基于核酸适配体的肿瘤检测方法及试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种基于核酸适配体的肿瘤检测方法及试剂盒。

背景技术：

碱性磷酸酶(alp或akp)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，可直接参与磷代谢，在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化的过程发挥了重要作用。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使dna或rna片段的5’-p末端转换成5’-oh末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已知人类同工酶包括：组织非特异性碱性磷酸酶(tnap)，肠型碱性磷酸酶(iap)，胎盘型碱性磷酸酶(palp)和类胎盘型碱性磷酸酶(gcap)。血清碱性磷酸酶正常人血清中的碱性磷酸酶主要来自肝和骨骼，碱性磷酸酶测定主要用于诊断肝胆和骨骼系统疾病，是反映肝外胆道梗阻、肝内占位性病变和佝偻病的重要指标。

碱性磷酸酶异源二聚体在结直肠癌、乳腺癌、肝细胞癌、宫颈癌等肿瘤组织中高表达。游离的碱性磷酸酶异源二聚体、含有碱性磷酸酶异源二聚体的外泌体或循环肿瘤细胞可以从原发性肿瘤或转移病灶释放到血流中。因此，检测游离的碱性磷酸酶异源二聚体、外泌体或循环肿瘤细胞将有助于肿瘤的早期诊断和筛查、监测术后患者肿瘤的复发与转移、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化治疗的策略。

循环肿瘤细胞是指恶性肿瘤在发展过程中传播并存活于外周血中的肿瘤细胞，与肿瘤的转移和预后密切相关。循环肿瘤细胞检测是指对肿瘤患者外周血中的循环肿瘤细胞进行分析的方法，在外周血中检到循环肿瘤细胞是预示肿瘤转移最直接、重要的方法，在肿瘤早期转移的临床诊断、预后判断、监测疗效等方面具有重要意义。循环肿瘤细胞的发现有望改变临床上仍依赖于影像学检查及传统肿瘤标志物的现状。由于外周血中循环肿瘤细胞的数量极其稀少，故对检测技术的灵敏度和选择性提出了极高的要求。目前用于循环肿瘤细胞检测的方法很多，首先通过密度梯度离心法、细胞过滤或黏附技术、免疫磁珠分离技术和微流控芯片技术等方法分离富集得到循环肿瘤细胞，再通过免疫细胞化学技术、逆转录聚合酶链反应和流式细胞术等对循环肿瘤细胞进行检测。目前美国食品和药品管理局(fda)唯一批准的检测循环肿瘤细胞的方法是cellsearch系统，虽然能够实现循环肿瘤细胞的捕获与检测，但仍然要进一步提高灵敏度和特异性，并且实现方法的快速简便高通量。

外泌体是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mrna和microrna等物质。包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体。外泌体由细胞分泌释放出来，在血液等体液内传播，最后又可被其他细胞吞噬，是细胞间通讯的重要介质。越来越多的研究发现，宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移，所以外泌体的检测和研究得到了越来越多的关注。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体，

所述核酸适配体或其衍生物为如下1)-7)中任一种：

1)序列1所示的单链dna分子；

2)将1)所示的核酸适配体删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

3)将1)所示的核酸适配体进行核苷酸取代或修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

4)将1)所示的核酸适配体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

5)由1)所示的核酸适配体编码的rna分子，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体衍生物；

6)由1)所示的核酸适配体编码的肽核酸，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物；

7)将1)-6)任一所示的核酸适配体的一端或中间接上信号分子和/或活性分子和/或功能基团和/或放射性核素，得到与所述核酸适配体具有相同功能的核酸适配体的衍生物。

上述试剂盒中，

所述试剂盒具有如下1)-4)中至少一种功能：

1)检测或捕获待测样本中表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤或肿瘤细胞；

2)检测或捕获待测样本中表达或高表达碱性磷酸酶的循环肿瘤细胞；

3)检测或捕获待测样本中表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体；

4)检测或捕获待测样本中的可溶性碱性磷酸酶；

或，所述核酸适配体的衍生物为去除或改变序列1所示的核酸适配体核苷酸序列自5’端第1个核苷酸起包括5’端第一个核苷酸残基的1-7个核苷酸；和/或，去除序列1所示的核酸适配体的核苷酸序列自3’端第1个核苷酸起包括3’端第一个核苷酸残基的1-7个核苷酸；

或所述核酸适配体的衍生物为将序列1所示的核酸适配体核苷酸序列5’端或3’端增加若干个核苷酸或修饰基团且不影响序列1第10-36位形成的结构，保留的核苷酸残基组成的核酸适配体。

上述试剂盒中，

所述核酸适配体的衍生物为如下1)-6)中任一种：

1)序列2所示的单链dna分子；

2)序列3所示的单链dna分子；

3)序列4所示的单链dna分子；

4)序列5所示的单链dna分子；

5)序列6所示的单链dna分子；

6)序列7所示的单链dna分子。

上述试剂盒中，

7)所示的核酸适配体衍生物为在1)-6)任一所示的核酸适配体的5’端或3’端标记荧光基团、生物素基团或放射性核素。

上述试剂盒中，

所述固定或偶联核酸适配体或其衍生物的载体为纳米颗粒或微米颗粒或芯片。本实施例中的载体为磁性纳米颗粒，是表面带有链霉亲和素修饰的具有超顺磁性的磁性纳米颗粒(200nm)，既起到尺寸放大作用，还可用于磁分离操作，实现高效率捕获。不限于磁球，也可以是芯片等基质。

所述固定或偶联核酸适配体或其衍生物是通过偶联进行，偶联是指通过共价偶联、疏水作用或者分子间作用力连接在一起，本实施例中涉及到链霉亲和素和生物素相互作用连接。

上述试剂盒中，

所述纳米颗粒为修饰物修饰的纳米/微米颗粒；

所述修饰物为链霉亲和素、羧基、氨基或巯基。

上述试剂盒中，

所述表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤或肿瘤细胞为人宫颈癌细胞、人乳腺癌细胞、人结直肠癌细胞或人肝细胞癌细胞；

或，所述表达或高表达碱性磷酸酶的循环肿瘤细胞为人宫颈癌循环肿瘤细胞、人乳腺癌循环肿瘤细胞、人结直肠癌循环肿瘤细胞或人肝细胞癌循环肿瘤细胞。

上述试剂盒中，

所述试剂盒还包括与碱性磷酸酶反应的显色底物；

所述显色底物为荧光底物分子、化学发光底物分子或发可见光底物分子或其它碱性磷酸酶底物。本发明实施例涉及到对硝基苯磷酸二钠(pnpp)，其与碱性磷酸酶反应产生对硝基苯酚，在碱性条件下呈黄色，可以在405nm处检测吸光度。还涉及bcip/nbt与碱性磷酸酶反应后，产生蓝紫色沉淀。

上述试剂盒还包括红细胞裂解液和磁分离架；若待测样本为全血，则包括红细胞裂解液，若待测样本为血清或血浆或唾液，则不需要此裂解液。

上述的试剂盒或上述核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体在制备捕获和/或检测待测样本中表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤或肿瘤细胞的产品中的应用；

或上述的试剂盒或上述核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体在制备捕获和/或检测待测样本中表达或高表达碱性磷酸酶的循环肿瘤细胞的产品中的应用；

或上述的试剂盒或上述核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体在制备捕获和/或检测待测样本中表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体的产品中的应用；

或，上述试剂盒或上述核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体在制备捕获和/或检测待测样本中可溶性碱性磷酸酶的产品中的应用。

或上述核酸适配体或其衍生物，以及，固定或偶联所述核酸适配体或其衍生物的载体在制备捕获和/或检测待测样本中循环肿瘤细胞的产品中的应用；

表达或高表达碱性磷酸酶的循环肿瘤细胞对应的待测样本为外周血全血；

表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体对应的待测样本为外周血血清或血浆；

表达或高表达碱性磷酸酶的自由蛋白对应的待测样本为外周血血清或血浆，或唾液。

本发明提供了一种捕获和/或检测待测样本是否含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：

1)制备核酸适配体磁性纳米颗粒和去除待测样本外周血全血的红细胞；

所述制备核酸适配体磁性纳米颗粒为将上述链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒和上述生物素标记的碱性磷酸酶核酸适配体偶联，得到核酸适配体磁性纳米颗粒；

2)将所述去除红细胞外周血全血样本与所述核酸适配体磁性纳米颗粒结合后再进行磁分离，去除非特异性细胞，得到含有循环肿瘤细胞的产物；

3)检测含有循环肿瘤细胞的产物，通过检测循环肿瘤细胞判断待测样本是否含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞。

上述检测含有循环肿瘤细胞的产物的方法为如下a或b：

a、将含有循环肿瘤细胞的产物用pnpp染色显色，然后检测吸光度；以对照核酸适配体序列作为对照，若与对照核酸适配体序列捕获后吸光度值有差异，则待测样本含有或候选含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞；若与对照序列捕获后吸光度值误无差异，则待测样本不含有或候选不含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞；

b、将含有循环肿瘤细胞的产物用bcip/nbt染色后显微镜观察，若观察到表面带有蓝紫色沉淀的细胞，则待测样本含有或候选含有含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞；若无表面蓝紫色细胞，则待测样本不含有或候选不含有含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞。

本发明提供了一种捕获和/或检测待测样本是否含有表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体的方法，包括如下步骤：

1)制备核酸适配体磁性纳米颗粒和收集待测样本的肿瘤细胞外泌体；

所述制备核酸适配体磁性纳米颗粒为将上述链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒和上述生物素标记的碱性磷酸酶核酸适配体偶联，得到核酸适配体磁性纳米颗粒；

所述收集待测样本的肿瘤细胞外泌体为从待测样本的血清或血浆中收集肿瘤细胞外泌体；

2)将所述外泌体与所述核酸适配体磁性纳米颗粒结合后再进行磁分离，去除非特异性细胞，得到含有外泌体产物；

3)检测含有外泌体产物，通过检测含有外泌体产物判断待测样本是否含有表达或高表达碱性磷酸酶的肿瘤细胞。

所述检测含有外泌体产物的方法为如下a或b：

a、将含有外泌体产物用pnpp染色显色，然后检测吸光度；以对照核酸适配体序列作为对照，若与对照核酸适配体序列捕获后吸光度值有差异，则待测样本含有或候选含有表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体；若与对照序列捕获后吸光度值误无差异，则待测样本不含有或候选不含有表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体；

b、将产物用bcip/nbt染色后显微镜观察，若观察到表面带有蓝紫色沉淀，则待测样本含有或候选含有表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体；若无表面蓝紫色沉淀，则待测样本不含有或候选不含有表达或高表达碱性磷酸酶的外泌体。

本发明提供了一种捕获和/或检测待测样本的游离蛋白中是否含有碱性磷酸酶的方法，包括如下步骤：

1)制备核酸适配体磁性纳米颗粒和收集待测样本的游离蛋白；

所述制备核酸适配体磁性纳米颗粒为将上述链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒和上述生物素标记的碱性磷酸酶核酸适配体偶联，得到核酸适配体磁性纳米颗粒；

所述收集待测样本的游离蛋白为从待测样本的血清或血浆中收集游离蛋白；

2)将所述游离蛋白与所述核酸适配体磁性纳米颗粒结合后再进行磁分离，去除非特异性蛋白，得到含有游离蛋白产物；

3)检测含有游离蛋白产物，通过检测含有游离蛋白产物判断待测样本的游离蛋白中是否含有碱性磷酸酶。

所述检测含有游离蛋白产物的方法为如下a或b：

a、将含有游离蛋白产物用pnpp染色显色，然后检测吸光度；以对照核酸适配体序列作为对照，若与对照核酸适配体序列捕获后吸光度值有差异，则待测样本的游离蛋白中含有或候选含有碱性磷酸酶；若与对照序列捕获后吸光度值误无差异，则待测样本的游离蛋白中不含有或候选不含有碱性磷酸酶；

b、将产物用荧光素二磷酸显色，然后测定其荧光，若观察到有荧光产生，则待测样本的游离蛋白中含有或候选含有碱性磷酸酶；若无荧光或无明显荧光产生，则待测样本的游离蛋白中不含有或候选不含有碱性磷酸酶。

上述中，碱性磷酸酶为碱性磷酸酶异源二聚体；具体为iap/palp或iap/gcap异源二聚体。

本发明的基于核酸适配体磁性颗粒技术用于外周血中高表达碱性磷酸酶的循环肿瘤细胞捕获和检测的方法，可以实现对目标细胞高选择性的捕获及检测。磁性颗粒既可起到尺寸放大作用，用于富集循环肿瘤细胞，还可用于磁分离实现高效率捕获。通过利用碱性磷酸酶自身与显色底物的酶反应，对分离得到的循环肿瘤细胞进行可视化检测，实现了信号放大，提高了灵敏度。本发明的捕获及检测方法，无需复杂的修饰及操作过程，步骤简单，高效快速且成本低廉，可用于临床样品的检测。捕获的肿瘤细胞可以用于进一步的培养或基因检测等。

附图说明

图1为胎盘型碱性磷酸酶(palp)和肠型碱性磷酸酶(iap)分别敲降后，核酸适配体bg2的结合情况。

图2为pc-3细胞表面分布表达胎盘型碱性磷酸酶(palp)、肠型碱性磷酸酶(iap)、生殖细胞碱性磷酸酶(gcap)或其异源二聚体蛋白后，核酸适配体bg2的结合情况。

图3为核酸适配体捕获异源二聚体情况。

图4为核酸适配体1与其衍生物2-7竞争情况。

图5为核酸适配体磁性纳米颗粒捕获及检测靶细胞结果。

图6为核酸适配体磁性纳米颗粒在非特异性细胞中捕获及检测靶细胞结果。

图7为核酸适配体磁性纳米颗粒在人全血中捕获及检测靶细胞结果。

图8为核酸适配体磁性纳米颗粒在人全血中捕获及镜检靶细胞结果。

图9为核酸适配体磁性纳米颗粒在外泌体中捕获及镜检靶细胞结果。

图10为核酸适配体磁性纳米颗粒检测可溶性碱性磷酸酶的结果。

图11为核酸适配体糖球检测细胞培养基中可溶性碱性磷酸酶的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的生物素标记的碱性磷酸酶核酸适配体由上海生工生物工程股份公司合成，其中碱性磷酸酶核酸适配体序列如下：caaggaataggggtcggtgtgggtggttatgattggcttccttg，生物素或荧光素(fam)标记在该碱性磷酸酶核酸适配体的5'端；

对照核酸适配体序列如下：tttgtatctatctatcagcagtctctatgttctatctatttcctattt，生物素标记在该对照核酸适配体适配体的5'端。

下述实施例中的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒是厦门普睿迈格生物科技有限公司的产品，其浓度为10mg/ml。

下述实施例中的人结直肠癌细胞(lovo)购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，人前列腺癌细胞(pc3)、人急性t细胞白血病细胞(jurkat)购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

下述实施例中的pbs缓冲液：含12mmnah2po4、8mmna2hpo4、122mmnacl和5mmkcl，其余为水。

下述实施例中的pbst缓冲液：含12mmnah2po4、8mmna2hpo4、122mmnacl、5mmkcl、和0.01％(v/v，体积百分含量)吐温-80的溶液，其余为水。

下述实施例中的结合缓冲液：含12mmnah2po4、8mmna2hpo4、122mmnacl、5mmkcl，1μg/ml牛血清白蛋白，0.1μg/ml鲱鱼精dna和0.01％(v/v，体积百分含量)吐温-80的溶液，其余为水。

下述实施例中的工作缓冲液(ph＝9.5)：含100mmtris-hcl，100mmnacl和5mmmgcl2。

下述实施例中的红细胞裂解液是roche公司的产品，产品目录号是11814389001。

下述实施例中对硝基苯磷酸二钠盐六水合物(pnpp)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯对甲苯胺盐(bcip)和氯化硝基四氮唑兰(nbt)，均为百灵威科技有限公司的产品，产品目录号分别是254303、338560和151804。荧光素二磷酸(fluoresceindiphosphate，fdp)是thermofisherscientific公司的产品，产品货号是f2999。

下述实施例中的红细胞裂解液是西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司的产品，产品目录号是11814389001。

实施例1、核酸适配体bg2与碱性磷酸酶异源二聚体结合的研究

一、核酸适配体bg2及其衍生物的制备

1、核酸适配体bg2的合成

通过dna合成仪合成核酸适配体bg2，核酸适配体bg2的核苷酸序列如下：5’-caaggaataggggtcggtgtgggtggttatgattggcttccttg-3’(序列1)，根据试验需要可以在核酸适配体bg2上标记不同的分子。其中，本实施例中选择了荧光素(fam)或含有双硫键生物素标记核酸适配体bg2。

2、dna脱保护：用冷氨水脱保护后，然后把dna溶解在teaa溶液当中；

3、dna纯化：通过page或高效液相色谱仪纯化；

4、dna干燥：通过离心浓缩干燥；

5、溶解测定浓度备用。

核酸适配体bg2的衍生物的核苷酸序列分别可以序列2-序列7。

二、荧光素标记的核酸适配体bg2溶液(bg2-fam)的制备

1、荧光素标记的核酸适配体bg2-fam

荧光素标记的核酸适配体bg2为在核酸适配体bg2的5’端偶联荧光素基团fam得到的，用结合缓冲液溶解bg2-fam，依据紫外吸收标定浓度(200nm)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

2、荧光素标记的对照核酸序列溶液(l45-fam)(200nm)的制备

荧光素标记的对照核酸序列l45(l45-fam)为在对照核酸序列l45的5’端偶联荧光素基团fam得到的，用结合缓冲液溶解l45-fam，依据紫外吸收标定浓度(100nm)后，95℃加热5min，冰上放置5min，室温放置15min。

对照核酸序列l45的核苷酸序列：tttnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn。

三、碱性磷酸酶的敲降实验

1、转染前一天，约3×10⁵个lovo细胞接种在6孔板中，含有2ml的fbs和双抗的1640培养基。

2、待细胞生长至70-90％时，更换为2ml无双抗的1640完全培养基。

3、按照rnaimax试剂(货号：13778-075)的相关说明，在125μl的无血清opti-mem培养基中加入40pmol的sirna(其中alpi的sirna为：alpi-homo-1288，正义序列(5‘-3’)：gcaaagccuacacguccautt，反义序列(5’-3’):auggacguguaggcuuugctt；palp的sirna为：palp-homo-947，正义序列(5‘-3’)：gagacaugaaauacgagautt，反义序列(5’-3’):aucucguauuucaugucuctt)混匀。

4、8μlrnaimax试剂中加入125μl无血清opti-mem培养基稀释，混匀。

5、将上述稀释好的2种碱性磷酸酶sirna分别与rnaimax试剂1：1混合并混匀，室温放置5分钟。

6、将250μl的sirna和rnaimax混合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回摇晃细胞培养板。

7、细胞在co2培养箱中37℃中培养72小时。

8、用5mmedta的pbs消化细胞成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍。然后上述细胞分别加入200nmbg2，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测；取另一部分细胞分别加入10μg/ml的anti-iap抗体(货号：gtx60746，genetex公司)或10ug/ml的anti-palp抗体(货号：ma1-20245，thermofisherscientific公司)孵育30min，洗涤一次后，加入4μg/ml抗小鼠m-iggκbp-pe抗体(sc-516141)孵育30min，洗涤一次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。

结果如图1所示，分别用iap蛋白的sirna(siiap)或palp蛋白的sirna(sipalp)蛋白敲降后，核酸适配体bg2与靶细胞lovo的结合都降低。

四、碱性磷酸酶过表达实验

1、转染前一天，约4×10⁵个pc-3细胞接种在6孔板中，含有2ml的fbs和双抗的1640培养基。

2、待细胞生长至80-90％时，更换为2ml无双抗的1640完全培养基。

3、按照3000试剂(货号：l3000008)的相关说明，在125μl的无血清opti-mem培养基中分别加入3ug的iap、palp或gcap质粒(将iap(p09923，uniprot数据库基因的id)和palp(p05187，uniprot数据库基因的id)序列插入pcmv-myc载体的xho1andecor1酶切位点间；将gcap(p10696，uniprot数据库基因的id)序列插入pcdna3.1(-)载体的xho1和bamh1酶切位点之间)，5ulp3000^tm试剂混匀。

4、5μl3000试剂试剂中加入125μl无血清opti-mem培养基稀释，混匀。

5、将上述稀释好的质粒和3000试剂1：1混合并混匀，室温放置5分钟。

6、将250μl的质粒和3000试剂混合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回摇晃细胞培养板。

7、细胞在co2培养箱中37℃中培养48小时。

8、用5mmedta的pbs消化细胞成单分散细胞悬液后，用洗涤缓冲液洗涤2遍。然后上述细胞分别加入200nmbg2，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测；取另一部分细胞分别加入10μg/ml的anti-iap抗体(货号：gtx60746，genetex公司)或10ug/ml的anti-palp抗体(货号：ma1-20245，thermofisherscientific公司)孵育30min，洗涤一次后，加入4μg/ml抗小鼠m-iggκbp-pe抗体(sc-516141)孵育30min，洗涤一次后重悬细胞，上流式细胞仪检测。

结果如图2所示，将阴性细胞分别转染palp质粒、iap质粒或gcap质粒后，用其抗体测得它们的蛋白在细胞膜表面都有所表达，但是适配体bg2仍不与细胞结合，只有其iap蛋白和palp蛋白或iap蛋白和gcap蛋白同时表达时，核酸适配体才能够与bg2结合。说明该核酸适配体bg2可以与iap/palp或iap/gcap异源二聚体结合。

五、碱性磷酸酶原位交联-捕获实验

1、取5×10⁶个指数生长期的lovo细胞，用含5mmedta的pbs消化，pbs溶液洗涤2次.

2、加入200nm含双链键生物素标记的bg2序列在冰上孵育30分钟。

3、然后加入25μlof100mm的双交联试剂disuccinimidylsuberate(dss,thermofisherscientific公司)，冰上孵育。

4、孵育2h后，加入25μl的1mtris-hcl缓冲溶液(ph7.0)终止交联反应。

5、pbs洗涤2遍，加入0.3ml的细胞裂解液(sigma公司)，裂解细胞。

6、2000rpm离心去除沉淀，收集上清，加入链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(ge公司，货号：17-5113-01)，孵育1小时，提取靶标蛋白。

7、上述提取物加入4×sds上样缓冲液(bio-rad公司)加热60℃变性10min。

8、然后用6％sds-page电泳分离。

9、转膜至pvdf膜((millipore,公司)，然后用含5％的脱脂牛奶(上海生工)和0.1％tween-20的pbs室温封闭1h。

10、分别加入1:5000的anti-iap抗体(ab186422，abcam公司)或anti-palp抗体(ab133602，abcam公司)在4℃孵育过夜。

11、用pbst洗涤膜5次，加入hrp标记的二抗(1:5000稀释,santa公司)，室温孵育1小时。

12、用pbst洗涤膜5次，加入supersignalwestfemtomaximumsensitivitysubstrate试剂(thermofisherscientific公司)，用全自动化学发光图像分析系统(天能公司)成像。

如图3所示，核酸适配体可以捕获原位交联的碱性磷酸酶异源二聚体。

上述实验说明该核酸适配体bg2可以与iap/palp或iap/gcap异源二聚体结合。

六、核酸适配体bg2与其衍生物的竞争性实验

取一皿对数生长期的结直肠癌细胞lovo，用含0.2％edta的pbs消化成单分散细胞悬液。将荧光素标记的核酸适配体bg2(bg2-fam，100nm)分别与未标记荧光分子的bg2核酸适配体或其衍生物(序列2-7)(4μm)混合，分别加入约5×10⁴个lovo细胞，得到混合液，将混合液在冰上孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤两遍，过400目筛网后，上流式细胞仪进行检测。

结果如图4所示，未标记荧光bg2核酸适体(序列1)及代表性其衍生物(序列2-7)都能够与荧光素标记的bg2核酸适配体竞争，说明bg2的衍生物具有与bg2核酸适配体相同的功能。

实施例2、核酸适配体磁性纳米颗粒捕获及检测靶细胞

步骤如下：

(一)靶细胞捕获：

(1)偶联有bg2核酸适配体的磁性纳米颗粒的制备

取1μl浓度为10mg/ml的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒(200nm)和10μl1μm生物素标记的bg2核酸适配体溶液(溶剂为pbs)，加入到1mlpbst缓冲液中，室温震荡孵育30min，磁分离1min，pbst缓冲液洗涤2次，磁分离，得到偶联有bg2核酸适配体的磁性纳米颗粒，即为核酸适配体磁性纳米颗粒。

(2)核酸适配体磁性纳米颗粒与细胞孵育：

取培养的lovo细胞，edta消化后，pbst缓冲液洗涤2次，取不同个数的细胞(25、50、100、200、400、600个)，加入1ml结合缓冲液，加入10μl上述(1)核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

(3)磁分离：

将上述孵育后产物置于磁分离架上进行磁分离，以进一步去除非特异性细胞，pbst缓冲液洗涤2次，磁分离后得到所需的循环肿瘤细胞。

(二)靶细胞检测：

在上述(一)得到的循环肿瘤细胞中加入10μl显色底物pnpp在工作缓冲液中，37℃静置孵育2h，在405nm用酶标仪(spectramaxm5)测定吸光度。根据吸光度值与细胞个数建立正相关关系，结果如图5a所示。由图5a可见随着细胞个数增加，吸光度值随之增加，呈正相关关系，证明了该方法的可行性，检测限是5个细胞。

或将上述(一)得到的循环肿瘤细胞直接置于显微镜下观察，结果如图5(b)所示。由图5(b)可见靶细胞lovo细胞表面被核酸适配体磁性纳米颗粒包裹，证明了该捕获方法的有效性。

实施例3、核酸适配体磁性纳米颗粒在非特异性细胞中捕获及检测靶细胞

(一)靶细胞捕获：

(1)偶联有bg2核酸适配体的磁性纳米颗粒的制备：

取1μl浓度为10mg/ml的链霉亲和素修饰的200nm磁性纳米颗粒和10μl1μm生物素标记的bg2核酸适配体，在1mlpbst缓冲液中，室温震荡孵育30min，磁分离1min，pbst缓冲液洗涤2次，收集沉淀，得核酸适配体磁性纳米颗粒。

(2)核酸适配体磁性纳米颗粒与细胞孵育：

取培养的lovo细胞，edta消化后，pbst缓冲液洗涤2次，取不同个数的细胞；取10⁶个培养的jurkat细胞或pc3细胞，离心后pbst缓冲液洗涤2次，加入1ml结合缓冲液，将lovo细胞加入到jurkat细胞或pc3细胞中，加入10μl上述核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

(3)磁分离：

将上述孵育后产物置于磁分离架上进行磁分离，以进一步去除非特异性细胞，pbst缓冲液洗涤2次，磁分离后得到所需的循环肿瘤细胞。

(二)靶细胞检测：

在上述(一)得到的循环肿瘤细胞中加入10μl显色底物pnpp在工作缓冲液中，37℃静置孵育2h，在405nm用酶标仪(spectramaxm5)测定吸光度，计算捕获率(捕获率(％)＝捕获后细胞与显色底物反应产生的吸光度值/纯细胞与显色底物反应产生的吸光度值×100)。

结果如图6a所示，在10⁶个非特异性细胞jurkat细胞中，加入50、100、500、1000个靶细胞lovo，得到的捕获率均在90％左右。

或将上述(一)得到的循环肿瘤细胞直接置于显微镜下观察，结果如图6b所示，可以看出，将lovo细胞(经染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚染色后呈蓝色)与pc3细胞(经染料荧光素二乙酸染色后绿色)混合后，可以看到lovo细胞表面包裹核酸适配体磁性纳米颗粒，而非特异性细胞pc3表面无磁性纳米颗粒。证明了该方法的特异性。

实施例4、核酸适配体磁性纳米颗粒在人全血中捕获及检测靶细胞

(一)靶细胞捕获：

(1)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与识别bg2核酸适配体偶联：

取1μl浓度为10mg/ml的链霉亲和素修饰的200nm磁性纳米颗粒和10μl1μm生物素标记的bg2核酸适配体，在1mlpbst缓冲液中，室温震荡孵育30min，磁分离1min，pbst缓冲液洗涤2次，得核酸适配体磁性纳米颗粒。

(2)核酸适配体磁性纳米颗粒与细胞孵育：

取培养的lovo细胞，edta消化后，pbst缓冲液洗涤2次，取不同个数的细胞，将lovo细胞加入1ml全血中，加入2ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解10min，500g离心5min，弃红色上清，如果发现红细胞裂解不完全，重复1-2次，用pbst缓冲液洗涤2次，保留沉淀为细胞，向沉淀中加入1ml结合缓冲液，加入10μl上述核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

(3)磁分离：

将上述孵育后产物置于磁分离架上进行磁分离，以进一步去除非特异性细胞，pbst缓冲液洗涤2次，磁分离后得到所需的循环肿瘤细胞。

(二)靶细胞检测：

在上述(一)得到的循环肿瘤细胞中加入10μl显色底物pnpp在工作缓冲液中，37℃静置孵育2h，在405nm用酶标仪(spectramaxm5)测定吸光度，计算捕获率(捕获率(％)＝捕获后细胞与显色底物反应产生的吸光度值/纯细胞与显色底物反应产生的吸光度值×100)。

结果如图7所示，在1ml全血中，加入200、500、1000个靶细胞lovo，得到的捕获率均在85％以上。证明该方法在人全血样品中也可有效的进行捕获和检测。

实施例5、核酸适配体磁性纳米颗粒在人全血中捕获及镜检靶细胞

下述实施例中bcip/nbt工作液：bcip浓度为50mg/ml溶于100％二甲基甲酰胺中，nbt浓度为50mg/ml溶于70％二甲基甲酰胺中，在每1ml工作缓冲液中先加入4μlnbt，混匀后再加入4μlbcip，再次混匀，该试剂配制好后在1h内使用，当与碱性磷酸酶反应后，产生蓝紫色沉淀。

(一)靶细胞捕获：

(1)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与识别bg2核酸适配体偶联：

取1μl浓度为10mg/ml的链霉亲和素修饰的200nm磁性纳米颗粒(结合生物素标记的寡核苷酸300pmol/mg)和10μl1μm生物素标记的bg2核酸适配体，在1mlpbst缓冲液中，室温震荡孵育30min，磁分离1min，pbst缓冲液洗涤2次，得核酸适配体磁性纳米颗粒。

(2)核酸适配体磁性纳米颗粒与细胞孵育：

取培养的lovo细胞，edta消化后，pbst缓冲液洗涤2次，将50个lovo细胞加入1ml全血中，加入2ml红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解10min，500g离心5min，弃红色上清，如果发现红细胞裂解不完全，重复1-2次，用pbst缓冲液洗涤2次，加入1ml结合缓冲液，加入上述10μl核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

取培养的lovo细胞，edta消化后，pbst缓冲液洗涤2次，将10个lovo细胞加入1ml血清或血浆中，加入上述核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

(4)磁分离：

将上述孵育后产物置于磁分离架上进行磁分离，以进一步去除非特异性细胞，pbst缓冲液洗涤2次，磁分离后得到所需的循环肿瘤细胞。

(二)靶细胞检测：

在上述(一)得到的循环肿瘤细胞中加入10μlbcip/nbt工作液，室温静置孵育30min后，直接置于显微镜下观察。

结果如图8所示，图8(a)为全血中捕获所得循环肿瘤细胞，图8(b)为血浆中捕获所得循环肿瘤细胞，图8(c)为血清中捕获所得循环肿瘤细胞，可以看出碱性磷酸酶高表达的循环肿瘤细胞与bcip/nbt反应后，在细胞表面产生蓝紫色沉淀，而白细胞表现无明显现象，证明该方法有望可以实现实际样品的镜检。因此，这种高效、高选择性、快速捕获的方法有望用于临床样本中循环肿瘤细胞的检测，从而有助于癌症的早期诊断和预后评价。

上述结果表明，核酸适配体和磁性纳米颗粒可用于检测待测样本中是否含有循环肿瘤细胞，检测所用的试剂盒包括如下物质：

链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、生物素标记的bg2核酸适配体，其中，bg2核酸适配体的核苷酸为序列表中序列1；

还包括用于循环肿瘤细胞捕获的其他物质，如pbst缓冲液、结合缓冲液、红细胞裂解液和磁分离架；

还包括用于循环肿瘤细胞检测的其他物质，如用于能结合碱性磷酸酶的染色物(如显色底物pnpp或bcip/nbt)、荧光底物、分光光度计或显微镜。

检测的方法具体步骤如下：

1)将上述链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒和上述生物素标记的bg2核酸适配体偶联，得到核酸适配体磁性纳米颗粒；

2)将待测样本与所述核酸适配体磁性纳米颗粒结合后再进行磁分离，去除非特异性细胞，得到含有循环肿瘤细胞的产物；

3)检测含有循环肿瘤细胞的产物，实现捕获和/或检测待测样本中循环肿瘤细胞。

上述检测含有循环肿瘤细胞的产物的方法为如下a或b：

a、将含有循环肿瘤细胞的产物用pnpp染色显色，然后检测吸光度；以对照核酸适配体序列作为对照，若与对照核酸适配体序列捕获后吸光度值有差异，则待测样本含有或候选含有循环肿瘤细胞；若与对照序列捕获后吸光度值误无差异，则待测样本不含有或候选不含有循环肿瘤细胞；

b、将含有循环肿瘤细胞的产物用bcip/nbt染色后显微镜观察，若观察到表面带有蓝紫色沉淀的细胞，则待测样本含有或候选含有循环肿瘤细胞；若无表面蓝紫色细胞，则待测样本不含有或候选不含有循环肿瘤细胞。

实施例6、核酸适配体磁性纳米颗粒对外泌体的捕获及检测

(一)外泌体的捕获：

(1)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与识别bg2核酸适配体偶联：

取1μl浓度为10mg/ml的链霉亲和素修饰的200nm磁性纳米颗粒和10μl1μm生物素标记的bg2核酸适配体，在1mlpbst缓冲液中，室温震荡孵育30min，磁分离1min，pbst缓冲液洗涤2次，得核酸适配体磁性纳米颗粒。

(2)外泌体的制备

外泌体通过常用的超高速离心法制备，首先lovo细胞在正常含有血清的培养基中培养，细胞密度达到70-80％后，去除原有培养基，换为无血清培养基，继续培养48h后，收集细胞上清，800×g，4℃离心10min，小心吸取上清，2000×g，4℃离心20min，收集上清，10000×g，4℃离心30min，收集上清，确保细胞或细胞碎片去除干净，将上清120000×g，4℃离心120min，弃上清，用pbs缓冲液重悬沉淀，120000×g，4℃离心120min，用200μlpbs缓冲液分散所得外泌体。

(3)核酸适配体磁性纳米颗粒与外泌体孵育：取不同浓度(0.25、0.5、1、2、4、8μg/ml)的上述(2)所得外泌体，加入1ml结合缓冲液，加入上述(1)核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

(4)磁分离：

将上述孵育后产物置于磁分离架上进行磁分离，pbs缓冲液洗涤2次，磁分离后得到所需的外泌体。

(二)外泌体检测：

在上述(一)得到的外泌体中加入10μl显色底物pnpp在工作缓冲液中，37℃静置孵育2h，在405nm用酶标仪(spectramaxm5)测定吸光度，根据吸光度值与外泌体浓度建立正相关关系，结果如图9所示。由图9可见随着外泌体浓度增加，吸光度值随之增加，呈正相关关系，证明了该方法的可行性，检测限为0.03μg/ml。

实施例7、肿瘤患者血浆/血清样品的自由蛋白检测

(一)自由蛋白的捕获：

(1)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与识别bg2核酸适配体偶联：

取1μl浓度为10mg/ml的链霉亲和素修饰的200nm磁性纳米颗粒(结合生物素标记的寡核苷酸300pmol/mg)和10μl1μm生物素标记的bg2核酸适配体，在1mlpbst缓冲液中，室温震荡孵育30min，磁分离1min，pbst缓冲液洗涤2次，得核酸适配体磁性纳米颗粒。

(2)核酸适配体磁性纳米颗粒与人血清/血浆样品孵育：

将不同浓度的碱性磷酸酶(10、20、40、80、160u/l),加入1ml结合缓冲液，加入上述(1)核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

在1ml血清/血浆样品中，直接加入上述(1)核酸适配体磁性纳米颗粒，4℃震荡孵育30min。

(4)磁分离：

将上述孵育后产物置于磁分离架上进行磁分离，以进一步去除非特异性蛋白，pbst缓冲液洗涤2次，磁分离后得到所需的细胞可溶性碱性磷酸酶。

(二)可溶性碱性磷酸酶的检测：

在上述(一)得到的可溶性碱性磷酸酶中加入10μl显色底物pnpp在工作缓冲液中，37℃静置孵育2h，在405nm用酶标仪(spectramaxm5)测定吸光度，根据吸光度值与可溶性碱性磷酸酶的浓度建立正相关关系，结果如图10所示。由图10可见随着可溶性碱性磷酸酶浓度增加，吸光度值随之增加，呈正相关关系，证明了该方法的可行性，检测限为2.4u/l。

将1ml血清/血浆样品所测的吸光度值带入上述标准曲线，得血清/血浆中可溶性碱性磷酸酶的浓度为155u/l。

实施例8、细胞培养基中的自由碱性磷酸酶异源二聚体蛋白检测

(1)分别取1ml指数生长期的lovo细胞的培养基和1ml指数生长期的pc-3细胞的培养液，1000rpm离心5min去掉细胞碎片，分别与10nm生物素标记的bg2核酸适配体或生物素标记的对照核酸序列(4℃)震荡孵育30分钟。

(2)然后分别加入10μl链霉亲和素修饰的琼脂糖微球(ge公司，货号：17-5113-01)在4℃震荡孵育60分钟。

(3)2000rpm离心去除上清，pbst缓冲液洗涤2次。

(4)在上述得到的可溶性碱性磷酸酶中加入10μl显色底物pnpp在工作缓冲液中，37℃静置孵育2h，在405nm用酶标仪(spectramaxm5)测定吸光度，结果如图11a所示。

或，在(3)得到产物中，加入100μl的10μm荧光素二磷酸在工作缓冲液中，37℃静置孵育1h，在用酶标仪(spectramaxm5)在488nm激发，测定530nm发射，结果如图11b所示。

由图11可见在碱性磷酸酶表达的细胞系(lovo)培养液中可以捕获到碱性磷酸酶，而对阴性表达细胞(pc3)的培养液中没有。这证明了该方法可以用于实际样品中自由碱性磷酸酶异源二聚体的捕获和检测。

序列表

<110>中国科学院化学研究所

<120>基于核酸适配体的肿瘤检测方法及试剂盒

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