一种肌酐测定试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种肌酐测定试剂盒及其应用。

背景技术：

肌酐是在肌肉中肌酸和磷酸肌酸代谢的最终产物，仅仅由肾小球排泄，不被肾小管重吸收，通常不与血浆蛋白结合。当肾脏机能受损时，肌酐的正常排泄受到阻碍，致使血清中肌酐含量增加。肾病在我国乃至世界上的发病率居于前10位。调查数据显示，我国隐形肾病患者约占人口的25％，因此肌酐水平的测定对肾脏疾病具有重要的临床意义。

肌酐作为小分子蛋白代谢产物，在人体血清中含量极低，且与其母体化合物肌酸共存，二者在一定条件下可相互转化。肌酐测定的主要方法有同位素稀释质谱法、高效液相层析法、化学测定法(碱性苦味酸法)、酶法等。其中，同位素稀释质谱法通过向样品溶液中加入一种同位素标记物作为内标物，在溶质与标记物溶液充分平衡后，对样品进行预处理，利用gc或lc-ms测定标记物与溶质的峰强度比来测定溶质的浓度，具有特异性高、准确度高等特点，但质谱价格昂贵、操作不便；高效液相层析法利用三氯乙酸、阳离子交换柱等对样品进行前处理，操作较复杂，不适用于大批量的临床标本分析；碱性苦味酸法成本低廉，操作简便，但一些“假肌酐”(如胍基乙酸内酰胺(glycocyamidine)、5-甲基胍基乙酸内酰胺)等干扰物质可导致肌酐测定结果偏高。

近年来，临床上常使用酶法进行肌酐含量的测定，酶法测定肌酐主要是利用肌酐酶催化肌酐水解生成肌酸，生成的肌酸在多种酶的系列作用下产生酚类物质，通过测色法即可确定肌酐含量。但酶法测定肌酐含量时，其主要干扰物为样品中的肌酸，为去除肌酸的干扰，现有试剂盒多采用双试剂法。比如，中国专利cn104459164b公开的一种血清肌酐检测试剂涉及双试剂法，利用γ-fe2o3纳米粒子充分消除了内源肌酸的污染。

但现有技术旨在消除内源性肌酸及其他物质的干扰，忽视了临床对肌酐含量测定的范围的需要，当样本肌酐含量较高时，通常需要稀释样本才能测定，操作不便。比如，中国专利cn106198509b公开了用于测定肌酐的试剂盒和方法，该试剂盒能抵抗羟苯磺酸钙和酚磺乙胺对肌酐检测的负干扰，但是肌酐含量的线性检测范围仅在2000μmol/l以下，对于高肌酐含量的样品无法进行准确测定。

另外，此类酶法试剂盒中添加多种酶类，如肌酸酶、过氧化氢酶、肌酐酶，这些酶的稳定直接影响到试剂盒的保存时间。比如，中国专利cn102721684b公开了血清中肌酐的二步酶法测定方法及测定试剂，该试剂盒通过添加多种表面活性剂以规避过氧化物酶造成本底过高的问题，但是大量表面活性剂的使用易造成试剂盒稳定性差的情况。

因此，急需开发一种具有较宽线性范围、稳定性好的的肌酐含量检测试剂盒。

技术实现要素：

针对现有技术在肌酐含量测定过程中存在的线性范围窄、稳定性差的缺陷，本发明提供了一种肌酐测定试剂盒，该试剂盒准确性好、特异性高、稳定性好且具有较宽的线性范围的，适用于临床全白动或半自动生化分析。

为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案实现：

一方面，本发明提供了一种肌酐测定试剂盒，所述的试剂盒包括试剂r1和试剂r2；

所述的试剂r1包括：肌酸酶、过氧化氢酶、肌氨酸氧化酶、4-氨基安替比林、抑制剂和缓冲液；

所述的试剂r2包括：肌酐酶、过氧化物酶、显色剂、抗坏血酸氧化酶、抑制剂和缓冲液。

所述的试剂r1和试剂r2还包括酵母提取物。

优选地，所述的肌酐测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：肌酸酶10.0-20.0ku/l、过氧化氢酶5.0-30.0ku/l、肌氨酸氧化酶50.0-100.0ku/l、4-氨基安替比林1.0-10.0mmol/l、抑制剂0.1-3.0g/l、缓冲液50.0-100.0mmol/l和酵母提取物0.2-3.0g/l；

所述的试剂r2包括：肌酐酶100.0-200.0ku/l、过氧化物酶1.0-10.0ku/l、显色剂1.0-10.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶2.0-15.0ku/l、抑制剂0.1-3.0g/l、缓冲液50.0-100.0mmol/l和酵母提取物0.2-3.0g/l。

再优选地，所述的肌酐测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：肌酸酶12.0-18.0ku/l、过氧化氢酶8.0-25.0ku/l、肌氨酸氧化酶60.0-90.0ku/l、4-氨基安替比林2.0-8.0mmol/l、抑制剂0.5-2.5g/l、缓冲液60.0-90.0mmol/l和酵母提取物0.5-2.0g/l；

所述的试剂r2包括：肌酐酶130.0-180.0ku/l、过氧化物酶3.0-8.0ku/l、显色剂2.0-6.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶5.0-12.0ku/l、抑制剂0.5-2.5g/l、缓冲液60.0-90.0mmol/l和酵母提取物0.5-2.0g/l。

更优选地，所述的肌酐测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：肌酸酶15.0-17.0ku/l、过氧化氢酶10.0-20.0ku/l、肌氨酸氧化酶70.0-80.0ku/l、4-氨基安替比林3.0-6.0mmol/l、抑制剂0.8-1.5g/l、缓冲液70.0-85.0mmol/l和酵母提取物0.8-1.5g/l；

所述的试剂r2包括：肌酐酶130.0-180.0ku/l、过氧化物酶4.0-6.0ku/l、显色剂3.0-5.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶5.0-12.0ku/l、抑制剂0.8-1.5g/l、缓冲液70.0-85.0mmol/l和酵母提取物0.8-1.5g/l。

其中，所述的抑制剂为叠氮钠、羟胺和氟化物中的一种或几种；优选地，所述的抑制剂为叠氮钠。

其中，所述的显色剂为2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠、苯酚和4-氯苯酚中的一种或几种；优选地，所述的显色剂为2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠。

其中，所述的缓冲液为ph值为7.0的磷酸盐缓冲液、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液和ph值为7.0的硼酸盐缓冲液中的一种或几种；优选地，所述的缓冲液为ph值为7.0的磷酸盐缓冲液。

进一步优选地，所述的肌酐测定试剂盒中，所述的试剂r1包括：肌酸酶16.0ku/l、过氧化氢酶15.0ku/l、肌氨酸氧化酶75.0ku/l、4-氨基安替比林5.0mmol/l、叠氮钠1.0g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液80.0mmol/l和酵母提取物1.0g/l；

所述的试剂r2包括：肌酐酶150.0ku/l、过氧化物酶5.0ku/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠4.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶10.0ku/l、叠氮钠1.0g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液80.0mmol/l和酵母提取物1.0g/l。

所述的肌酐测定试剂盒中，还包括液体肌酐标准品5.0ml，浓度为10.0μmol/ml。

另一方面，本发明还提供了一种肌酐测定试剂盒的使用方法：

本试剂盒适用于杜邦ar、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞bs320、迪瑞cs600、雅培c8000、东芝tba40fr、奥林巴斯au2700、贝克曼dxc800、西门子advia2400、罗氏p800等全自动生化分析仪。

该测定试剂盒的测定方法为两点终点法，反应方向为升反应：

(1)将270μl试剂r1和6μl待测样本混合均匀，37℃孵育5min后得到反应液1，测定吸光度a1，测定主波长为546nm、次波长为700nm；

(2)加入90μl试剂r2混合均匀，反应5min，得到反应液2，测定吸光度a2，测定主波长为546nm、次波长为700nm；

(3)按照步骤(1)-(2)，对不同浓度的肌酐标准品的吸光度进行测定，得到吸光度a空白和a标准；

(4)以标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线方程；

(5)计算样本的吸光度变化值δa(a2-a1)，根据标准曲线方程，得到样本中肌酐含量。

本发明还提供了肌酐测定试剂盒在测定血清肌酐含量中的应用。

本发明与现有技术相比，本发明的有益效果有：

(1)本发明提供的肌酐测定试剂盒组分简单，各试剂组分以较优浓度进行配比，线性范围可达8840μmol/l；

(2)本发明通过向试剂r1和r2中加入酵母提取物，使得试剂盒的稳定性显著增加；

(3)本发明提供的肌酐测定试剂盒准确度高，理论浓度与实测浓度的线性相关系数r≧0.9800；

(4)本发明提供的肌酐测定试剂盒，所需标本量少(6μl血清即可)，且基本不受胆红素、血红蛋白、维生素、甘油三酯、肝素和枸橼酸钠等影响；当胆红素、血红蛋白、维生素、甘油三酯、肝素和枸橼酸钠分别高至257μmol/l、0.5g/l、3mmol/l、15mmol/l、50ku/l和10g/l时，对肌酐测定无明显影响。

附图说明

图1为0-9000μmol/l范围内肌酐测定试剂盒标准曲线；

图2为0-50μmol/l范围内肌酐测定试剂盒标准曲线；

图3为0-9000μmol/l范围内肌酐测定试剂盒线性范围图；

图4为0-50μmol/l范围内肌酐测定试剂盒线性范围图；

图5为常温条件下实施例1稳定性图；

图6为常温条件下对比例1稳定性图；

图7为常温条件下对比例2稳定性图；

图8为常温条件下对比例3稳定性图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

测试条件与方法：

仪器：日立7080全自动生化分析仪

参数：

操作步骤：

实施例1

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶10.0ku/l、过氧化氢酶5.0ku/l、肌氨酸氧化酶50.0ku/l、4-氨基安替比林1.0mmol/l、羟胺0.1g/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液50.0mmol/l和酵母提取物0.2g/l；试剂r2包括：肌酐酶100.0ku/l、过氧化物酶1.0ku/l、苯酚1.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶2.0ku/l、羟胺0.1g/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液50.0mmol/l和酵母提取物0.2g/l。

实施例2

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶20.0ku/l、过氧化氢酶30.0ku/l、肌氨酸氧化酶100.0ku/l、4-氨基安替比林10.0mmol/l、羟胺3.0g/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液100.0mmol/l和酵母提取物3.0g/l；试剂r2包括：肌酐酶200.0ku/l、过氧化物酶10.0ku/l、苯酚10.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶15.0ku/l、羟胺3.0g/l、ph值为7.0的3-吗啉丙磺酸缓冲液100.0mmol/l和酵母提取物3.0g/l。

实施例3

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶12.0ku/l、过氧化氢酶8.0ku/l、肌氨酸氧化酶60.0ku/l、4-氨基安替比林2.0mmol/l、氟化物0.5g/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液60.0mmol/l和酵母提取物0.5g/l；试剂r2包括：肌酐酶130.0ku/l、过氧化物酶3.0ku/l、4-氯苯酚2.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶5.0ku/l、氟化物0.5g/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液60.0mmol/l和酵母提取物0.5g/l。

实施例4

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶18.0ku/l、过氧化氢酶25.0ku/l、肌氨酸氧化酶90.0ku/l、4-氨基安替比林8.0mmol/l、氟化物2.5g/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液90.0mmol/l和酵母提取物2.0g/l；试剂r2包括：肌酐酶180.0ku/l、过氧化物酶8.0ku/l、4-氯苯酚6.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶12.0ku/l、氟化物2.5g/l、ph值为7.0的硼酸盐缓冲液90.0mmol/l和酵母提取物2.0g/l。

实施例5

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶15.0ku/l、过氧化氢酶10.0ku/l、肌氨酸氧化酶70.0ku/l、4-氨基安替比林3.0mmol/l、叠氮钠0.8g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液70.0mmol/l和酵母提取物0.8g/l；试剂r2包括：肌酐酶130.0ku/l、过氧化物酶4.0ku/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠3.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶5.0ku/l、叠氮钠0.8g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液70.0mmol/l和酵母提取物0.8g/l。

实施例6

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶17.0ku/l、过氧化氢酶20.0ku/l、肌氨酸氧化酶80.0ku/l、4-氨基安替比林6.0mmol/l、叠氮钠1.5g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液85.0mmol/l和酵母提取物1.5g/l；试剂r2包括：肌酐酶180.0ku/l、过氧化物酶6.0ku/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠5.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶12.0ku/l、叠氮钠1.5g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液85.0mmol/l和酵母提取物1.5g/l。

实施例7

本实施例的肌酐测定试剂盒组分及其浓度如下：

试剂r1包括：肌酸酶16.0ku/l、过氧化氢酶15.0ku/l、肌氨酸氧化酶75.0ku/l、4-氨基安替比林5.0mmol/l、叠氮钠1.0g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液80.0mmol/l和酵母提取物1.0g/l；试剂r2包括：肌酐酶150.0ku/l、过氧化物酶5.0ku/l、2-羟基-3-间甲苯胺丙磺酸钠4.0mmol/l、抗坏血酸氧化酶10.0ku/l、叠氮钠1.0g/l、ph值为7.0的磷酸盐缓冲液80.0mmol/l和酵母提取物1.0g/l。

对比例1

与实施例1相比，试剂r1和r2缺少酵母提取物。

对比例2

与实施例1相比，试剂r1缺少酵母提取物。

对比例3

与实施例1相比，试剂r2缺少酵母提取物。

对比例4

中国专利cn102721684b所述试剂

实验例1肌酐测定试剂盒标准曲线

(1)采用肌酐标准品，肌酐标准品浓度分别为0、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000μmol/l，以实施例7为例，按照上述测定步骤得到的肌酐测定试剂盒标准曲线(如图1所示)。其中，标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，标准曲线方程：y＝0.993x-0.04，r2＝0.9942。

(2)采用肌酐标准品，肌酐标准品浓度分别为0、10、20、30、40、50μmol/l，以实施例7为例，按照上述测定步骤得到的肌酐测定试剂盒标准曲线(如图2所示)。其中，标准品的吸光度变化值δa(a标准-a空白)为纵坐标，以相应的标准品浓度c为横坐标，标准曲线方程：y＝0.01x+0.0042，r²＝0.992。

实验例2肌酐测定试剂盒线性范围的测试

(1)分别取浓度为2000、4000、5000、6000、7000、8000、9000μmol/l的肌酐标准品，分别用实施例和对比试剂盒所述试剂测定肌酐含量，结果如表1所示：

表1线性范围对比

由表1可见，在0-8000μmol/l浓度范围内，本发明试剂盒能够达到理论值且二者相关性较好。申请人又检测了8000-9000μmol/l浓度范围内肌酐测定试剂盒与理论值的相关性。结果表明，在0-8840μmol/l浓度范围内，本发明试剂盒的测试能够达到理论值且二者相关性较好(图3)，而对比例在样本浓度为6000μmol/l时，测试结果低于理论值，不能满足要求，由此可见本试剂盒的线性范围较广。

(2)分别取浓度为0、10、20、30、40、50μmol/l，分别用实施例和对比试剂盒所述试剂测定肌酐含量。结果表明在0-50μmol/l浓度范围内，本发明试剂盒能够达到理论值且二者相关性较好(图4)。

综上所述，本发明提供的肌酐测定试剂盒线性范围较广，最高可达8840μmol/l；在检测低浓度肌酐时也具有较好的准确性。

实验例3稳定性测试

(1)2-8℃条件下的稳定性

将实施例1、2、3的肌酐测定试剂盒试剂1和试剂2置于2-8℃冷库中，分别在存放前、2-8℃冷库存放3个月、6个月和12个月后对标准品进行测定分析。本发明的肌酐测定试剂盒具有良好的稳定性，在2-8℃存放一年后，均保持95％以上的反应活性。

(2)37℃条件下的稳定性

将实施例1、2、3的肌酐测定试剂盒试剂1和试剂2置于37℃水浴中，分别在放置前、37℃水浴3天、7天和10天后对标准品进行测定分析。本发明的肌酐测定试剂盒具有良好的稳定性，在37℃水浴10天后，均保持95％以上的反应活性。

(3)常温条件下的稳定性

将实施例1、2、3的肌酐测定试剂盒试剂1和试剂2放置于常温条件下，分别在存放前、存放2个月、4个月、6个月后对标准品进行测定，结果如图5-8所示，通过向试剂r1和r2中同时添加酵母提取物，使得该试剂盒在常温条件下的稳定性显著提高，增加了本发明试剂盒用于临床诊断的实用性。

实施例4干扰实验

在正常血清中各自添加一定量的胆红素、血红蛋白、维生素、甘油三酯、肝素和枸橼酸钠，同时加入等体积的去离子水作为无干扰物血清，使用实施例1-7的肌酐测定试剂盒，同时测定这些样本的浓度。以干扰程度为5％为测定系统对干扰物的最高忍受限，血清中胆红素257μmol/l以下、血红蛋白0.5g/l以下、维生素3mmol/l以下、甘油三酯15mmol/l以下、肝素50ku/l以下和枸橼酸钠10g/l以下，不影响肌酐测定结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。