在其光束侧237上，载玻片保持器230具有窗口235，窗口235具有足以暴露载玻片200的光束接收部分221的尺寸。在替代实施例中，可以设想，载玻片保持器230可以包括或可以限定在其光束侧237上的多个窗口，每个窗口或开口对应于载玻片200的相应的光束接收部分221。
将了解，取决于希望从单个载玻片200进行的测量的数量，可以设想任何数量的样品接收部分用于这样的网格状或孔板状布置。
图15和图16分别示出了根据本发明的实施例的与光谱仪一起使用的通常标示为300的装置的立面透视图和俯视图。
装置300包括具有多个光学元件311到316的光学隔间310，多个光学元件311到316被配置成将由光谱仪产生的辐射光束20引导到装置300的样品测量位置320(图17中所示)。
装置还具有载物台330，载物台330被配置成接收样品载玻片340。在这个实施例中，样品载玻片340是如参考图3到图12所描述的载玻片100，并且设置在与如参考图11和图12所描述的保持器130类似的保持器350内。因此，在这个实施例中，载物台330被配置成接收和固定保持样品载玻片340的载玻片保持器350。
装置300含有移动机构360，移动机构360被配置成相对于样品测量位置320移动样品载玻片340。在这个实施例中，由于样品载玻片340设置在载玻片保持器350内，所以移动机构360被配置成相对于样品测量位置320移动保持样品载玻片340的载玻片保持器350。
因为载玻片340具有四个样品接收部分341到344，所以提供移动机构360以相对于样品测量位置320移动样品载玻片340，这允许在不必在连续测量之间移除和替换样品载玻片340的情况下分析多个样品。当样品载玻片包括或包含一个或多个ire时，这是有利的，因为这避免了在连续测量之间移除、清洁和干燥(多个)ire的需要。
在这个实施例中，移动机构360被配置成移动载物台330。由于样品载玻片340和载玻片保持器350相对于载物台330静止，所以移动载物台330导致样品载玻片340被相对于样品测量位置320移动。
在这个实施例中，因为样品载玻片340具有在纵向方向上对准的四个样品接收部分341到344，所以移动机构360被配置成在样品接收部分341到344的对准方向上提供单向移动。
然而，如果使用不同的载玻片，举例来说，参考图13和图14所描述的载玻片200，则移动机构360可以被配置成提供举例来说沿着两个垂直轴线的双向移动，以便允许96个样品接收部分211中的每一个与样品测量位置320顺序地对准。
移动机构360包括用于移动载物台330的马达362。移动机构360(例如，马达362)可以由致动器(未示出)控制，所述致动器可手动地和/或自动地激活。
在使用中，移动机构360(例如，马达362)使得载物台330以及因此样品载玻片340移动达与两个相邻的样品接收部分341到344之间的距离对应的距离。通过这样的设置，在使用中，移动机构360允许样品载玻片340顺序地移动，以便使其样品接收部分341到344和光束接收部分与样品测量位置320中的辐射光束20对准。这可以允许使用传统atr-ftir光谱仪对多个样品的自动和/或高通量测量。
在图17中最佳地示出了装置300的光学隔间310的实施例。
光学隔间310具有多个光学元件311到316，多个光学元件311到316被配置成将由光谱仪产生的辐射光束20引导到装置300的样品测量位置320。在这个实施例中，光学元件311到316是反射镜。
光学隔间310具有限定光学室317的壁。光学隔间具有设置在其壁中的入口318，以允许由光谱仪产生的辐射光束20进入光学隔间310及其光学室。光学隔间具有设置在其壁(例如，与含有入口318的壁相反的壁)中的出口319，以允许由样品载玻片340反射的辐射光束20离开光学隔间310。光学隔间310还具有在其上壁中的开口(未示出)，以允许所反射光束20在样品测量位置320处撞击样品载玻片340。
通常，入口318和出口319与辐射光束20的法线方向对准，即，与当装置300不存在时辐射光束20的方向对准。因此，装置300可以被认为是与传统光谱仪一起使用的配件。
光学元件311到313被布置成以预定的入射角将辐射光束20引导到样品测量位置320，并且光学元件314到316被布置成使所修改光束朝向出口319往回返回。本领域普通技术人员将了解，光学元件311到316(例如，反射镜)可以被布置成以期望的角度将辐射光束20引导或传递到样品测量位置320，这可以取决于载玻片和其(多个)ire部分的配置和材料。
在不希望受理论束缚的情况下，据认为，辐射光束的适当入射角可以类似于或可以处于载玻片100的面128、129的角度的区域中。举例来说，在具有<110>硅载玻片的实施例中，所述<110>硅载玻片具有约35.3°的面128、129的角，可以将入射角调节为大约32°。
光学元件311到316中的一个或多个(例如，每个光学元件311到316)可以是可调节的。通过这样的设置，可以调节辐射光束在载玻片上的入射角。这可以允许使用具有不同配置的载玻片和/或由不同材料制成的载玻片。
图28到图29分别示出了根据本发明的另一个实施例的与光谱仪一起使用的总体标示为300b的装置的前透视图和后透视图。装置300b大体类似于图15到图16的装置300，相同的部件由相同附图标记标示，但由后缀“b”补充。然而，在图28到图29的实施例中，装置300b不具有光学隔间。
装置300b具有载物台330b，载物台330b被配置成接收样品载玻片340b。装置300b还具有移动机构360b，移动机构360b被配置成相对于样品测量位置320b移动样品载玻片340b。在这个实施例中，由于样品载玻片340b设置在载玻片保持器350b内，所以移动机构360b被配置成相对于样品测量位置320b移动保持样品载玻片340b的载玻片保持器350b。装置300b具有开关375b和控制按钮371b到374b，以控制载物台330b的移动和/或将所期望样品接收部分341b到344b和光束接收部分与样品测量位置320b处的辐射光束(未示出)对准。
图32中示出了具有样品载玻片100b和保持器130b的装置300b的视图。在这个实施例中，样品载玻片和保持器类似于如参考图27所描述的载玻片100b和保持器130b。
载物台330b还具有开口331b到334b，每个开口被配置成与样品载玻片340b的相应样品接收部分341b到344b和光束接收部分基本上相邻或对准。
将了解，类似于图15到图16的装置300，装置300b可以被配置用于具有被布置成行的多个孔的样品载玻片的双向移动，或者多个样品载玻片在保持器100b和130b中的移动。
图30示出了包括光学主体501和盖子502的传统的specacquestatr配件500，盖子502具有用以在传统ire上接收样品的载物台503和用以在分析期间将ire维持在适当位置的压缩臂504。
图31示出了图30的配件500’，其中其盖子502被移除，并且由图28到图29的装置300b替换。因此，装置300b被定尺寸并且被配置成连接到光谱仪光学主体501并且配置在光谱仪光学主体501上。通过这样的设置，装置300b被配置成使得当装置300b安装或装配在光谱仪主体501上时，装置300b的样品测量位置在使用配件500’期间位于或基本上处于使用传统样品载玻片时将放置样品的位置。因此，装置300b可以被认为是与传统光谱仪一起使用的配件。
本领域技术人员将了解，可以做出其它实施例，所述其它实施例被定尺寸并且被配置成装配其它类型的传统光谱仪，例如但不限于作为示例veemax光学配件或perkinelmerspectrumtwo或thermofisheris5或agilentcary系列，同时使用被配置成接收样品载玻片的载物台和被配置成相对于样品测量位置移动样品载玻片的移动机构的相同组合。
参考图18到图21中所示的ftir光谱，这些光谱含有两个特别感兴趣的吸收峰：在3200cm-1到3500cm-1区域中的强吸收峰，这是水oh基团的特性；和在1690cm-1附近的强吸收峰，这是伯酰胺基团的特性(如在蛋白质中发现的)。
参考图18a到图18c描述了对最佳入射角的研究。
图18a是示出了在30°到80°的范围内的不同入射角的吸光度的atr-ftir光谱。在图18b中，入射角已经减小到30°到50°的范围，因为这些角被识别为提供最佳结果。图18c类似于图18b的光谱，但是在光谱预处理之后，聚焦于伯酰胺的吸光度区域特性。光谱预处理通常涉及波数选择方法，以有效地“切割”光谱的指纹区域，在指纹区域中通常将存在大多数生物分子。光谱预处理通常还包含基线校正(橡胶带)，以调节光谱中的任何散射性质。最后，并且可以应用矢量归一化，这减少了样品不一致性的影响，例如厚度上的差异。
在图19到图21中所示的光谱中，在变化的干燥条件下分析含蛋白质的血清样品。
已经发现，令人惊讶地，干燥条件可能影响在后续分析期间获得的光谱的质量和再现性。特定来说，已经发现，某些干燥条件可以导致分析的改进的再现性和/或光谱中的锐度。
图19是示出在分析之前用于干燥样品的温度的效应的atr-ftir光谱。将1μl血清样品沉积在本发明的样品载玻片上，并且在t1＝25℃、t2＝30℃和t3＝35℃的温度下干燥8分钟。可以看出，与在较低温度下干燥相同持续时间的样品相比，在35℃下干燥样品不仅降低了样品中的水含量(在3200cm-1到3500cm-1区域中吸光度较小)，而且还提高了样品中与伯酰胺基团相关的吸收读数(吸收约为1690cm-1)。
图20是示出在分析之前被施加以干燥样品的气流的效应的atr-ftir光谱。将1μl血清样品沉积在本发明的样品载玻片上，并且在大约20℃的室温下，在对应于v1＝5v、v2＝12v和v3＝14v的风扇电压的气流下干燥8分钟。测量到5v的风扇电压对应于大约15m3/h的流速，12v的风扇电压对应于大约99m3/h的流速，并且14v的风扇电压对应于大约113m3/h的流速。可以看出，与在较低风扇电压下(因此在较低气流下)干燥相同持续时间的样品相比，使用14v风扇电压(因此在较高的气流下)干燥样品不仅降低了样品中的水含量(在3200cm-1到3500cm-1区域中吸光度较小)，而且还提高了样品中与伯酰胺基团相关的吸收读数(吸收约为1690cm-1)。
图21是示出了在分析之前被施加以干燥样品的温度和气流的组合效应的atr-ftir光谱。将1μl血清样品沉积在本发明的样品载玻片上，并且在35℃下在对应于v1＝5v和v3＝14v的电扇电压的气流下干燥8分钟。可以看出，虽然在低气流(5v的风扇电压)下在35℃下干燥的样品示出低水分含量和良好的伯酰胺吸收峰，但是增加流速(14v的风扇电压)进一步降低了样品中的水含量，并且提高了伯酰胺吸收峰的锐度。
图22是示出对应于针对不同温度和干燥时间羟基吸光度峰值(在3200cm-1到3500cm-1区域中的吸光度)的曲线下的平均面积(任意吸光度单位2(au2))的表格。从图22清楚的是，与在较低温度下干燥的样品相比，将干燥温度增加到35℃降低了样品中的水含量。还可以看出，与在较低风扇电压下干燥的样品相比，增加风扇电压(以及因此空气流速)也降低了样品中的水含量。最后，可以看出，35℃的干燥温度与高气流(12v或14v风扇电压)的组合效应产生了最佳结果。特定来说，与较低温度相比，在35℃下干燥样品所需的干燥时间显着降低。举例来说，在35℃的温度下并且在5v、12v或14v的风扇电压情况下干燥2分钟后实现小于12的值，而在30℃下，即使在干燥6分钟之后，含水量也更高。
图23是示出对应于针对不同温度酰胺i基团的吸光度峰值的平均强度的表格。可以观察到，增加温度和气流各自导致增加酰胺i基团的吸光度强度特性。换句话说，样品的干燥度(在图22中观察到的低水含量)与样品中酰胺i峰值吸光度的所测量强度之间存在明显相关性，这是出乎意料的。
图24是示出对应于针对不同温度羟基吸光度峰值的测量值的标准偏差的表格。图25是示出对应于针对不同温度酰胺i基团的吸光度峰值的测量值的标准偏差的表格。
标准偏差表示再现性，其中较低的标准偏差意味着更好的再现性。从图24和图25可以看出，在较高温度(35℃)和空气流下干燥样品均提高了atr-ftir分析的再现性，其中35℃的干燥温度与施加气流的组合实现了最好的结果。
图26是根据本发明的实施例的用于分析样品的方法400的示意图。
步骤410图示收集血清样品415的步骤。从患者抽取全血。在这之后，血液经历离心步骤以分离血清中的其它血液成分。通常，每位患者至少需要5ml血清。样品快速冷冻以供储存，并且解冻到室温以供分析。
步骤420图示了将血清样品415分配到样品载玻片430上的步骤。样品载玻片430是根据参考图3到图7和图11到图12所描述的本发明实施例的载玻片。
将5μl样品移液到孔432、433和434中，同时将孔431留空，以用作背景对照。
步骤440图示了干燥一批载玻片430a、430b、430c的步骤。将载玻片堆叠并且放置在干燥单元442中以供干燥。将干燥单元442设置为约35℃的温度，并且允许使用5v风扇使载玻片干燥约2分钟，以提供约15m3/h的空气流速。
步骤450图示了对样品执行光谱分析的步骤。
用于分析样品的仪器是来自perkinelmer的spectrum2tmftir光谱仪。该光谱仪装配有如本发明的实施例中参考图15到图17所描述的配件装置300。这促进样品的高通量分析。载玻片430设置有固定在载玻片430的一端上的标识符439，以容易并且可靠地识别样品的原件。在这个实施例中，与标识符439最靠近的孔431被用作‘背景’孔431。通常，将载玻片430放置在装置300的载物台330上，使得首先通过光谱仪分析背景孔431。本领域技术人员将了解，空白孔的目的是用作用于光谱仪仪器的环境的背景扫描。这将从环境收集所有光谱信息，并且将其从后续血清样品收集的数据移除。因此，通常在分析待分析的样品之前实施背景测量。这确保了在分析血清样品的情况下，来自血清的重要信息不会被周围环境中的组分遮挡。
如参考图15到图17所描述，一旦针对第一孔431完成atr-ftir测量，设备300就相对于样品测量位置320移动载玻片430，以用于待分析的第二孔432中的样品。因此，在无需在测量之间移除载玻片430的情况下，通过atr-ftir光谱测定法分析孔431、432、433、434中的每个样品。
光谱仪以以下方式配置：4cm-1分辨率，4cm-1孔径，并且其中每个样品和背景扫描32次。这是一种允许通常在一分钟内拍摄光谱的标准的atr-ftir光谱仪设置。
步骤460图示了处理数据和经由用户界面462向用户呈现信息的步骤。本方法允许结果被实时传递并且呈现给用户，如同利用简单界面462以置信度百分比显示结果一样。
一旦分析已经完成，载玻片430(载玻片430也用作用于每个孔431、432、433、434的ire)也可以被适当地处置，如通常将被视为生物废物以供丢弃。可替选地，载玻片430可以被存储以供将来参考，或者视情况被清洁和重新用于应用。
实验数据
将样品载玻片与传统光谱仪一起使用(图33)
与图3到图6的实施例一致，制备根据本发明的实施例的样品载玻片。载玻片由硅制成。
用人类混合血清制备样品，并且将其施加到三个样品孔中的每一个，第一个孔被用于基线参考。始终使用相同的样品载玻片，以便减少由样品制备引起的任何差异。从每个样品孔获得单个光谱并且记录。然后使用橡胶带基线校正对光谱预处理，后续接着矢量归一化。这些步骤旨在消除由不想要的光散射引起的任何背景效应，以及对光谱可以具有倍增效应的样品变化(例如，厚度)。因此，预处理使得所有光谱可比较。
为了比较关于光谱质量的数据，并且因此比较系统性能，提取信噪比(snr)的值。较高的snr可以被视为优选的，因为与不想要的背景噪声相比，重要的光谱信息更大。可以通过比较‘信号’区域的强度值与‘噪声’区域来计算snr。由于来自蛋白质的基本振动，生物光谱的酰胺i峰通常是最强的，并且因此该峰的最大吸光度值通常用作信号区域。可以从ir光谱中的任何地方获得噪声值，所述ir光谱没有生物样品中发现的振动模式和由环境条件引起的模式。4000cm-1到3700cm-1之间的区域、2800cm-1到2500cm-1之间、2000cm-1到1800cm-1之间和低于900cm-1的区域通常选择噪声区域。在这样的事例中，选择1900cm-1到1850cm-1之间和900cm-1到850cm-1之间的最大吸光度值作为信号质量的两个单独的测量。选择前一区域以避免来自水泛音区域的贡献；后者囊括由于使用硅而在较低波数中损失灵敏度，同时还解决了检测器灵敏度的限制。
图33示出了使用图3的样品载玻片(图33(a)到图33(c))与金标准金刚石atr配件(图33(d))的三个ftir仪器之间的光谱质量的比较，并且特定来说：
-(a)perkinelmerspectrum2ftir，
-(b)thermofishernicoletis5ftir，
-(c)agilenttechnologiescary670ftir，并且
-(d)具有uatr配件的perkinelmerspectrum2(金标准)。
给出每组光谱的snr值，其中酰胺i峰值吸光度与1900cm-1到1850cm-1区域中的最大吸光度值(snr1)和在900cm-1到850cm-1区域中的最大吸光度(snr2)进行比较。
从图33(d)可以看出，使用具有集成金刚石晶体的商业上可获得atr配件的金标准方法产生具有高snr的高质量光谱。图33(a)到图33(c)示出使用根据本发明实施例的样品载玻片，所述样品载玻片集成到通用atr配件上(使用载玻片分度单元)，与三种其它商业上可获得光谱仪结合，perkinelmerspectrum2ftir光谱仪产生具有与金标准方法相当的质量的光谱(图33(a))。从thermofishernicoletis5(图33(b))和agilentcary670(图33(c))系统也获取了高质量光谱。
硅ire(‘sire’)的比较(图34)
使用具有商业上可获得的atr(图34(a))和镜面反射配件(图34(b))的所调适的ire界面探索了关于图33描述的方法的替代方法。如图34中所示，每种方法的snr明显低于从金标准方法(例如，金刚石ire系统)获得的光谱质量，并且大大低于上文所描述并且关于图33研究的系统。
关于sire的临床分类研究(图35)
利用基于钻石ire的atr来进行概念验证研究，使用该概念验证研究已经建立了atr-ftir的诊断性能。这些回顾性研究确定，脑肿瘤患者的敏感性和特异性可以分别是92.8％和91.5％。为了研究基于sire的方法的诊断性能，对15个多形性胶质母细胞瘤(gbm)和15个对照患者进行了小型分类研究。像这样的小型研究将提供这种新方法的潜在性能的指示。借助于小数据集的一个重要考虑是，由于过度拟合和验证不足的风险，一些计算方法将是不适合的。
对于所有患者，3μl血清被移液到根据图3的实施例的样品载玻片上的孔‘1’、‘2’和‘3’中的每一个上，并且被允许在室温(20℃到22℃)下干燥。每孔获得三个光谱，从而导致每个患者9个光谱，并且总共270个光谱。通过切割到指纹区域(900cm-1到1000cm-1)、二阶微分和矢量归一化来预处理光谱。由于光谱数量少于数据集中的变量的数量，监督分析被认为是不适合的，并且同样地，进行多变量分析，在这种情况下是主成分分析(pca)，以观察癌症患者与非癌症患者之间的差异(图35)。
pca是一种被用于强调数据集中的变化和突出显示模式的技术。在本例中，在2维中实施pca转换，其中第一主成分(pc1)与波数和吸光度相关联，示出数据集中的最大方差，并且第二主成分(pc2)与波数和吸光度相关联，示出数据集中的第二大方差。换句话说，pca分析将光谱减小为考虑数据集内的变化的变量。同样地，当这些变量在散点图中相互比较时，轴线中的类别之间的分离表明生物学变化。相反地，相对接近或重叠表明生物类似性。
如果癌症和非癌症似乎在pca散点图中分离，这表明使用ftir方法可以区分这两个类别。在图35中可以看出的是，癌症患者与非癌症患者之间存在明显的分歧，其中几乎没有重叠。这对于任何后续分析是有希望的，例如使用将提取灵敏度和特异性的分类算法，因为无监督方法能够初始地识别指示疾病状态的光谱差异。
对患有黑素瘤的患者实施了进一步的临床分类研究。所采取的方法类似于如图35中所图示的上述研究，但是关于黑素瘤型的癌症而不是脑肿瘤。
图42到图44示出了在被监测的三个不同患者的治疗过程中对他们实施的主成分分析(pca)的结果。在每种情况下的样品分析如图26的方法400中所描述实施，后续接着pca分析。
参考图42，分析了取自五个不同患者就诊的样品。患者在就诊1时患有黑素瘤，并且在就诊3时发生复发。如图42中所示，结果的pca分析示出与就诊2相关联的样品明显不同并且与其它样品分离。图42上所示的结果清楚地示出，本方法允许识别患者生物样品中癌症(在这种情况下，黑素瘤)的存在或不存在。
类似地，参考图43，患者在就诊1时患有黑素瘤，并且在就诊3时发生复发。再次，结果的pca分析示出与就诊2(无黑素瘤)相关联的样品明显不同并且与其它样品(黑素瘤)分离。
与图44相关联的患者有所不同，即患者在就诊1、3和4时没有黑素瘤，但是在就诊2时发生了复发。因此，在这种情况下，明显不同并且与其它样品分离的样品是识别存在黑素瘤的样品。
图45到图49图示了关于细菌样品使用根据本发明的实施例的方法实施的光谱分析的结果。
图45示出了突出显示了被分析的86个样品所属的六个不同细菌家族的光谱差异的平均光谱数据。
图46示出了根据细菌属突出显示了细菌中的光谱差异的平均光谱数据。
图47到图48分别示出了突出显示了细菌家族之间的差异的pca分析pc1对pc2和pc1对pc3。
图49图示了与图47到48的pca分析相关联的pc负载光谱鉴别。经由散点图示出细菌家族之间的分离，并且相应的负载示出这是由于相异的光谱区域。
因此，可以看出，本发明的方法和系统不限于癌症样品的研究，还可以应用于许多其它应用，包含举例来说研究和识别不同类型的细菌属家族。此外，将了解，本发明的方法和系统不限于生物样品的研究，还可以应用于测量或测试非生物学应用，对于所述应用，光谱测定法(例如，atr_ftir光谱测定法)可以导致有用的结果解释和/或分类。
将了解，所描述的实施例并不意味着限制本发明的范围，并且可以使用所描述的示例的变型来实施本发明。
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