一种胰腺癌检测试剂及其在胰腺癌检测中的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胰腺癌的检测试剂及其在胰腺癌检测中的应用。

背景技术：

胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。5年生存率<5%，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌早期的确诊率不高，手术死亡率较高，而治愈率很低。胰腺癌发病呈快速上升趋势。中国国家癌症中心最新统计数据显示，胰腺癌位列中国城市男性恶性肿瘤发病率的第8位，居大城市（北京、上海）人群恶性肿瘤死亡率的第5位。胰腺癌起病隐匿，早期症状不典型，常表现为上腹部不适、腰背部痛、消化不良或腹泻等，易与其他消化系统疾病相混淆，出现症状时大多已属中晚期。

胰腺癌的病理分型是以组织形态结构和细胞生物学特性为基础，不同类型的胰腺癌，其形态结构和生物学行为各异，流行病学和分子机制亦不同，以致于现有的胰腺癌病理分型系统众多。在所有类型的胰腺癌中，胰腺导管腺癌（pdac）是最为常见的，占85-90%，而患者总体的5年生存率低于5%，这一数字在近50年来都没有改善。其它各类胰腺肿瘤约占胰腺肿瘤的10%-15%。由于胰腺癌早期转移、生长迅速且位置较深，症状及体征均缺乏典型性，临床上容易漏诊或误诊。目前出现的胰腺癌诊断试剂盒都是检测一些常见的肿瘤标记物，如c19-9、癌胚抗原cea等，灵敏性及准确性都偏低。单项检测往往有很大的局限性，难以满足快速诊断的要求。所以，本发明专利是应用糖组学方法鉴别诊断胰腺癌及各型胰腺肿瘤，提供一种非侵入性、高灵敏度、高特异度有利于早期诊断胰腺癌的方法。

技术实现要素：

糖基化是指n-寡聚糖能通过上百种酶、转录因子、离子通道和蛋白之间复杂的相互作用而形成的，且参与多种分子过程，如蛋白折叠、细胞粘附、分子转移、信号转导、调节受体活性等；糖蛋白上的n-寡糖链的改变与疾病相关。

通过前期大量研究发现，在胰腺癌患者血清中，n-寡聚糖nga2f（agalactosylated,core-a-1,6-fucosylatedbiantennaryglycan），ng1a2f（monogalactosylated,core–a–1,6-fucosylatedbiantennary）相对含量与正常血清中相比，发生了明显变化，因此可作为检测胰腺癌的标志物。

针对现有的胰腺癌检测中，血液检测和影像学检测特异性和准确度不高，病理检查有创伤性，抽样误差性，患者依存性差的问题，本发明提供一种胰腺癌的n-寡糖链检测检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种胰腺癌检测试剂，包括pdacs1：在10mm的nh4hco3中配制成不高于5.0%sds，ph为7.5-8.0的nh4hco3溶液；pdacs2：2~5u/µl的pngasef、1~2mu/µl唾液酸酶和双氧水按照体积1:1:13混合；pdacs3：混合同体积的20mm的apts和1m的nacnbh3；pdacs4：缓冲液。

所述pdacs1的体积为2µl，pdacs2的体积为2µl，pdacs3体积为2µl，pdacs4体积为200µl。

本发明还提供一种组合物在胰腺癌检测试剂中的应用，所述组合物由nga2f和ng1a2f组成，ng1a2f由同分异构体ng1a2f¹和ng1a2f²组成，所述组合物通过nga2f/ng1a2f的比值来检测胰腺癌。

试剂制备：

pdacs1：于10mm的nh4hco3，配制成含有不高于5%sds、ph为7.5~8.0的nh4hco3溶液。

pdacs2：浓度2~5u/µl的pngasef，浓度1~2mu/µl唾液酸酶以及双氧水按照体积1:1:13混合。

pdacs3：混合同体积的20mmapts和1mnacnbh3。

pdacs4：缓冲液。

n-寡糖链检测：

①n-寡糖链的制备：取在95℃下灭活的血清2µl，加入2µlpdacs1，

混匀放置5min，加入pdacs2试剂2µl，37~40℃反应3h后进行干燥。

②n-寡糖链的标记：在干燥后的样品中加入2µl的试剂pdacs3，不低

于60℃下进行荧光标记3h后，加入200µl的缓冲液终止反应。

③n-寡糖链分离分析：取上述反应后的液体样品10µl，在abi3500dx

仪器下进行n-寡糖链分离，从而得到n-糖组图谱。

④数据处理分析：将所得到的n-糖组图谱进行峰值量化，用每个峰的

峰高值与所有峰的高度的总和相比，从而定量计算出每个峰的相对含量，继通过函数nga2f/ng1a2f进行进一步的统计学分析，来检测胰腺癌。

本发明的有益效果：

（1）本发明的检测方法采用灵敏度高、操作简单、仅需微量样品、重复性高、稳定性好和高通量的检测方法，根据490例样本（胰腺癌样本50例，非胰腺癌样本440例）建立的血清的n-糖组图谱，得到胰腺癌样本血清中的聚糖nga2f和ng1a2f相对含量，通过函数nga2f/ng1a2f对受试者进行检测。本发明的检测方法，与现有技术相比，准确度达到86.3%，明显优于现有的检测方法。

（2）采用本发明的试剂，能够让众多高风险的人群接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测胰腺癌的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。

附图说明

图1为胰腺癌的n-寡糖链图谱；

图2为健康对照组血清样本的n-寡糖链图谱；

图3为检测样本通过函数nga2f/ng1a2f用于鉴别胰腺癌的roc曲线；检测样本总数为490例，其中胰腺癌血清样本50例，健康对照组样本440例；得到曲线下面积auc=0.863。

具体实施方式

下面结合具体实施例以及附图对本试剂进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件，试剂都为实验室专用。

实例一：

（1）实验设备：

abi3500dx分析仪（appliedbiosystems），pcr，离心机

（2）试剂制备：

pdacs1：于10mm的nh4hco3，配制成含有不高于5%sds、ph为7.5~8.0的nh4hco3溶液。

pdacs2：浓度2~5u/µl的pngasef，浓度1~2mu/µl唾液酸酶以及双氧水按照体积1:1:13混合。

pdacs3：混合同体积的20mmapts和1mnacnbh3。

pdacs4：缓冲液。

（3）n-寡糖链检测

a、n-寡糖链的制备：取在95℃下灭活的血清2µl，加入2µlpdacs1，混匀放置5min，加入pdacs2试剂2µl，37~40℃反应3h后进行干燥。

b、n-寡糖链的标记：在干燥后的样品中加入2µl的试剂pdacs3，不低于60℃下进行荧光标记3h后，加入200µl的缓冲液终止反应。

c、n-寡糖链分离分析：取上述反应后的液体样品10µl，在abi3500dx仪器下进行n-寡糖链分离，从而得到n-糖组图谱。

d、数据处理分析：将所得到的n-糖组图谱进行峰值量化，用每个峰的峰高值与所有峰的高度的总和相比，从而定量计算出每个峰的相对含量，继通过函数nga2f/ng1a2f进行进一步的统计学分析，来检测胰腺癌。

检测样本通过函数nga2f/ng1a2f用于鉴别胰腺癌的roc曲线；检测样本总数为490例，其中胰腺癌血清样本50例，健康对照组样本440例；得到曲线下面积auc=0.863。

本发明的检测方法，与现有技术相比，准确度达到86.3%，明显优于现有的检测方法。采用本发明的试剂，能够让众多高风险的人群接受常规、无创检测，帮助医生及患者及时监测胰腺癌的发生和病情进展，有望在临床中推广使用。

以上结合附图所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，凡在本发明的精神和原则之内，不需要付出创造性劳动即可做出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。