用于落射荧光收集的图案化的光学器件的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年4月7日提交的美国专利申请no.62/482,744的权益，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术：

荧光的光学检测被用于各种医疗诊断设备中。此类设备可以包括但不限于临床诊断设备、可穿戴设备和科学仪器。对于厚的或高度散射的样品，通常会从入射激发光的同一侧收集荧光。这种收集荧光的方法称为落射荧光(epi-fluorescence)收集技术。

技术实现要素：

本公开涉及用于落射荧光收集的系统和方法。即，本文所述的实施例包括系统，所述系统包括光学元件，所述光学元件具有以下各个部分：1)宽带抗反射(ar)涂层，其覆盖整个关注的荧光范围；以及2)高反射(hr)涂层，其可操作为反射激发光波长。在一些实施例中，hr涂层可以覆盖光学元件的面积的一小部分。另外，一些示例实施例可以包括光学元件上的多个hr涂层区域。在这种情况下，每个hr涂层区域可以被不同的激光光斑照射(光斑可以具有相同的波长或具有不同的波长)。

在第一方面，提供了一种系统。系统包括光学元件。光学元件包括至少一个高反射率(hr)涂层部分和至少一个抗反射(ar)涂层部分。系统还包括沿第一光轴光学地耦合到光学元件的一个或多个光源。一个或多个光源发射激发光。激发光经由光学元件与样品相互作用。样品包括荧光团，其响应于激发光发射发射光。系统包括沿着第二光轴光学地耦合到光学元件的图像传感器，其中图像传感器经由光学元件检测发射光。

在第二方面，提供一种方法。该方法包括使一个或多个光源发射激发光。激发光与光学元件相互作用。光学元件包括至少一个高反射率(hr)涂层部分和至少一个抗反射(ar)涂层部分。当与光学元件的hr涂层部分相互作用时，激发光从入射光轴作为反射的激发光被反射到反射光轴。反射的激发光与样品相互作用。样品包括荧光团，其响应于反射的激发光发出发射光。该方法包括通过图像传感器检测发射光。图像传感器沿着反射光轴耦合到光学元件。发射光的至少一部分穿过光学元件透射到图像传感器。

在第三方面，提供一种方法。该方法包括使一个或多个光源发出激发光。激发光与光学元件相互作用。光学元件包括至少一个高反射率(hr)涂层部分和至少一个抗反射(ar)涂层部分。激发光沿着光学透射轴线穿过光学元件向样品透射。样品包括荧光团，其响应于激发光发出发射光。发射光由光学元件的hr涂层部分沿着光学反射轴线向图像传感器反射。该方法包括通过图像传感器检测发射光。图像传感器沿着光学反射轴线耦合到光学元件。

通过阅读以下详细描述并在适当的情况下参考附图，其他方面、实施例和实施方式对于本领域普通技术人员将变得显而易见。

附图说明

图1示出了根据示例实施例的系统。

图2a示出了根据示例实施例的系统。

图2b示出了根据示例实施例的系统。

图2c示出了根据示例实施例的系统。

图3示出了根据示例实施例的各种光学元件。

图4示出了根据示例实施例的方法。

图5示出了根据示例实施例的方法。

具体实施方式

本文描述了示例方法、设备和系统。应当理解，词语“示例”和“示例性”在本文中用来表示“用作示例、实例或说明”。本文中被描述为“示例”或“示例性”的任何实施例或特征不必被解释为比其他实施例或特征优选或有利。在不脱离本文提出的主题的范围的情况下，可以利用其他实施例，并且可以进行其他改变。

因此，本文描述的示例实施例并不意味着是限制性的。如本文一般描述的并且在附图中示出的本公开的方面可以以各种不同的配置来布置、替换、组合、分离和设计，所有这些都是本文设想的。

此外，除非上下文另有说明，否则每个附图中所示的功能可以相互结合使用。因此，应将附图一般地视为一个或多个总体实施例的组成方面，但应理解，对于每个实施例而言，并非所有图示的特征都是必需的。

i、概述

落射荧光收集技术(例如向样品的同一侧提供激发光，并从样品的同一侧收集荧光的方法)由于激发和收集路径之间的对准容易并且光学元件数量减少而经常被使用。落射荧光还提供了在关注的样品下使用散射或不透明基底的能力。在一些利用落射荧光光收集的设备中，用于照明(尤其是在使用激光照明时)的数值孔径(na)与用于收集的数值孔径(na)之间通常会有很大的差异。也就是说，入射激光通常在狭窄的角度范围内与光学系统和样品相互作用。相反，荧光是在相对较大的角度范围内发射的。对于使用激光光源的照明，仅在需要非常高的空间分辨率的情况下才需要高na。相反，在收集中，几乎总是需要高na来最大化荧光光子的收集，荧光光子通常以立体角基本均匀地发射。

常规的落射荧光设备用二向色滤光器将激发光与荧光分离。但是，使用这种二向色滤光器的设备存在一些缺点。首先，由于二向色性的透射光谱取决于光的入射角，因此在给定视场中，不同点的收集效率将不同。其次，通常希望使用若干不同的激发波长来询问(interrogate)样品。可能的结果是，可能无法在低于最长激发波长的波长下收集荧光，这对于激发源、荧光团和光学元件是有限的选项。在使用多波段二向色滤光器的情况下，则在收集的光谱中可能会出现间隙，这可能会大大减少收集的荧光量。此外，高质量的多波段二向色滤光器通常使用大量的电介质层，由于加工和材料成本的原因，它们的价格昂贵。

作为另一种常规替代方案，二向色滤光轮可用于适应多个激发激光。在这种情况下，轮将选择二向色滤光器，其转变波长应尽可能(在红色侧)靠近激发光源的光谱。由于机械滤光轮及其致动器/电机的存在，这种方法可能会增加系统的尺寸。此外，这种方法通常使用旋转台架(通常是电动的)，这可能会增加系统的成本。此外，此类设备无法适应使用多个不同波长的光源同时激发样品。另外，这种方法不能校正二向色滤光器的与角度相关的透射光谱。

本文描述的实施例包括利用在多个落射荧光收集场景中存在的激发和收集na之间的较大差异的系统。在示例实施例中，系统包括具有宽带抗反射(ar)涂层的光学元件，该涂层覆盖整个关注的荧光范围。光学元件的一部分将具有施加至其的高反射率(hr)涂层。该hr涂层可以是金属涂层。hr涂层可以包括便宜的金属涂层(例如，溅射的铝和/或金涂层)。例如，hr涂层的反射特性可以在很大程度上与入射角无关。在一些实施例中，hr涂层可以覆盖光学器件的面积的一小部分(例如，百分之几)。hr涂层的面积可以基于入射在其上的激发激光光斑的尺寸。

一些示例实施例可以包括光学元件上的多个hr涂层区域。在这种情况下，每个hr涂层区域可以被不同的激光光斑照射(光斑可以具有相同的波长或具有不同的波长)。

作为光学元件上的若干离散的hr涂层区域的可能性的替代或附加，光学元件上可以存在线形的hr涂层区域。在示例实施例中，可以沿着线形hr涂层区域扫描激光光斑，从而生成样品的一维扫描。在一些实施例中，可以沿着这条线扫描来自不同激光器的若干激光光斑，以同时用多个波长激发样品。这可以允许在用于一个维度(快轴)的激发光束路径中使用快速检流镜(fastgalvomirror)快速收集荧光数据，而台架可以在对于慢轴的另一维度上移动样品。在收集臂中，可以对收集的荧光进行退扫描(descanned)或可以使用多像素图像传感器。

在替代实施例中，可以将光学元件制成为使得其为99％hr并且仅具有几个ar斑点。在这种情况下，激发将透射穿过光学元件，并且荧光将反射到收集检测器。

本文描述的实施例可以允许通过多个激发激光(其可以在不同位置)同时询问样品。一些实施例可以包括建立完整的二维荧光图。在这种情况下，可以在垂直于光轴的两个轴线上扫描样品。

所描述的系统和方法可以提供一种使用多个激发激光的具有成本效益的诊断设备，可选地具有带有不同波长的激光。当前公开的内容包括具有金属层的光学元件，该光学元件可以比包括数十个电介质层的多频带二向色滤光器更简单并且更便宜。

本文所述的系统和方法可以涉及流式细胞术系统以及其他基于荧光的诊断技术。例如，本公开可以涉及可穿戴设备、临床设备、和/或手术设备。附加地或替代地，系统和方法也可以用于数字病理学应用中，其中期望高收集效率以在光漂白过程出现之前获取尽可能多的光子。

在示例实施例中，可以使用半导体光刻技术将光学元件图案化到微米尺寸尺度。例如，光刻图案化的hr涂层区域可以包括100x100微米的正方形或圆形。附加地或可替代地，线形的hr涂层区域可以包括1mm×100微米的线。可以考虑更大、更小以及形状不同的hr涂层区域。如本文其他地方所述，多个hr涂层区域是可能的。此外，尽管在此描述了较小的hr涂层区域及其相应的形状，但应理解，抗反射和高反射率部分可以“反转”，使得大多数光学元件包括具有较小ar涂层区域的hr涂层。

在一些实施例中，系统可以配置为接受不同地图案化的光学元件。例如，示例实施例可以包括具有若干光学元件的滤光轮，每个光学元件具有不同的hr/ar图案。这种不同的滤光器可用于适应例如各种样品激发图案和各种数量的激发源。

ii.示例系统

图1示出了根据示例实施例的系统100。系统100可以包括例如可穿戴设备、临床设备或手术设备。例如，系统100可以是流式细胞术系统、荧光显微镜或另外的类型的光学表征系统。

系统100包括一个或多个光源110。一个或多个光源110可包括激光光源。此外，光源110配置为发出激发光。在示例实施例中，光源110可以提供具有高斯光束轮廓和相对小的光束发散(例如100微米)的激光。也就是说，由光源110发出的激发光可以在相对窄的角度范围内与系统100的其他元件相互作用。

系统100还包括光学元件120。光学元件120包括至少一个高反射率(hr)涂层部分122和至少一个抗反射(ar)涂层部分124。在示例实施例中，hr涂层部分122可以包括金属涂层(例如，铝、银、和/或金)。附加地或替代地，hr涂层部分122可以包括电介质层(tio2，tao2等)。例如，hr涂层部分122可以在很宽的光波长范围内提供高反射率的表面。

在一些实施例中，ar涂层部分124可以包括电介质涂层。例如，可以使用单层的mgf2。在一些实施例中，ar涂层部分124可以配置为对于光的某些波长是基本透明的，并且对于其他波长是吸收或反射的(例如，带通或带阻滤光器)。替代地或可替代地，ar涂层部分124可以配置为对于宽范围的光波长基本上是透明的。

材料和涂层厚度的选择可以基于反射峰(hr)或透射峰(ar)的宽度和深度。ar涂层可具有数百纳米宽的带通波长“窗口”。

尽管本公开将hr涂层和ar涂层描述为包括某些材料，但是应当理解，其他材料和制造方法也可以提供具有基本反射或透明特性的光学元件。如本文所用，“高反射率涂层”可以包括在给定的光波长下具有大于90％的反射率的材料和涂层。此外，如本文中所使用的，“抗反射涂层”可以包括在给定的光波长下提供比未涂覆的基底(例如，对于未涂覆的玻璃为～4-5％)更低的反射率的材料和涂层。例如，本文所述的ar涂层可以在350-700纳米的波长范围内提供小于1％的反射率，但是本文中小于4％的其他反射率值和其他波长范围是可能并可设想的。

一个或多个光源110沿着第一光轴光学地耦合到光学元件120。

在示例实施例中，系统100与样品相互作用。即，系统100可以用一个或多个光源110发出的激发光照射样品。激发光在与样品相互作用之前与光学元件120相互作用。样品包括荧光团，其响应于激发光发出发射光。在示例实施方式中，样品可以包括但不限于人类或动物组织，或适合于荧光表征的另外的种类型的对象。

系统100还包括图像传感器140，该图像传感器140沿着第二光轴光学地耦合到光学元件120。也就是说，在示例实施例中，(由样品中存在的荧光团产生的)发射光通过反射和/或透射相互作用与光学元件120相互作用。图像传感器140配置为经由光学元件120检测发射光。在示例实施例中，图像传感器140可以包括多像素相机传感器，尽管其他类型的光电检测器设备(单个或阵列配置)是可能的。

在示例实施例中，hr涂层部分122可以配置为反射激发光，使得它与样品相互作用。在这种情况下，ar涂层部分124配置为对于发射光基本上是透明的。

替代地，hr涂层部分122可以配置为反射发射光，以将其导向图像传感器140。在这种情况下，ar涂层部分124配置为对于激发光基本上是透明的。

在一些实施例中，hr涂层部分122可以在光学元件120上包括多个hr涂层区域。例如，可以沿着光学元件120的第一表面布置若干个hr涂层区域。在这种情况下，多个hr涂层区域可以包括两个到二十个hr涂层区域122，或者更多。

在这样的实施例中，一个或多个光源110可以包括多个光源。具体地，多个光源中的每个光源110朝向光学元件上的相应的hr涂层区域122发出激发光。在这种情况下，多个光源中的每个光源110可操作为以相应的激发波长发出激发光。即，每个光源110可以以不同的激发波长发出激发光。

在示例实施例中，一个或多个光源110、光学元件120和图像传感器140相对于样品以落射荧光光学显微镜配置布置。也就是说，系统100可以提供来自光源110的激发光，其入射在样品的第一表面上。这种情况下，样品中的荧光团可能会在宽角度范围内(例如，在样品的第一表面所限定的半球内)将发射光发射到环境中。图像传感器140可以收集来自样品的第一表面的发射光的至少一部分。换句话说，样品的激发和荧光的收集可以发生在样品的同一侧。

在一些实施例中，系统100可以包括其他光学器件130，例如扫描光学器件132、聚焦光学器件134、和/或收集光学器件136。例如，扫描光学器件132可以与一个或多个光源110光学耦合。在这种情况下，扫描光学器件132可以配置为至少沿着平行于样品的表面的第一样品轴线(沿x轴)在样品上扫描激发光。扫描光学器件132可以包括至少一个检流镜。

一些示例实施例包括台架160，其可以支撑样品。在示例中，台架160可以被电动化以便沿着至少一个轴线移动样品。在这样的情况下，台架160可以配置为至少沿着平行于样品的表面的第二样品轴线(例如，沿y轴)移动样品。在其他实施例中，台架160可以配置为沿着平行于样品的表面的平面(即，在x和y中)和/或沿着垂直于第一光轴或第二光轴的平面移动样品。在另外的实施例中，台架160可以配置为在所有三个空间维度(x、y和z中)中移动样品。在一些实施例中，台架160的位置可以手动调节。

在一些实施例中，系统100可以包括具有至少一个处理器152和存储器154的控制器150。一个或多个处理器152可以包括通用处理器或专用处理器(例如，数字信号处理器、专用集成电路等)。一个或多个处理器152可以配置为执行存储在存储器154中的计算机可读程序指令。由此，一个或多个处理器152可以执行程序指令以提供本文描述的功能和操作中的至少一些。

存储器154可以包括或采取可由一个或多个处理器152读取或访问的一个或多个非暂时性计算机可读存储介质的形式。一个或多个计算机可读存储介质可以包括易失性和/或非易失性存储部件，例如光学、磁性、有机或其他存储器或盘储存器，其可以与一个或多个处理器的152中的至少一个整体或部分地集成。在一些实施例中，存储器154可以使用单个物理设备(例如，一个光学、磁性、有机或其他存储器或盘储存单元)来实现，而在其他实施例中，存储器154可以使用两个或更多个物理设备来实现。

如所指出的，存储器154可以包括计算机可读程序指令和附加数据，诸如关于系统100的元件和/或样品的信息。由此，存储器154可以包括程序指令，以执行或促进本文描述的一些或全部操作和功能。

在示例实施例中，操作可以包括使一个或多个光源110发出激发光，并通过图像传感器140检测发射光。

此外，在涉及扫描光学器件132的场景中，操作还可以包括调节扫描光学器件132，以便至少沿着平行于样品的表面的第一样品轴线用激发光扫描样品。

在包括台架160的示例实施例中，操作可以包括调节台架160，以便至少沿着平行于样品的表面的第二样品轴线移动样品。

图2a示出了根据示例实施例的系统200。系统200可以与参考图1示出和描述的系统100相似或相同。例如，系统200可以包括沿着第一光轴244发出激发光212的光源210。发射的激发光212可以与光学元件220相互作用。特别地，激发光212可以基本上由沿着光学元件220的表面定位的hr涂层区域222反射。激发光212可以在沿着或平行于第二光轴242的轴线上朝向样品214反射。

反射的激发光213可以由光学物镜236聚焦，该光学物镜可以是聚焦透镜和/或收集光学器件。聚焦的激发光213可以与样品214相互作用。例如，反射的激发光213可以与位于样品214内的荧光团相互作用。响应与反射的激发光213的相互作用，荧光团可以发射发射光216。示例实施例可以包括荧光团，例如来自biolegend或alexafluordyes的brilliantviolet(bv)或brilliantvioletuv(buv)染料。应当理解的是，可以结合本文描述的系统和方法来利用其他类型的荧光团。在一些实施例中，这种荧光团的激发波长可以是355纳米或405纳米，但是可以设想其他激发波长。在一些实施例中，发射光216的发射波长可以是比激发波长更长的波长。

可以使用光学物镜236或另外的类型的光学收集元件(例如，收集光学器件136)来收集发射光216。在一些实施例中，光学物镜236可以基本上准直发射光216。

发射光216可以撞击在光学元件220上，并与其相互作用。例如，发射光216的第一部分可以与hr涂层部分222相互作用，并且发射光216的第二部分可以与ar涂层部分224相互作用。发射光216的与hr涂层部分222相互作用的第一部分可以被反射或以其他方式被阻挡或吸收。发射光216的与ar涂层部分224相互作用的第二部分可以作为透射的发射光218基本上透射穿过光学元件220。换句话说，通过与光学元件220的相互作用，发射光的一部分可以被光学元件220阻挡或反射。这可以在透射穿过光学元件220的发射光中产生衰减区域219。在衰减区域219中，可以不存在发射光，或者存在的话，其强度比在透射的发射光218中的强度低得多。

如图2a所示，发射光218可与聚焦光学器件234相互作用。在一些实施例中，聚焦光学器件234可以配置为在图像传感器240上提供图像。在其他实施例中(例如，涉及低荧光输出和/或单光子计数)，聚焦光学器件234可以配置为将发射光218聚焦到光电检测器设备上，该光电检测器设备可以包括诸如光电倍增管或雪崩光电二极管的高灵敏度单像素检测器。

图2b示出了根据示例实施例的系统250。系统250可以与系统100和/或200相似或相同，如参照图1和图2a示出和描述的，但是具有多个光源。

如图2b所示，系统250可以包括具有多个hr涂层部分222a、222b和222c的光学元件220。系统250可以另外包括多个光源210a、210b和210c。在示例实施例中，光源210a可以配置为发射具有第一激发波长的激发光212a。同样地，光源210b和210c可以配置为分别发射具有第二和第三激发波长的激发光212b和212c。

相应的激发光212a、212b和212c可以撞击在沿着光学元件220的表面的不同的位置上。例如，激发光212a可以与hr涂层部分222a相互作用，激发光212b可以与hr涂层部分222b相互作用，并且激发光212c可以与hr涂层部分222c相互作用。

激发光和相应的hr涂层部分之间的相互作用可以提供反射的激发光213a、213b和213c，其可以指向样品214。例如，光学元件236可以将相应的激发光束213a、213b和213c聚焦在样品214上的特定位置上。在这种情况下，给定的样品位置可以同时被多个激发波长照明。

在示例实施例中，系统250可操作为表征包括多个不同荧光团的样品。例如，样品214可以包括三个不同的荧光团，其对应于由光源210a、210b和210c提供的三个不同的激发波长。

在一些实施例中，光源210a、210b和210c可以以顺序或并行的方式操作。也就是说，光源210a、210b和210c可以在不同时间或同时提供相应的激发光212a、212b和212c。

尽管在图2b中示出了三个hr涂层部分和三个光源，但是可以使用并且在本文中设想更多或更少数量的hr涂层部分和光源。此外，虽然光源210a、210b和210c被图示为处于特定的空间配置，但可以理解的是，光源210a-c可以布置在不同的位置，并且不需要与光学元件220和相应的hr涂层部分222a-c具有平行的入射角。例如，由于空间限制和/或形状因素，光源210a-c可以在空间上交错，并且激发光212a-c可以以不同的入射角与相应的hr涂层部分222a-c相互作用。例如，在一些实施例中，多个光源(例如，四个激光二极管)可以沿着不同的入射角发射光，从而撞击到光学元件220上的单个hr涂层部分(例如，hr涂层部分222b)上。

图2c示出了根据示例实施例的系统270。系统270可以与参考图1、2a或2b示出和描述的系统100、200和/或250相似或相同。在示例中，系统270可以代表系统200或250的替代配置。

系统270可以包括光源210，其沿第一光轴271发射激发光212。发射的激发光212可以与光学元件220相互作用。特别地，激发光212可以基本上由沿着光学元件220的表面定位的ar涂层区域224透射。激发光212可以在沿着或平行于第一光轴271的轴线上朝向样品214透射。

透射的激发光272可以由光学物镜236聚焦，该光学物镜可以是聚焦透镜和/或收集光学器件。聚焦的激发光273可以与样品214相互作用。例如，聚焦的激发光273可以与位于样品214内的荧光团相互作用。响应与聚焦的激发光273的相互作用，荧光团可以发射发射光216。在一些实施例中，发射光216的发射波长可以与激发波长不同。

可以使用光学物镜236或另外的类型的光学收集元件(例如，收集光学器件136)来收集发射光216。在一些实施例中，光学物镜236可以基本上准直发射光216。

发射光216可以撞击在光学元件220上，并与其相互作用。例如，发射光216的第一部分可以与hr涂层部分222相互作用，并且发射光216的第二部分可以与ar涂层部分224相互作用。发射光216的与hr涂层部分222相互作用的第一部分可以被朝向图像传感器240反射。发射光216的与ar涂层部分224相互作用的第二部分可以基本上透射穿过光学元件220。

如图2c所示，反射的发射光219可与聚焦光学器件234相互作用。在一些实施例中，聚焦光学器件234可以配置为在图像传感器240上提供图像。在其他实施例中(例如，涉及低荧光输出和/或单光子计数)，聚焦光学器件234可以配置为将发射光219聚焦到光电检测器设备上。

图3示出了根据示例实施例的各种光学元件300。各种光学元件300可以代表如参照图1、2a，2b和2c示出和描述的光学元件120或220的示例。光学元件310包括单个居中定位的hr涂层部分314。光学元件310的其余区域包括ar涂层部分312。光学元件320包括光学元件310的反调(reverse-toned)实施例。即，光学元件320包括单个居中定位的ar涂层部分324。光学元件320的其余区域包括hr涂层部分322。

在示例实施例中，hr涂层部分314可以具有直径在50微米至1毫米的圆形。然而，hr涂层部分314的其他尺寸和形状也是可能的。同样地，hr涂层部分324可以具有直径在50微米至1毫米的圆形。然而，ar涂层部分324的其他尺寸和形状也是可能的。

光学元件330包括多个hr涂层部分334。光学元件330的其余区域包括ar涂层部分332。光学元件340包括光学元件330的反调(reverse-toned)实施例。即，光学元件340包括多个ar涂层部分344。光学元件340的其余区域包括hr涂层部分342。

光学元件350包括具有长形形状的hr涂层部分354。例如，hr涂层部分354可以包括线形段。在这种情况下，可以跨越hr涂层部分354扫描激光光斑，以生成样品的一维扫描。在一些实施例中，可以沿着这条线扫描来自不同激光器的若干激光光斑，以同时用多个波长激发样品。光学元件350的其余区域包括ar涂层部分352。光学元件360包括光学元件350的反调(reverse-toned)实施例。即，光学元件360包括具有长形形状的ar涂层部分364。光学元件360的其余区域包括hr涂层部分362。

尽管图3示出了在相应的光学元件上具有ar涂层和hr涂层部分的某些布置的各种光学元件300，但是应当理解，ar涂层和hr涂层的其他组合和布置是可以设想的并且是可能的。

可以使用诸如光学和电子束光刻的半导体制造技术来制造各种光学元件300。例如，hr涂层区域可以包括临界尺寸为100微米或更小的正方形、圆形和/或矩形。

在一些实施例中，滤光轮上可以包括若干个不同的光学元件，每个光学元件具有不同的hr/ar图案(例如，光学元件310、320、330、340、350和360)。在这种情况下，可以手动或自动致动滤光轮，以沿光轴提供所需的hr/ar图案。在示例实施例中，控制器150可以从滤光轮上的多个hr/ar图案中自动选择hr/ar图案。在这种情况下，可以基于光源的数量、样品中不同荧光团的类型和数量、以及图像传感器的检测能力来选择hr/ar图案。其他考虑也是可能的并且可以设想。

iii.示例方法

图4示出了根据示例实施例的方法400。方法400可以包括各种框或步骤。这些框或步骤可以单独地或组合地执行。这些框或步骤可以以任何顺序和/或串行或并行地执行。此外，可以省略框或步骤或将框或步骤添加到方法400。

方法400的框可以控制、包括和/或涉及系统100、200、250或270的元件，或各种光学元件300，如参照图1、2a、2b、2c和3所图示和描述的。在一些实施例中，方法400的一些或全部框可以由控制器150执行。

框402包括使一个或多个光源发射激发光。激发光与光学元件相互作用，该光学元件包括至少一个高反射率(hr)涂层部分和至少一个抗反射(ar)涂层部分。

当与光学元件的hr涂层部分相互作用时，激发光从入射光轴被作为反射的激发光反射到反射光轴。反射的激发光与样品相互作用，该样品包括响应于反射的激发光而发射发射光的荧光团。

框404包括使用图像传感器检测发射光。图像传感器沿着反射光轴耦合到光学元件。发射光的至少一部分穿过光学元件透射到图像传感器。

可选地，方法400可以包括调节扫描光学器件，以便至少沿着平行于样品的表面的第一轴线用激发光扫描样品。在这种情况下，扫描光学器件与一个或多个光源光学耦合。

附加地或替代地，方法400可以包括调节支撑样品的台架，以至少沿着平行于样品的表面的第二轴线移动样品。在这种情况下，可以在垂直于光轴的两个轴线(例如，沿x-y平面)上扫描样品。这样的实施例可以提供建立样品的完整二维荧光图的方法。

图5示出了根据示例实施例的方法500。方法500可以包括各种框或步骤。这些框或步骤可以单独地或组合地执行。这些框或步骤可以以任何顺序和/或串行或并行地执行。此外，可以省略框或步骤或将框或步骤添加到方法500。

方法500的框可以控制、包括和/或涉及系统100、200、250或270的元件，或各种光学元件300，如参照图1、2a、2b、2c和3所图示和描述的。在一些实施例中，方法500的一些或全部框可以由控制器150执行。

框502包括使一个或多个光源发射激发光。激发光与光学元件相互作用，该光学元件包括至少一个高反射率(hr)涂层部分和至少一个抗反射(ar)涂层部分。激发光沿着光学透射轴线穿过光学元件向样品透射，样品包括响应于激发光发射发射光的荧光团。发射光由光学元件的hr涂层部分沿着光学反射轴线向图像传感器反射。

框504包括通过图像传感器检测发射光。图像传感器沿着光学反射轴线耦合到光学元件。

方法500可选地包括调节光学耦合到一个或多个光源的扫描光学器件，以便沿着至少平行于样品的表面的第一轴线用激发光扫描样品。附加地或替代地，方法500可以包括调节支撑样品的台架，以至少沿着平行于样品的表面的第二轴线移动样品。如本文其他地方所述，可以在垂直于光轴的两个轴线上(例如，沿x-y平面)扫描样品。这样的实施例可以提供建立样品的完整二维荧光图的方法。

附图中所示的特定布置不应视为限制性的。应当理解，其他实施例可以包括给定图中所示的更多或更少的每个元件。此外，某些示出的元件可以被组合或省略。更进一步，说明性实施例可以包括在附图中未示出的元件。

表示信息处理的步骤或框可以对应于可以配置为执行本文描述的方法或技术的特定逻辑功能的电路。替代地或附加地，表示信息处理的步骤或框可以对应于模块、段或程序代码的一部分(包括相关数据)。程序代码可以包括可由处理器执行的一个或多个指令，以实现方法或技术中的特定逻辑功能或动作。程序代码和/或相关数据可以存储在任何类型的计算机可读介质上，例如包括磁盘或硬盘驱动器或其他存储介质的存储设备。

计算机可读介质还可以包括非暂时性计算机可读介质，例如，短时间段地存储数据的计算机可读介质，比如寄存器存储器、处理器缓存和随机存取存储器(ram)。计算机可读介质还可包括非暂时性计算机可读介质，其将程序代码和/或数据存储更长的时间段。计算机可读介质还可以包括次级或持久长期储存器，比如只读存储器(rom)、光盘或磁盘、压缩盘只读存储器(cd-rom)。计算机可读介质还可以是任何其他易失性或非易失性存储系统。例如，计算机可读介质可以被认为是计算机可读存储介质，例如，或有形存储设备。

尽管已经公开了各种示例和实施例，但是其他示例和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。各个公开的示例和实施例是出于说明的目的，而不是意图限制，其真实范围由所附权利要求指示。