肺癌肿瘤标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种肺癌肿瘤标志物及其应用。

背景技术：

肺癌是全球的“头号癌症杀手”，是发病率和死亡率均居世界首位的恶性肿瘤。在我国，肺癌已经成为恶性肿瘤死亡的首位，占全部恶性肿瘤死亡病例的22.7％，且发病率和死亡率仍在继续上升。2000-2005年间，我国肺癌患者增加了12万，全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示，2010年，我国新发肺癌病例60.59万，占恶性肿瘤新发病例的19.59％，如不及时采取有效的控制措施，预计到2025年，患者人数将达到100万，成为世界第一肺癌大国。

肺癌可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中后者占大约80％。非小细胞肺癌又可以分为三类：鳞癌、腺癌和大细胞癌。导致肺癌发生的因素有很多，吸烟、遗传因素，放射性氡气、石棉等都是风险因素。

目前，肺癌已成为一个严重的公共健康问题。肺癌的死亡率高，五年生存率不足15％。一个重要的原因是早期诊断率低，不足2％，80％以上患者就诊时已在晚期。对高危人群进行定期的肺癌筛查，早诊断、早治疗是提高肺癌患者生存率的有效途径。然而在癌症早期，肿瘤细胞往往表现为低丰度，筛查手段灵敏度低，操作人员的判断也有可能导致偏差。目前的诊断方法有x-射线检查、ct扫描、支气管镜检、痰细胞学检查以及肺癌生物标志物检测等。这些方法都存在各自的缺陷，如影像学技术难以发现瘤体较小的肿瘤，早期普查的漏检率较高。因此，筛选和鉴定一种高特异性、高灵敏度的肺癌肿瘤标志物已经成为肺癌研究中的重点和难点。

所谓肿瘤标志物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞的一类物质，是肿瘤细胞产生或释放的某种物质，常以抗原、酶、激素等代谢产物的形式存在于肿瘤细胞或宿主体液中，它的存在或量变可以提示肿瘤的性质，从而有利于对肿瘤的诊断、分类、转移、预后以及复发等做出判断，肿瘤标志物应该具有良好的敏感度和特异性，并能在肿瘤早期检测。而现有的肺癌肿瘤标志物存在早期病人阳性率低，单一标志物诊断有限等问题，因此，本领域急需一种特异性高、灵敏度好、可用于早期诊断的新肿瘤标志物。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种肺癌肿瘤标志物，具有高特异性、高灵敏性，可用于肺癌的早期诊断。

本发明是这样实现的：

一种肺癌肿瘤标志物，所述肺癌肿瘤标志物为c型凝集素clec3b。

优选地，所述c型凝集素clec3b的序列为：

melwgaylllclfslltqvttepptqkpkkivnakkdvvntkmfevlksrldtlaqevallkeqqalqtvclkgtkvhmkcflaftqtktfheasedcisrggtlstpqtgsendalyeylrqsvgneaeiwlglndmaaegtwvdmtgariayknweteitaqpdggktencavlsgaangkwfdkrcrdqlpyicqfgiv。

优选地，c型凝集素clec3b蛋白在确认肺癌患者血清中的高表达。

本发明的另一个目的是提供c型凝集素clec3b作为肺癌肿瘤标志物用于肺癌的早期诊断的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的肺癌肿瘤标志物是在前期利用selex技术从肺癌血清中筛选得到的核酸适配体的基础上，以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的，且c型凝集素clec3b蛋白在肺癌血清中的高表达，具有高特异性、高灵敏性，可用于肺癌的早期诊断。

附图说明

图1为钓取得到的蛋白测序序列结果。

图2通过spr测定凝集素clec3b和肺癌适配体结合的亲和力。

图3通过emsa鉴定凝集素clec3b和肺癌适配体结合的特异性。

图4elisa检测中，人c型凝集素clec3b标准品的标准曲线。

图5为检测的50例肺癌血清和健康人血清中凝集素clec3b浓度散点图。

图6elisa检测肺癌血清和健康人血清中凝集素clec3b浓度均值图。

具体实施方式

以下将参考附图详细说明本发明的示例性实施例、特征和性能方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。

本发明提供一种肺癌肿瘤标志物，该肺癌肿瘤标志物为c型凝集素clec3b。c型凝集素clec3b的序列为：

melwgaylllclfslltqvttepptqkpkkivnakkdvvntkmfevlksrldtlaqevallkeqqalqtvclkgtkvhmkcflaftqtktfheasedcisrggtlstpqtgsendalyeylrqsvgneaeiwlglndmaaegtwvdmtgariayknweteitaqpdggktencavlsgaangkwfdkrcrdqlpyicqfgiv。

该c型凝集素clec3b蛋白在确认肺癌患者血清中的高表达。

本发明的另一个目的是提供c型凝集素clec3b作为肺癌肿瘤标志物用于肺癌的早期诊断的应用。

肺癌肿瘤标志物c型凝集素clec3b是在前期利用selex技术从肺癌血清中筛选得到的核酸适配体的基础上，以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的，然后并利用前期的肺癌核酸适配体对凝集素clec3b进行亲和力和特异性检测，并验证了凝集素clec3b在肺癌血清中的高表达。

实施例1

肺癌血清中凝集素clec3b的钓取

将pcr扩增完的带生物素的肺癌核酸适配体与链霉亲和素包被的磁珠37℃孵育1h，甲酰胺洗脱，depc水变性，pbs+mg²⁺二次变性。将结合有带生物素标记的适配体的磁珠迅速与处理好的肺癌血清在37℃下孵育1h，用pbs洗脱，将洗脱下的蛋白测序，测序结果如图1所示，序列为：

melwgaylllclfslltqvttepptqkpkkivnakkdvvntkmfevlksrldtlaqevallkeqqalqtvclkgtkvhmkcflaftqtktfheasedcisrggtlstpqtgsendalyeylrqsvgneaeiwlglndmaaegtwvdmtgariayknweteitaqpdggktencavlsgaangkwfdkrcrdqlpyicqfgiv；

鉴定为c型凝集素clec3b。

实施例2

通过spr测定凝集素clec3b和肺癌适配体的亲和力

使用cm5芯片，先用edc/nhs10μl/min活化芯片420s，然后10μl/min偶连链霉亲和素蛋白(用ph4.5醋酸稀释至50μg/ml)30min，偶连量达到2000ru响应值时，再用乙醇胺封闭芯片表面(10μl/min，500s)。用制备好的链霉亲和素包被的cm5芯片，捕获生物素标记的核酸适配体(1μg/ml，200μl)，核酸偶连量达到600ru。用pbs-p稀释凝集素clec3b溶液分别为125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91nm，体积为190μl，以50μl/min进样120s，解离300s。

结果如图2所示，从上到下1-6分别是用pbs-p稀释凝集素clec3b溶液为125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91nm，实验表明随着蛋白浓度的增加，凝集素clec3b和肺癌核酸适配体的结合响应值增加。亲和力数值如下表1所示，kd值用来表征核酸和蛋白的结合亲和力，kd值越小，亲和力越高；kd值用来表示结合产物解离的快慢，kd值越小，说明解离越慢，结合力也就越强；ka值用来表征核酸和蛋白结合的快慢，ka值越大，说明结合越快。由此可知：凝集素clec3b跟肺癌核酸适配体的亲和力很强。

表1亲和力数值

实施例3

通过emsa鉴定凝集素clec3b和肺癌适配体的特异性

表2结合反应体系

采用的dna探针是由上海生工直接合成5’-fam标记的肺癌核酸适配体探针。

结合条件：25℃，30min。

配置8％pagegel，用预冷的0.5×tbebuffer，120v恒压预电泳30min。将蛋白dna的结合产物上样，继续低温电泳150v30min。

电泳后的胶直接通过imagequantlas4000mini(gehealthcare)曝光显影。

实验结果如图3所示，其中，泳道1为核酸适配体探针；泳道2为0.5μg凝集素clec3b和适配体的结合产物；泳道3为1.0μg凝集素clec3b和适配体的结合产物；泳道4为2.0μg凝集素clec3b和适配体的结合产物；泳道5为2.0μgbsa和适配体的结合产物。适配体与凝集素clec3b结合并产生电泳条带迁移的现象，并且随着凝集素clec3b浓度的增加，产生的电泳条带迁移的现象越明显。由于实验体系中添加了鲑鱼精dna，用于消除蛋白-dna非特异结合产生的影响，因此判断凝集素clec3b与肺癌适配体探针的结合是特异的。同时在同样的体系里加入对照蛋白bsa与适配体探针进行结合，当bsa与凝集素clec3b量相同为2μg时，并没有观察到bsa与适配体探针结合产生的电泳条带迁移现象，进一步验证了只有凝集素clec3b与肺癌核酸适配体探针是特异性结合的。

实施例4

验证凝集素clec3b在肺癌血清中的高表达

elisa检测步骤：

s1、将人c型凝集素clec3b标准品配成20000pg/ml，然后等浓度稀释为10000pg/ml、5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml和312.5pg/ml，加入欲涂层96孔板，每孔100μl，对照孔为100μl样品稀释缓冲液，每组一共做三个平行样；

s2、用提供的新粘合剂盖板密封板，并在37℃孵育90min，取下盖子，丢弃平板内容物，并将平板用吸收纸巾吸干；

s3、每孔加入100μl生物素标记的抗人凝集素抗体工作液，盖上新粘合盖，37℃孵育60min；

s4、用0.01mpbs洗板3次，每次让洗涤缓冲液留在孔中1分钟，丢弃洗涤缓冲液并将纸板吸干在纸巾或其他材料上；

s5、每孔加100μlabc制备的工作溶液，用新的粘合剂盖板密封，37℃孵育30min；

s6、用0.01mpbs洗板5次，每次让洗涤缓冲液留在孔中1-2min，丢弃洗涤缓冲液并将纸板吸干在纸巾或其他材料上；

s7、每孔加入90μl制备号的tmb彩色显影剂，用新的粘合剂盖板密封，37℃孵育15-20min；

s8、向每个孔中加入100μl的终止溶液；在加入终止溶液后30min内在酶标仪中读取450nm处的吸光度，然后绘制标准曲线，如图4所示。

分别取50例肺癌患者血清和健康人血清作为实验组。待血清室温融化，以1000×g，4℃，离心15min，取上清作为试验样品，实验方法同上，分别计算肺癌血清和正常血清中人凝集素clec3b的浓度。

结果如图5和图6所示，凝集素clec3b在肺癌血清和健康人血清中的浓度分布均比较集中，经计算肺癌血清和健康人血清中凝集素clec3b的浓度均值分别为3.749和2.211ng/ml，肺癌患者血清中凝集素clec3b含量均值明显高于健康人，且差异显著。因此可看出凝集素clec3b在肺癌血清中的高表达，并能证明肺癌患者血清中的凝集素clec3b可以作为肺癌肿瘤标志物的参考。

本实施例所用的溶液和洗液均为elisa试剂盒所提供的或按照说明书配置。

综上，本发明的肺癌新肿瘤标志物c型凝集素clec3b是通过selex技术从肺癌血清中筛选获得的核酸适配体，再以该适配体为探针从肺癌血清中钓取蛋白得到的。该蛋白在肺癌血清中的表达高于正常血清，可以作为肺癌诊断的一种标志物，具有高特异性、高灵敏性，能为肺癌患者做出早期诊断。

最后应说明的是：以上所述的各实施例仅用于说明本发明技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或全部技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。