基于MALDI-TOF质量分析的抗生素抗性辨别装置及方法与流程

本发明涉及一种用于辨别微生物的对抗生素的抗性的装置及方法，更具体地，涉及一种装置及方法，其通过对微生物样品的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms，matrixassistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry)来对微生物执行鉴定及抗性辨别。

背景技术：

除了在治疗微生物感染引起的疾病的医学领域，在农业、渔业、畜牧业、食品加工流通的卫生设施检查、土壤和水资源的卫生检查等各个领域中，人们对微生物检测的需求越来越大，以确保公众的健康及卫生。此外，随着利用微生物(发酵食品、有机肥料、生物能源、疫苗/抗生素及微生物环境制剂等)来创造新价值的微生物工业的发展，人们对菌株的准确培养和分类的需求也在增加。

尤其在医疗领域的微生物检测，由于在败血症等的需要争分夺秒来救治的疾病中，它直接关系到患者的生命，且需要根据微生物的鉴定结果来确定适当的治疗方法，因此，在微生物鉴定测试中，人们要求分析的迅速性和准确性。微生物鉴定质量分析器可以将分析时间从几个小时至几天大大缩短到几分钟，并可以对数千种微生物进行分类。

基于maldi-tof的微生物鉴定系统可以根据微生物的种类，利用蛋白质质谱中的不同点，构件每一种微生物的蛋白质质谱模式的数据库，并通过比较分析对微生物进行鉴定。

与基于dna测序(sequencing)的微生物鉴定方法相比，基于maldi-tof的微生物鉴定系统是一种低成本、高效率的鉴定系统，有望成为快速鉴定微生物的重要工具。此外，还可以广泛应用于国内资源原产地认证、各类传染微生物的诊断、食品工业及检疫等领域。

菌株鉴定过程可以在培养菌株后通过处理过程快速鉴定菌株。作为一种可在菌株培养后10分钟内实现从菌株样品处理到鉴定的方法，该方法可以通过获取未知菌株的maldi-tof数据后将获得的数据与预先建立的数据库中的maldi-tof数据进行比较来确定匹配(matching)的菌株。

对于筛选病原微生物抗生素及辨别其抗性的药敏试验，培养微生物后需要18小时以上，并且，其精确度也不高。

因此，需要开发一种系统，其不仅可以基于质量分析法来鉴定微生物，还可以辨别所述微生物是否对特定药剂具有抗性。

技术实现要素：

解决问题的技术方法

根据一实施例，公开一种微生物抗性确定装置，包括：存储部，其包括数据库，所述数据库用于存储多种微生物的第一区域质谱数据和确定所述多种微生物中每一种的抗性的第二区域质谱数据；以及处理器，其通过将待辨别微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第二区域质谱数据作为输入数据来确定抗性的统计或机器学习抗性辨别模块来辨别对抗生素的抗性。

根据另一实施例，还公开一种微生物抗性确定装置，还包括：质量分析部，其通过采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry)来获得所述待辨别微生物样品的所述第一区域质谱数据及所述第二区域质谱数据。

根据又另一实施例，所述处理器可以通过将待辨别微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第一区域质谱数据作为输入数据来鉴定微生物的统计或机器学习鉴定模块来鉴定微生物。

根据另一实施例，公开一种微生物抗性确定装置，包括：连接到云服务器的通信部，其包括数据库，所述数据库用于存储多种微生物的第一区域质谱数据和确定所述多种微生物中每一种的抗性的第二区域质谱数据；以及处理器，其通过将待辨别微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第二区域质谱数据作为输入数据来确定抗性的统计或机器学习抗性辨别模块来辨别对抗生素的抗性。

或也可以是微生物抗性确定装置，其还包括质量分析部，其通过采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来获得所述待辨别微生物样品的所述第一区域质谱数据及所述第二区域质谱数据。

根据又另一实施例，公开一种微生物抗性确定装置，其中，所述处理器通过将待辨别微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第一区域质谱数据作为输入数据来鉴定微生物的统计或机器学习鉴定模块来鉴定微生物。

根据一侧，提供一种微生物抗性判断方法，包括以下步骤:存储部将多种微生物的第一区域质谱数据及用于确定所述多种微生物中每一种的抗性的第二区域质谱数据存储到数据库；以及处理器通过将待辨别微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第二区域质谱数据作为输入数据来确定抗性的统计或机器学习抗性辨别模块来辨别对抗生素的抗性。

根据另一侧，还公开一种微生物抗性判断方法，还包括以下步骤：质量分析部通过采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来获得所述待辨别微生物样品的所述第一区域质谱数据及所述第二区域质谱数据。

或者还可以包括以下步骤：所述处理器通过将待辨别微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第一区域质谱数据作为输入数据来鉴定微生物的统计或机器学习鉴定模块来鉴定微生物。

根据一侧，公开一种微生物抗性确定装置的操作方法，包括以下步骤：质量分析部获得待确定微生物样品的第一区域质谱数据；所述处理器通过将待辨别微生物样品的第一区域质谱数据输入到通过将质谱数据作为输入数据来鉴定微生物的统计或机器学习鉴定模块来鉴定微生物；所述质量分析部获得所述微生物样品的第二区域质谱数据；以及通过将所述微生物样品的质谱数据输入到通过将所述第一区域及第二区域质谱数据作为输入数据来确定抗性的统计或机器学习抗性辨别模块来辨别对抗生素的抗性。

根据另一侧，也可以是一种微生物抗性确定装置的操作方法，其还包括以下步骤：存储部将多种微生物的第一区域质谱数据及用于确定所述多种微生物中每一种的抗性的第二区域质谱数据存储到数据库。

或者，所述机器学习抗性辨别模块可以将所述第一区域质谱数据及所述第二区域质谱数据转换为特征矩阵(featurematrix)并输入为输入值，并通过机器学习来辨别微生物的对抗生素的抗性。

根据一侧，也公开一种微生物抗性确定装置的操作方法，还包括以下步骤：通过使用作用于所述第二区域的校准物质来校准所述微生物样品，以提高所述第二区域质谱数据的精度。

根据又另一侧，也公开一种微生物抗性确定装置的操作方法，还包括以下步骤：使通信部与云服务器联动，所述云服务器将多种微生物的第一区域质谱数据及用于确定所述多种微生物中每一种的抗性的第二区域质谱数据存储在数据库。

根据一实施例，提供一种计算机可读记录介质，其存储用于在计算机上执行权利要求8所述的微生物抗性判断方法的程序。

附图说明

图1为显示根据一实施例的微生物分析装置的配置的框图。

图2为显示根据一实施例的处理器的配置的框图。

图3为显示根据一实施例的微生物分析方法的流程图。

图4为显示根据一实施例的通过使用maldi-tof-ms来获取微生物质量分析信号的过程的附图。

图5为显示根据一实施例的基于maldi-tof的微生物鉴定及抗生素抗性辨别装置的配置的附图。

具体实施方式

以下，将参照附图对实施例进行详细说明。然而，本发明的权利范围并非受到这些实施例的限制或限定。在各附图中，相同的构成要素赋予相同的附图标记。

以下描述中使用的术语被选定为相关技术领域中广泛使用的、通用的术语，但可以根据技术的发展和/或变更、惯例及本领域技术人员的偏好等来表示为其他术语。因此，以下描述中使用的术语不应理解为限制本发明的技术构思，而应理解为用于描述实施例的示例性术语。

另外，在特定情况下，某些术语由申请人任意选择，此时，将在相应的说明中描述其详细的含义。因此，以下描述中使用的术语应根据术语的含义和本说明书中的全部内容来理解，而不仅仅是术语的名称。

针对特定目标的生物标志物的现有诊断技术存在以下缺点和局限性：单一生物标志物的不完整性及可变性。为了解决这一问题，本发明提出了一种通过基于质谱分析的微生物分析技术来鉴定微生物和确定抗药性的装置。

基于质谱分析的微生物分析技术可以通过基于统计算法分析从样品中获得的生物数据(maldi-tof-ms数据)来找出可区分的模式，并通过将未知样品的生物数据与数据库中存储的结果进行匹配来找出未知样品所属的组，从而进行鉴定。随着由数据库的扩展而生物数据的增长，可以通过所述方法得出可确保更高的准确性和详细的分类的先进的分析结果。

因此，可以克服现有的针对目标的单一生物标志物方式的不完整性(诊断缺乏准确性和特异性)和可变性(随着时间的推移，作为生物标志物的有用性降低)问题，并通过不断发展的系统来获取改进的结果。

此外，通过质谱微生物的分析，可以准确区分各种混合的疾病标记并进行同时检测，并且，不仅可以实现具有高检测限的高灵敏度检测，而且，检测到的信号的模糊度也较少。

所提出的基于数据库的微生物分析方法可以提供一种数据库，其可以有效地管理包括微生物的蛋白质数据和脂质数据的代谢物maldi-tof数据，并通过提供用于通过综合分析maldi-tof模式来鉴定微生物及确定其抗性的软件，从而实现既快速又准确的微生物分析。

图1为显示根据一实施例的微生物分析装置的配置的框图。根据一实施例的微生物抗性确定装置100可以包括质量分析部110、存储部120及处理器130。

根据一实施例的微生物抗性确定装置100可以分析微生物样品的质谱、鉴定包括在所述样品的微生物并确定对抗生素的抗性。

为了分析由所述微生物抗性确定装置100确定的微生物样品的质谱，可以对微生物样品进行预处理。所述微生物样品的预处理可以由进行分析的用户的手工操作来执行，也可以通过单独的微生物样品预处理装置来执行。

例如，但不限于，样品预处理装置可以通过向微生物样品施加特定溶液等来执行预处理。

质量分析部110可以获取微生物样品的质谱数据。所述质量分析部110通过使用已预处理的微生物样品来分析质谱。例如，但不限于，所述质量分析部110可以通过使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱来获取所述样品的质谱数据。

更具体地，所述质量分析部110可以作为maldi-tof质量分析装置，对输入的微生物样品执行质量分析。然而，这仅仅是一个示例，可以采用其他质谱分析方法或装置。

存储部120可以包括用于存储通过处理质谱数据及数据来获得的模型的数据库121。具体地，所述存储部120可以包括数据库121，所述数据库121用于存储多种微生物的第一区域质谱数据和通过处理添加的一个以上区域的质谱数据以确定所述多种微生物中每一种的抗性来获得的统计模型或机器学习模型。根据每一种微生物的特性，用于确定抗性而添加的区域可以各不相同。

根据一实施例，所述存储部120可以作为外部云服务器来进行操作。即，微生物抗性确定装置100还可以包括与外部云服务器联动的通信部(未示出)，并且，数据库121可以存储在所述外部云服务器。

处理器130可以使用存储在所述数据库121的多种微生物的第一区域质谱数据来鉴定微生物。并且，所述处理器也可以使用所述第二区域质谱数据来确定微生物的抗性。

例如，但不限于，所述第一区域质谱数据可以是用于微生物鉴定的分子量在2000至20000之间的区域的质谱数据。然而，这仅仅是一个示例，还包括可由本领域技术人员改变的区域。

所述第二区域质谱数据可以是专门用于确定每一种微生物的抗性的分子量区域的质谱数据。例如，可以是分子量在1000至4000之间的区域的高分辨率(hight-resolution)质谱数据，以确定第一微生物是否对任意抗生素具有抗性。

然而，这仅仅是一个示例，也可以是专门用于另一个区域的每一种微生物的另一个分子量区域的质谱数据。即，为了确定第二微生物是否对任意抗生素具有抗性，可以存储分子量在6000至10000之间的区域的高分辨率质谱数据。

所述存储部120可以包括存储与微生物的质谱有关的信息的数据库121。

所述数据库121可以存储通过各种微生物的质谱分析而获得的整个区域的质谱数据。此外，在微生物中对于要确定是否对抗生素具有抗性的微生物，可以存储将特定区域的质谱数据一起处理而形成的统计模型或机器学习模型。

例如，对于第一微生物，可以存储分子量在2000至20000之间的区域作为整个区域(或第一区域)的质谱数据。并且，当所述第一微生物对抗生素具有抗性时，可以存储通过将分子量在1000至4000之间的区域的高分辨率质谱数据作为第二区域一起处理而获得的统计模型或机器学习模型。

专门用于确定抗生素的抗性的第二区域的范围可以根据微生物的类型而变化。另外，也可以还利用第三区域和第四区域来对微生物进行抗性分析。以下，通过将其分类成高分子、中分子及低分子来描述第二区域的质谱分析数据。

例如，但不限于，可以将属于分子量在20000以上或在预定分子量以上的质量范围的物质分类为高分子物质区域，并将该区域的质谱数据定义为高分子区域的质谱数据。此外，所述数据库121可以存储通过使用高分子物质混合物来执行校准(calibration)而校正的数据。例如，所述高分子物质混合物可以是蛋白质混合物或高分子聚合物。

所述描述的高分子物质的质谱信息仅为一示例，本领域技术人员可以改变所建议的分子量范围。

中分子区域可以定义为属于分子量在2000至20000之间或预定分子量小于100000的质量范围的区域。因此，中分子区域的质谱数据可以是有关具有所述示范范围的分子量的物质的质谱信息。

也可以通过使用中分子物质混合物来进行校准并校正中分子区域的质谱信息。例如，所述中分子物质混合物可以是肽和蛋白质混合物或中分子聚合物。

最后，低分子区域可以定义为属于3000分子量或小于预定分子量的质量范围的区域，并且，可以使用其他低分子物质混合物来进行校准。

例如，但不限于，对于特定的微生物，可以利用第一区域的质谱数据来鉴定微生物，并且，除了所述第一区域的质谱数据外，还可以利用第二区域、第三区域及第四区域的质谱数据来确定微生物是否具有抗性。

处理器130可以基于通过将待确定的微生物样品的质谱数据作为预先存储在数据库121的统计模型或机器学习模型的输入值进行输入而获得的结果来确定所述抗生素的抗性。

即，所述处理器130可以使用待确定的微生物样品的质谱数据来鉴定微生物，之后确定该微生物是否对特定抗生素具有抗性。

所述抗性确定部130可以顺序地对微生物样品进行鉴定和抗性确定。例如，所述质量分析部110获取微生物样品的第一区域质谱数据，并通过将所获取的数据与所述数据库进行比较来鉴定匹配的微生物。随后，对于需要确定抗性的微生物，所述质量分析部110可以再次对专用于该微生物的第二区域进行校准，从而获得第二区域的校正的质谱数据，并且，可以通过将所述第一及第二质谱数据作为存储在数据库的统计模型或机器学习模型的输入值进行输入而获得的结果来确定所述微生物样品是否具有抗性。第二区域的校准可以使用由适合于特定区域的蛋白质及肽混合物构成的校正物质来执行，以便精确地获得特定于所鉴定的微生物的特定区域的质谱数据。将参考图2详细描述鉴定微生物并确定微生物是否具有抗性的处理器130的配置，并且，将参考图3详细描述其操作。

图2为显示根据一实施例的处理器的配置的框图。根据一实施例的处理器230对应于图1中描述的处理器130。所述处理器230可以包括鉴定模块231及抗性辨别模块232。

处理器230可以将存储在数据库的各种微生物的质谱数据与待辨别微生物样品的质谱数据进行比较，从而鉴定微生物或确定对抗生素的抗性。具体地，所述处理器220的鉴定模块231可以通过将待辨别微生物样品的质谱数据与所述数据库的第一区域质谱数据进行比较来鉴定微生物样品。另外，抗性辨别模块232可以基于将所述微生物的第一区域及第二区域质谱数据作为输入值输入至通过处理待辨别微生物样品的质谱数据而形成的统计模型或机器学习模型而所等的结果来辨别微生物样品的抗性。

图3为显示根据一实施例的微生物分析方法的流程图。根据一实施例的由微生物分析装置执行的微生物分析方法可以包括第一区域质谱分析步骤310、微生物样品鉴定步骤320、第二区域质谱分析步骤330及微生物样品抗性确定步骤340。

在根据一实施例的微生物分析方法中，可以使用单独的微生物样品预处理装置来对样品进行预处理。在微生物样品预处理步骤中，可以对要分析的微生物样品进行预处理。具体地，所述预处理过程可以执行为：首先培养微生物，之后将去除所述微生物的提取样品滴在平板上以检测质谱，随后，将样品与基质溶液混合并进行干燥。

在第一区域质谱分析步骤310中，质量分析部通过使用maldi-tof等方法来获取第一区域的质谱数据。具体地，第一区域可以是获取质谱数据的整个区域。例如，作为包括高分子、低分子和中分子的整个区域，可以获得分子量在2000至20000之间的区域的质谱数据。

在微生物样品鉴定步骤320中，通过将处理器的鉴定模块所获取的质谱数据和存储在数据库的微生物样品的质谱数据进行比较，从而鉴定微生物。

在第二区域质谱分析步骤330中，当需要根据待确定微生物样品的鉴定结果来确定微生物对抗生素的抗性时，通过对第二区域执行校准来分析校正的第二区域质谱。

更具体地，在上述步骤中，所述质量分析部可以获取专门用于确定微生物抗性的第二区域的质谱数据。所述第二区域可以是分子量区域，可以根据每一种微生物设置成不同的范围。例如，但不限于，在第一微生物的情况下，高分子区域可以是第二区域；在第二微生物的情况下，低分子区域可以是第二区域。即，可以获得专门用于确定每一种微生物抗性的区域的高分辨率(high-resolution)质谱数据。

在微生物样品抗性确定步骤340中，可以通过处理器的抗性辨别模块来确定微生物是否具有抗性。具体地，可以基于将所述获得的质谱数据作为输入值输入至存储在数据库的统计模型或机器学习模型而得出的结果来确定微生物是否对特定抗生素或任意抗生素具有抗性。

可以通过处理器的抗性辨别模块来执行抗性辨别。所述抗性辨别模块可以基于将存储在数据库的第一区域质谱数据和第二区域质谱数据作为待确定微生物样品的质谱数据处理后得到的统计模型或机器学习模型的输入值进行输入而得出的结果来确定微生物是否对某个抗生素具有抗性。

例如，对于对特定抗生素具有抗性或敏感的第一微生物的各种菌株，可以获得分子量在2000至20000之间的第一区域的质谱数据和分子量在1000至4000之间的第二区域的质谱数据，并通过适当的处理过程加工成特征矩阵(featurematrix)。这种适当的处理过程可以包括频谱质量管理、平滑化(smoothing)、基线校正(baselinecorrection)、强度校准(intensitycalibration)、峰值检测(peakdetection)及使用信噪比(signaltonoiseratio)的峰值选择。将该特征矩阵作为模型数据集，通过重复20次的4折(4-fold)交叉验证(crossvalidation)来训练出随机森林(randomforest)模型。当未知微生物被鉴定为第一微生物时，可以分别获得分子量在2000至20000之间的第一区域的质谱和分子量在1000至4000之间的第二区域的质谱，并且，通过上述处理过程获得的特征向量可以作为经过训练的机器学习模型的输入值进行输入，由此可以得出对抗生素的抗性及概率值。

图4为显示根据一实施例的通过使用mldi-tof-ms来获取微生物质量分析信号的过程的附图。

从左开始依次描述，微生物样品放置在maldi板上并进行培养。所述样品可能需要单独的预处理过程。在样品电离室(sampleionizedchamber)中，可以使用激光束(laserbeam)来电离微生物样品。可以通过位于质量分析器的一侧的离子检测器(iondetector)来检测电离的样品，并获得质谱。

在使用激光束的电离中，待分析的样品位于基质溶液内部，并通过射入激光束被电离，并且，通过施加电场(electricfield)使离子到达离子检测器(iondetector)。

可以使用到达所述离子检测器的离子来检测质谱。

图5为显示根据一实施例的基于maldi-tof的微生物鉴定及抗生素抗性辨别装置的配置的附图。例如，基于maldi-tof的微生物鉴定及抗生素抗性辨别装置可以包括maldi-tof质谱分析器510和微生物抗性确定装置520。

maldi-tof质谱分析器510可以在真空系统下包括真空锁(loadlock)、样品台(samplestage)、离子光学系统(ionoptics)、tof管(toftube)及检测器。此外，还可以包括照相机、激光器、电源供应部及电子控制部。

当数字转换器(digitizer)对由所述maldi-tof质谱分析器510所获得的质谱数据进行数字化时，微生物抗性确定装置520对其进行分析。所述微生物抗性确定装置可以包括控制软件(controlsw)、鉴定软件(idsw)、抗性确定软件(mdrsw)及数据库(database)。

可以通过所述鉴定软件来鉴定微生物样品，当对所鉴定的微生物再次获得特定区域的质谱时，可以通过抗性确定软件来分析所述微生物样品的抗性。

以上说明的实施例能够通过硬件构成要素、软件构成要素，和/或硬件构成要素及软件构成要素的组合实现。例如，实施例中说明的装置及构成要素，能够利用例如处理器、控制器、算术逻辑单元(arithmeticlogicunit，alu)、数字信号处理器(digitalsignalprocessor)、微型计算机、现场可编程阵列(fieldprogrammablearray，fpa)、可编程逻辑单元(programmablelogicunit，plu)、微处理器、或能够执行与应答指令(instruction)的任何其他装置，能够利用一个以上的通用计算机或特殊目的计算机进行体现。处理装置能够执行操作系统(os)及在所述操作系统中执行的一个以上的应用软件。并且，处理装置应答软件的执行，从而访问、存储、操作、处理及生成数据。为方便理解，说明为仅具有一个处理装置的方式，但本领域普通技术人员应理解处理装置能够包括多个处理元件(processingelement)和/或多个类型的处理要素。例如，处理装置能够包括多个处理器或一个处理器及一个控制器。并且，也能够包括类似于并行处理器(parallelprocessor)的其他处理配置(processingconfiguration)。

软件能够包括计算机程序(computerprogram)、代码(code)、指令(instruction)，或其中的一个以上的组合，能够使处理装置按照所期待的方式操作，或者，单独或共同(collectively)命令处理装置。为通过处理装置进行解释或者向处理装置提供命令或数据，软件和/或数据能够永久或临时体现于(embody)任何类型的设备、构成要素(component)、物理装置、虚拟装置(virtualequipment)、计算机存储介质或装置，或者传送的信号波(signalwave)。软件分布于通过网络连接的计算机系统上，能够以分布式存储或执行。软件及数据能够存储于一个以上的计算机读写存储介质中。

根据实施例的方法以能够通过多种计算机手段执行的程序命令的形式体现，并记录在计算机读写介质中。所述计算机读写介质能够以单独或者组合的形式包括程序命令、数据文件、数据结构等。记录在所述介质的程序指令能够是为实现实施例而特别设计与构成的指令，或者是计算机软件领域普通技术人员能够基于公知使用的指令。计算机读写记录介质能够包括硬盘、软盘以及磁带等磁性媒介(magneticmedia)；与cd-rom、dvd等类似的光学媒介(opticalmedia)；与光磁软盘(flopticaldisk)类似的磁光媒介(magneto-opticalmedia)，以及与只读存储器(rom)、随机存取存储器(ram)、闪存等类似的为存储并执行程序命令而特别构成的硬件装置。程序指令的例子不仅包括通过编译器生成的机器语言代码，还包括通过使用解释器等能够由计算机执行的高级语言代码。为执行实施例的操作，所述硬件装置能够构成为以一个以上的软件模块实现操作的方式，反之亦然。

通过有限的附图对实施例进行了说明，但本领域普通技术人员能够基于所述记载进行多种更改与变形。例如，所说明的技术按照与说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的系统、结构、装置、电路等构成要素按照与说明的方法不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。

由此，其他体现，其他实施例以及权利要求范围的等同物，均属于本发明的权利要求范围。