本发明涉及生物流体的仪器分析领域，并且已特别地开发了关于用于固定生物样品以用于液体活检样品的分析和诊断目的的方法。
背景技术：
液体活检由从身体各个部位(例如外周血、骨髓、脑脊液、尿液、唾液、痰、眼泪和精液)中提取的生物流体样品组成，生物流体样品包含对特定疾病或有医疗意义的生理条件具有潜在诊断价值的细胞。
通过免疫学和分子表征来分析液体活检样品中存在的细胞正成为在诊断中用于筛查、预防、识别和随访病理条件的越来越重要的方法，不仅用于进行初步诊断，而且还用于评估治疗的疗效。
例如，已经在各种生物流体中识别出了源自实体瘤的被称为循环肿瘤细胞(ctc)的稀有肿瘤细胞。科学研究投入了巨大的精力来开发隔离和分析方法，从临床角度来看，该隔离和分析方法可证明是有效且有根据的，更精确地说，是灵敏且特异的。
与肿瘤细胞类似，在孕妇中识别出了循环胎儿细胞(cfc)。cfc是可利用简单的血液样品从母血中分离出来的稀有细胞，因此是一种无创性方法(non-invasivemethod)。这样的“液体活检”样品可用于染色体非整倍性或其他胎儿遗传异常的无创性产前诊断(nipd)。
对ctc的计数提供关于特定肿瘤演变的临床和诊断数据的范例已从各种临床研究中出现。最近，准确的蛋白质组学和分子表征已被证明为在将这些稀有细胞与原始肿瘤联系起来并准确预测疾病的结果方面至关重要。
存在许多不同的已知方法，该许多不同的已知方法最终目的是分离ctc或其他稀有细胞、通过免疫学或分子手段对ctc或其他稀有细胞进行表征并评估ctc或其他稀有细胞在生物流体中的临床意义。然而，根据定义，这些是在血液或其他液体中与数百万个其他循环细胞(应归入例如造血区室中)一起循环并且不会自发地粘附的稀有细胞。结果，以快速和稳定的方式将稀有细胞分离和将稀有细胞固定在载体上以进行后续测试并不是一件容易或快速的任务。
在临床水平上，细胞学形态是通过液体活检进行细胞分析的另一个相关因素。所有活细胞都对外部刺激有反应，例如，对抗体基质的蛋白质表面或涂层的粘附有反应、对药物治疗有反应、对由于通量或压力而引起的应激环境条件有反应。这种对外部刺激的生物学反应能够引起细胞形态的实质性改变，进而导致诊断不准确。
例如，cn103667191和cn105950436公开了利用分形或纳米结构的表面的方法，该方法包括以下步骤：在将生物流体样品沉积在所述表面上之前，通过粘附特异性抗体(例如，抗epcam和/或修饰的抗体)来制备该表面。
相反，为了获得具有“未被改变的”生物学特性(该生物学特性与其“活体内”条件相对应)的细胞以进行临床评估的目的，应使被已知为用于诱发这样的改变的任何操作、与外界刺激的相互作用和/或生物样品的长时间治疗最少化。
活细胞的细胞离心是符合这些规格的另一种已知分析方法。通过施加到样品上的离心力，该方法使细胞压靠载体(例如，显微镜载玻片)，并使其能够固定，并且随后利用免疫学(免疫荧光)或分子学(fish)方法进行染色。
然而，该方法导致细胞部分或全部破裂，并从根本上改变其形态，使得难以对结果进行诊断评估。
另一种已知的方法提供了一种流经一系列障碍物的生物流体，以便捕获具有预定尺寸的细胞，该预定尺寸大于在障碍物之间形成的通道的尺寸。例如，在wo2013049636中公开了一种基材、与该基材偶联并从该基材向外延伸的延伸段以及设置在该延伸段上的官能化氧化石墨烯。延伸段限定了生物流体流经的多个径向通道和腔室。此外，在液体活检用于识别ctc的情况下，将一种或多种标记物、抗体、抗原、蛋白质或特异性肿瘤结合剂(例如，抗-epcam)应用于氧化石墨烯，然后将生物流体样品沉积在所述表面上。
类似地，在wo2012016136中，已知提供了包括生物流体可流经的多孔系列障碍物的微结构和纳米结构。这些障碍物能够机械地阻塞细胞，该细胞的尺寸大于障碍物之间形成的通道的尺寸。同样在这种情况下，对障碍物施加物质，该物质可化学地操作穿过它们的细胞。
通过在生物样品流经的路径中插入障碍物来选择、捕获ctc的解决方案中的主要缺点之一是由经受了流动应力的细胞本身的生物学改变以及因此的形态学改变而导致的。此外，这些方法就其本质而言，是根据表面膜蛋白的尺寸或表达来选择同质的细胞群，而不考虑表征所有生物样品的异质性特性。这种生物异质性是这些方法无法提供的具有临床重要性的数据。
由于包括样品的生物学代表性的许多参数可影响诊断的准确性，因此需要如下一种方法：该方法可在整个液体活检样品的分析中提供高度准确的细胞形态，并在样品内保持具有临床价值的预定生物学特性的大量细胞。在ctc的特殊情况下，分析循环细胞的活体部分(可能具有不同的尺寸、形态和蛋白质表达特征)的可能性无疑将代表对于早期诊断可能的转移过程而言最合适的分析工具。众所周知，转移过程源自一种或多种ctc，该一种或多种ctc能够在血液区室中存活并侵入靶器官的组织以开始转移肿瘤生长的过程。
鉴于以上所述，本发明的目的是提供一种针对该需求的解决方案。另一个目的是以合理的成本以简单、合理的解决方案获得结果。
这些目的通过独立权利要求中阐述的本发明的特征来实现。从属权利要求概述了本发明的优选和/或特别有利的方面。
技术实现要素：
本发明的实施例提供了一种用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法，该方法包括以下步骤：
提供包含预定数量的细胞的生物样品以进行分析；
提供特别适于在分析装置中使用的平面载体；
所述平面载体包括利用表面涂层官能化的表面，该表面涂层包括纳米结构材料；
将所述生物样品的层状层沉积在所述平面载体的所述官能化表面上，以使生物样品中包含的细胞粘附到平面载体的官能化表面；以及
将固定剂置于生物样品的层状层上；
所述以上步骤在至少低于25℃的温度下进行，其特征在于，该方法还包括使生物样品中包含的细胞粘附到平面载体的官能化表面的步骤，所述步骤在低于25℃的温度下进行。
因为在该方法中的每个步骤在基本上与环境温度相对应的温度下执行，因此该解决方案尽可能多地保留了反映样品的原始条件的特性。因此，不需要使生物样品中的细胞经受可改变细胞形态的温度变化或流体应力。
本发明的另一方面提供：将生物样品的层状层置于平面载体上的步骤与将固定剂置于所述层状层上的步骤之间的时间范围小于4分钟。
由于这种解决方案，可确保生物样品中包含的细胞不经受改变其原始“活体内”状态的形态学变化，从而与已知的活细胞固定方法相比，将正常的处理时间减小了多达100倍。
本发明的另一方面提供：平面载体的总表面与平面载体的被生物样品的层状层所占据的表面之间的比在1.5与9之间。
作为这种解决方案的结果，显微镜载玻片的可用于细胞粘附的表面面积可高达20mm×60mm，因此，最大限度地利用了可用表面，并且需要较少的标准载玻片来分析大量的生物样品。
本发明的另一方面提供：生物样品中包含的保持粘附到平面载体的表面涂层的活细胞的百分比高于90％。
本发明的另一方面提供：生物样品中包含的保持粘附到平面载体的表面涂层的活细胞的百分比等于99％。
因此，所述解决方案能够确保对患者的样品的真实的代表性，尤其在分析稀有细胞群中的稀有细胞的情况下。
本发明的另一方面提供：所述生物样品的层状层的体积在1微升与2毫升之间。
由于这种解决方案，可分析大范围的生物样品体积，获得对于所有生物样品而言相同的粘附效率百分比，并且因此获得相同数量的可识别细胞。
本发明的另一方面包括使限制性疏水性物质与平面载体缔合的步骤。
在本发明的又一方面中，膜的纳米结构材料选自以下项中的任意一种：氧化锌(zno)、二氧化锆(zro2)、二氧化钛(tio2)。
所述解决方案确保了官能化材料不干扰正常细胞活动，并且不与用于制备细胞培养物的试剂反应。此外，二氧化钛由于其较弱的自发荧光而改善基于荧光的测量。
本发明的另一方面提供：保持粘附到平面载体的表面涂层的活细胞是稀有细胞。
作为该解决方案的结果，可使生物样品中被识别的稀有细胞与原始肿瘤联系起来，并且准确地预测疾病的结果和/或正在接受的药物治疗。
本发明的另一实施例提供：一种对患者中的肿瘤进行诊断或预测的方法，包括以下步骤：执行前面报道的方法、分析生物样品以识别ctc、通过图像分析来对ctc计数以获得关于患者的第一临床数据。
具体实施方式
一些实施例可包括提供包含预定数量的活细胞的生物样品以进行分析。在整个说明书中，“生物样品”应被解释为存在于各种生物流体中(例如，源自液体活检并在溶液中脱蛋白)的活细胞的细胞学样品。从人类收集生物样品，并保存在合适的容器中，并在预定的环境条件下保存，直到进行对它们进行分析为止。
在分析之前，如果生物样品是血液，则可通过标准方案(例如，通过红细胞裂解程序)对生物样品以及因此其中的活细胞进行初步处理。随后，可将细胞分散在等渗盐水液体中，(例如，磷酸盐缓冲液)。
在其他情况下，诸如通过示例的方式但不限于，在存在脑脊液的情况下，生物样品不经受行任何初步处理。
一些实施例可包括制备可能包含稀有细胞(例如，稀有肿瘤细胞，即，源自于实体瘤的循环肿瘤细胞(ctc))的生物样品。同样，其他实施例可包括制备可能包含循环胎儿细胞(cfc)的生物样品。
一些实施例还可包括对生物样品中存在的细胞进行计数。例如，在通常不包含稀有细胞的血液样品的情况下，对细胞进行计数，以在随后的步骤中确定将要分析的细胞的数量。
一旦准备好生物样品，就将其分配到特别适合用于分析仪器的平面载体上(例如，显微镜载玻片)。在预定的时间范围之后，使用含酒精的固定剂或交联固定剂来固定包含在生物样品中并沉积在平面载体上的细胞，例如但不限于通过细胞着色剂、抗体或dna/rna探针进行分析，并利用可见或荧光染色进行可视化。
特定的标记物可用于分析操作以识别具有诊断意义的靶细胞，诸如生物流体中存在的稀有或非稀有细胞。
接下来，可在自动荧光或明视野显微镜(clearfieldmicroscope)下分析分配到平面载体上的生物样品，以基于特定目的标记物来识别靶细胞。例如，在血液中的循环肿瘤细胞(ctc)的情况下，泛角蛋白(pankeratin)和cd45标记物用于揭示上皮或造血来源的细胞。通过图像分析，对被识别为ctc的稀有细胞(泛角蛋白阳性和cd45阴性)进行计数，以获得关于患者的ctc计数的第一临床数据。
一旦已识别了靶细胞，就可将它们定位在平面载体上，通过显微操作或“激光显微解剖”分离靶细胞，并通过分子检测(molecularassay)测试靶细胞，直至单细胞基因组或转录组测序。对特定疾病状态具有特异性的靶细胞的分子和生物学表征代表了在个性化医疗的背景下用于疾病诊断的分析数据。
根据本发明的一个优选实施例，用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的方法包括提供特别适合于接收生物样品的平面载体的第一步。
平面载体是扁平的载体，在优选的方向上伸长，并且具有非常小的厚度，例如但不限于具有大约1mm的厚度。平面载体不包括任何形式的具有壁部和顶部的物理围护边界。
平面载体优选地由透明材料(诸如石英、某些类型的塑料或者优选地玻璃)制成。尽管优选地，平面载体类似于医学和生物学领域中用于自动化分析的载体，但平面载体的尺寸仍可在较宽的范围内变化，从而本发明的平面载体将特别适用于分析装置，并能够利用本领域中已经使用的自动化手段进行处理。例如，平面载体可具有25mm×76mm的横向尺寸和1mm的厚度。
平面载体至少包括平坦的纳米结构表面(即，被官能化的表面)，该平坦的纳米结构表面是被施加了包括纳米结构材料的表面涂层(例如，膜)的平坦表面。根据本发明的一个可能的实施例，表面涂层可包括例如但不限于膜的形式的氧化锌(zno)、二氧化锆(zro2)，优选二氧化钛(tio2)。纳米结构材料的膜以及平坦的纳米结构表面包括尺寸分布低于50nm的纳米颗粒，并且纳米结构材料的膜以及平坦的纳米结构表面的厚度在20nm与200nm之间，优选在40nm与60nm之间，纳米结构材料的膜以及平坦的纳米结构表面的表面粗糙度在2nm与30nm之间，优选5nm与15nm之间。
可使用不同的技术将纳米结构材料的膜沉积到平面载体的平坦表面上，该不同的技术包括但不限于溅射、脉冲激光沉积(pld)，或者优选使用脉冲微等离子体团簇源(pmcs)在超声束中沉积纳米颗粒。
优选利用氧等离子体处理纳米结构材料的膜以及平坦的纳米结构表面，以增加其亲水性。
平坦的纳米结构表面限定具有预定尺寸的界定区域。平坦的纳米结构表面可限定与整个平面载体的区域相对应的区域，或者可限定具有比整个平面载体的区域小的尺寸的区域。
用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断的目的的方法包括第二及后续沉积步骤，在第二及后续沉积步骤中，预定量的生物样品直接沉积在平坦的纳米结构表面上。
根据本发明的特征，生物样品的层状层(laminarlayer)可被分配，从而被沉积到平面载体上，并因此被沉积在平坦的纳米结构表面上。在整个本说明书中，层叠层应被解释为一定数量的物质，其中所述物质的横向尺寸大于所述物质的厚度。
为了获得期望的结果，分配、从而沉积到平面载体的生物样品的层状层的体积可根据平面载体的平坦的纳米结构表面的面积以及需要分析的生物样品的量而有很大差异。
用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法包括将生物样品中包含的活细胞粘附或固定到平坦的纳米结构表面的第三及后续步骤。在该步骤期间，将生物样品的层状层置于所述平坦的纳米结构表面上保持预定的时间范围，从而使生物样品中包含的细胞接触该表面并粘附到平坦的纳米表面，从而固定到平坦的纳米表面。
用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法包括固定活细胞的第四及后续步骤，在第四及后续步骤中，通过施加固定剂物质(例如，含酒精的固定剂或交联固定剂)来固定(fix)包含在生物样品中并且在前一阶段中粘附或固定在纳米结构平坦表面上的活细胞。
根据本发明的特别有利的特征，通过仪器分析生物样品的步骤之前的所有步骤可在低于25℃的温度下进行。具体地，将生物样品的层状层分配到平面载体上的步骤使得生物样品中包含的细胞粘附到平面载体的表面涂层上，并且将固定剂置于生物样品的层状层上的步骤可在低于25℃的温度下进行，优选在18℃与25℃之间，甚至更优选在21℃与25℃之间。
甚至更优选地，将细胞固定在平坦的纳米结构表面上的步骤在低于25℃，优选在18℃与25℃之间，甚至更优选在21℃与25℃之间的温度下进行。此外，将细胞固定在平坦的纳米结构表面上的步骤是在不将平面载体置于细胞培养装置中的情况下进行的，并且通常没有任何中间的培养步骤。
根据本发明的另一个特别有利的特征，与现有技术相比，可大大减少在将生物样品的层状层分配到平面载体上的步骤与将固定剂置于所述层状层上的步骤之间的预定时间范围。具体地，所述时间范围可小于5分钟，优选地小于4分钟。
甚至更优选地，本发明的方法的粘附或固定步骤的预定时间范围(即，其中生物样品的层状层在所述平坦的纳米结构表面上保持静止的预定时间范围)小于5分钟，更优选小于4分钟。
申请人进行的数次试验表明了如何通过使用具有横向尺寸等于25mm×76mm的平面载体来实现这样的温度范围和时间范围，在平面载体上可分配体积在1μl与2ml之间的生物样品的层状层。
试验还揭示了如下令人惊讶的效果：这样的温度范围，尤其是时间范围，使生物样品中包含的活细胞以大于90％的百分比粘附或固定到平坦的纳米结构表面，并且在许多情况下，以等于99％的百分比粘附或固定到平坦的纳米结构表面。
在已知的方法和系统中，需要更长的时间范围以使细胞以足够的数量固定在平面载体上，该足够的数量在随后的分析步骤中具有重要意义。在已知类型的方法和系统中，使用与本发明的方法相同的时间范围，尽管该时间范围减少了细胞的退化，但不能以一定的百分比粘附活细胞，以构成对个性化医疗领域中疾病诊断有效的分析数据，尤其是在稀有细胞群中分析稀有细胞的情况下。
这样的实验还揭示了平面载体的总表面面积与平面载体的被生物样品的层状层所占据的表面面积之间的比如何可优选地在1.5与9之间。
根据本发明的用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法不包括在将生物流体样品沉积在所述表面上之前，通过粘附特异性抗体(例如，抗epcam)和/或修饰的抗体来制备平面载体的平坦纳米结构表面的任何步骤。
根据本发明的用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法不包括使生物流体在平坦的纳米结构表面上流动的任何步骤。具体地，本发明的方法不包括使生物流体流经一系列障碍物以保留具有预定尺寸的细胞的任何步骤，该预定尺寸大于障碍物之间形成的通道的尺寸。
根据本发明的另一个特别有利的特征，本发明的平面载体的平坦的纳米结构表面不包含蛋白质抗体基质表面或涂层。
根据本发明的另一个特别有利的特征，在粘附或固定步骤期间，生物流体中包含的活细胞不会由于流动或压力而经受环境应力条件。
这些条件对于以最小限度地干扰生物状态来提供具有对临床测试有代表性的细胞样品以及克服其他已知固定和分离方法所描述的局限性而言都是至关重要的。
利用本发明的方法获得的结果的另一优点在于为了获得准确的诊断，将要分析的生物样品的数量，从而在于将要分析的平面载体的数量。例如，需要大量的细胞来识别来自液体活检(例如，外周血)的样品中的稀有细胞。在血液是生物样品的情况下，细胞的数量必须约为30百万至40百万的白细胞(白血球)。
通过本方法，每个平面载体可固定大量的细胞，例如，每个平面载体固定的细胞数量等于至少2.0百万至3.0百万。因此，对血液样品的测试可仅利用10个至15个平面载体来完成。相反地，在已知的细胞离心方法中，每个平面载体的细胞数量非常少以致其无法管理和分析患者的液体活检样品。
此外，对较少数量的生物样品的标记物染色使自动管理成为可能，与试剂体积消耗减少相关，这节省了大量成本。
根据本发明的实施例，用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法还包括使限制性疏水性物质与平面载体缔合的步骤。限制性疏水性物质是包括由于其结构而对水不具有亲和力的疏水性化合物或官能团的任意物质。
申请人进行的大量试验表明限制性疏水性物质优选为醇类并且便利地溶解在挥发性溶剂中。
限制性疏水性物质在平面载体上的沉积限定了防止水溶液通过的一个或多个围护边界。围护边界可限定形状和尺寸上可变的一个或多个表面区域，并且在没有任何其他物理围护边界要素的情况下，生物样品的层状层可被限制在该一个或多个表面区域。
在施加限制性疏水性物质之后，干燥平面载体，以使挥发性溶剂溶解。因此，围护边界在干燥时形成基本上与平面载体的表面平齐的分子层。
以这种方式，可在平面载体上沉积数个层状层，并使数个层状层彼此分开，该数个层状层可以是同一生物样品或者不同生物样品中的每个。此外，可创建不同尺寸的表面区域，并在该表面区域中包含不同体积的生物流体。该方案在需要利用标准自动化液体处理平台来处理平面载体的情况下特别有效。
使限制性疏水性物质与平面载体缔合的步骤优选发生在提供平面载体的步骤之后且在将生物样品的层状层沉积在平面载体上的步骤之前。
另一令人惊讶的效果为，申请人进行的测试表明本发明的用于固定生物样品中的活细胞以用于分析和诊断目的的方法仅使活细胞粘附到平面载体的平坦的纳米结构表面。
所有详细内容可被其他技术上等效的要素替换。同样地，在不脱离所附权利要求的保护范围的情况下，根据需要，所使用的材料以及可能的形状和尺寸可以是任意的。