用于斑点免疫印迹的装置的制作方法

本发明涉及在斑点免疫印迹应用中使用的装置，尤其涉及一种在斑点免疫印迹中提供高通量检测分析的装置。本发明还涉及使用上述装置的斑点免疫印迹方法。

背景技术：

斑点免疫印迹技术(dot-blot)是生物化学和分子生物学的支柱，其主要用于对细胞、组织、器官、体液等中的特定蛋白质进行定性检测。一般而言，斑点免疫印迹的操作步骤是将蛋白(抗原)附着于固相载体后，再将固相载体置于反应体系中进行抗体孵育及显色。当涉及多种不同的抗原以及多种不同条件的反应体系时，现有技术中一般是先将检测膜按需要修剪成小块，然后将得到的小块检测膜分别放入不同的容器中，再各自加入抗体进行检测，这种方法操作繁琐，无法实现高通量的要求。

因此，非常需要一种可以提高单批次检测数量并最大程度地降低人为干扰因素的新技术。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供在斑点免疫印迹中使用的装置和方法。该装置和方法除了具备传统斑点免疫印迹的优点，还可以实现高通量检测，提高单批次的检测数量并最大程度地降低人为因素的干扰。

具体地，本发明的第一方面提供一种用于斑点免疫印迹的装置，包括：

孔板，所述孔板上设置有至少两个通孔；以及

位于所述孔板下方的检测部件，所述检测部件的上表面包括固相载体，所述固相载体局部或完全覆盖所述检测部件的上表面；

其中，至少两个所述通孔的下孔口与所述检测部件的上表面紧密贴合，以形成至少两个半密闭空间，至少部分所述固相载体位于所述半密闭空间的底部范围内。

在一些实施方案中，所述检测部件的上表面还包括至少两个通过凹槽彼此隔开的子区域，至少一个所述半密闭空间的底部位于所述子区域内。

在一些实施方案中，所述子区域通过凹槽包围形成。

在一些实施方案中，至少两个所述半密闭空间的底部分别落入与之一一对应的所述子区域内；优选地，每个所述半密闭空间的底部分别落入与之一一对应的所述子区域内。

在一些实施方案中，所述检测部件自上而下包括相互紧密贴合的固相载体和支撑体。

在一些实施方案中，位于所述半密闭空间的底部范围内的固相载体与所述半密闭空间的底部之间的横截面积比为1:1-1:5。

在一些实施方案中，所述固相载体为膜。

在一些实施方案中，所述固相载体由包括硝酸纤维素、尼龙、pvdf、nytron、biodyne或porex的材料形成。

在一些实施方案中，所述凹槽的深度小于所述检测部件的厚度。

在一些实施方案中，所述凹槽的深度为所述检测部件厚度的10％-90％。

在一些实施方案中，所述凹槽通过工具刻划或模具压制形成。

在一些实施方案中，所述固相载体与所述支撑体之间的紧密贴合通过粘合剂和/或热压和/或双面含胶的制品实现。

在一些实施方案中，所述支撑体由包括泡沫的材料形成。

在一些实施方案中，所述孔板与所述检测部件通过粘合剂贴合和/或通过硬质底托扣紧。

在一些实施方案中，所述硬质底托设置为敞口结构，其内沿紧贴所述孔板以及所述检测部件的外周。

在一些实施方案中，所述硬质底托由包括硬质塑料、木材或金属的材料形成。

在一些实施方案中，所述半密闭空间规则分布在所述装置中。

在一些实施方案中，所述孔板和/或所述检测部件表面具有横坐标和/纵坐标刻度线。

本发明的第二方面提供一种免疫印迹方法，其使用了上述第一方面涉及的装置。

本发明的第三方面提供一种免疫印迹方法，包括：

(a)将蛋白质从样品转移至位于上述第一方面涉及的半密闭空间底部范围内的固相载体上；

(b)将缓冲激活液加入所述半密闭空间中；

(c)将一抗溶液加入所述半封闭空间中；

(d)将二抗溶液加入所述半封闭空间中；

(e)检测所述抗体溶液中的抗体与蛋白质的结合。

附图说明

图1为本发明实施例1的孔板示意图。

图2为沿图1的孔板高度方向的剖视图。

图3为本发明实施例1的检测部件示意图。

图4为沿图3的检测部件高度方向的剖视图。

图5为本发明实施例1的硬质底托示意图。

图6为沿图5的硬质底托高度方向的剖视图。

图7为本发明实施例1中装置的组合示意图。

图8为本发明实施例1中半密闭空间的示意图。

附图标记说明

1：装置

2：孔板

3：通孔

4：上孔口

5：下孔口

6：检测部件

7：固相载体

8：支撑体

9：双面胶

10：子区域

11：凹槽

12：底托

13：半封闭空间

具体实施方案

参考以下本发明的优选实施方案的详述以及包括的实施例可更容易地理解本公开内容。在以下说明书和权利要求书中将提及大量的术语，这些术语被定义为具有下列含义。

在本说明书中，术语“高通量”指一次可检测多个样品或对同一样品进行多种检测。

在本说明书中，术语“固相载体”是指可在固相上固定核酸分子、载体、宿主、抗体、适体、多肽等的材料。

在本说明书中，术语“检测部件”是指至少部分表面覆盖有固相载体的部件。

在本说明书中，术语“抗体”是指通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区内的抗原识别位点，识别和特异性结合(诸如蛋白、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或上述物质的组合等靶标)的免疫球蛋白分子。可用于本申请的抗体包括不同的抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们展示所要的抗原结合活性。抗体是由免疫系统生成的能够识别并结合特定抗原的蛋白质。抗体可以是人的、人源化的、鼠的、嵌合的或衍生自其他物种，只要所述抗体显示所需的生物活性即可。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的抗体重链恒定域的同一性，抗体可以是五个主要种类免疫球蛋白中的任一种：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)。不同种类的免疫球蛋白具有不同的亚基结构和三维构造。免疫球蛋白可以源自任何物种，包括鼠、人或兔。抗体可以是裸露的或与诸如毒素、放射性同位素等其它分子缀合。

在本说明书中，术语“抗体片段”表示全长抗体的一部分，和表示全长抗体的抗原性决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。本文所用的“抗体片段”包括抗原结合位点或表位结合位点。

在本说明书中，术语“样品”以其最广泛的意义使用。在某种情况下，样品包括细胞(例如人、细菌、酵母和真菌)、有机体、从任何来源获得的试样或培养物，以及生物和环境样品。其中，生物样品可从动物(包括人)获得并且指在其中发现的生物材料或组合物，包括但不限于骨髓、组织间液、尿液、脑脊液、核酸、dna、血液、血清、血小板、血浆、组织以及其纯化或过滤形式；环境样品包括但不限于地表物质、土壤、水、晶体和工业样品。

本申请的第一方面涉及一种用于免疫印迹的装置，包括：

孔板，该孔板上设置有至少两个通孔；以及

位于该孔板下方的检测部件，该检测部件的上表面包括固相载体，该固相载体局部或完全覆盖检测部件的上表面；

其中，至少两个通孔的下孔口与检测部件的上表面紧密贴合，以形成至少两个半密闭空间，至少部分固相载体位于该半密闭空间的底部范围内。

由于本申请中的通孔与检测部件的上表面形成至少两个半密闭空间，且固相载体位于该半密闭空间内。因此，本申请允许在至少两个独立的检测空间内实施斑点免疫印迹，进而实现一次检测多个样品或对同一样品同时进行多种检测的目的。

在一些实施方案中，用于本申请的通孔可以规则地或不规则地分布。用于本申请的通孔数量并无特别限制，可以为大于2的任何整数，均可实现本发明的目的，例如可以为2-1024中的任何整数，优选地，通孔数量为6、12、24、48或96中的一种。用于本申请的通孔还可以具有任何合适的大小和形状。在一些实施方案中，通孔的上、下孔口可以相同或不同，且可选自下组：圆形、非圆形、正方形、长方形、椭圆形及多角形。优选地，为了制作及使用方便，通孔的上、下孔口设置为相同形状。更优选地，通孔的上、下孔口为相同尺寸的圆形。在一些优选实施方案中，将通孔设置成足以允许必要的溶液(例如，抗体溶液)有效地进入半密闭空间的底部。在一些优选实施方案中，通孔的上、下孔口为相同尺寸的圆形，且其横截面积为0.1cm²-100cm²，例如为0.1cm²、0.2cm²、0.3cm²、0.4cm²、0.5cm²、0.6cm²、0.7cm²、0.8cm²、0.9cm²、1.0cm²、1.1cm²、1.2cm²、1.3cm²、1.4cm²、1.5cm²、1.6cm²、1.7cm²、1.8cm²、1.9cm²、2.0cm²、2.1cm²、2.2cm²、2.3cm²、2.4cm²、2.5cm²、2.6cm²、2.7cm²、2.8cm²、2.9cm²、3.0cm²、3.1cm²、3.2cm²、3.3cm²、3.4cm²、3.5cm²、3.6cm²、3.7cm²、3.8cm²、3.9cm²、4.0cm²、4.1cm²、4.2cm²、4.3cm²、4.4cm²、4.5cm²、4.6cm²、4.7cm²、4.8cm²、4.9cm²、5.0cm²、5.1cm²、5.2cm²、5.3cm²、5.4cm²、5.5cm²、5.6cm²、5.7cm²、5.8cm²、5.9cm²、6.0cm²、6.1cm²、6.2cm²、6.3cm²、6.4cm²、6.5cm²、6.6cm²、6.7cm²、6.8cm²、6.9cm²、7.0cm²、7.1cm²、7.2cm²、7.3cm²、7.4cm²、7.5cm²、7.6cm²、7.7cm²、7.8cm²、7.9cm²、8.0cm²、8.1cm²、8.2cm²、8.3cm²、8.4cm²、8.5cm²、8.6cm²、8.7cm²、8.8cm²、8.9cm²、9.0cm²、9.1cm²、9.2cm²、9.3cm²、9.4cm²、9.5cm²、9.6cm²、9.7cm²、9.8cm²、9.9cm²、10.0cm²、15.0cm²、20.0cm²、25.0cm²、30.0cm²、35.0cm²、40.0cm²、45.0cm²、50.0cm²、55.0cm²、60.0cm²、65.0cm²、70.0cm²、75.0cm²、80.0cm²、85.0cm²、90.0cm²、95.0cm²、100.0cm²。在一些实施方案中，该通孔还应当具有适当的深度以允许必要的溶液(例如，抗体溶液)填充该半密闭空间。在一些实施方案中，通孔的垂直深度为0.1cm-50cm，例如为0.1cm、0.2cm、0.3cm、0.4cm、0.5cm、0.6cm、0.7cm、0.8cm、0.9cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm、10cm、11cm、12cm、13cm、14cm、15cm、16cm、17cm、18cm、19cm、20cm、21cm、22cm、23cm、24cm、25cm、26cm、27cm、28cm、29cm、30cm、31cm、32cm、33cm、34cm、35cm、36cm、37cm、38cm、39cm、40cm、41cm、42cm、43cm、44cm、45cm、46cm、47cm、48cm、49cm、50cm。

用于本申请的检测部件的表面覆盖有固相载体。固相载体可以完全或部分地覆盖检测部件的上表面。当所述固相载体完全覆盖检测部件的上表面时，该检测部件也可以完全由固相载体组成。但是，考虑到成本以及制作便利性，优选地，检测部件自上而下包括相互紧密贴合的固相载体和支撑体，所述固相载体完全或部分地覆盖所述支撑体。更优选地，该固相载体完全覆盖该支撑体，即完全覆盖检测部件的上表面。

在一些优选实施方案中，固相载体为膜。在一些实施方案中，所述固相载体由包括硝酸纤维素、尼龙、pvdf、nytron、biodyne或porex的材料形成，例如硝酸纤维素膜、尼龙膜、pvdf膜、nytron膜、biodyne膜或pore膜。在一些实施方案中，位于半密闭空间的底部范围内的固相载体与该半密闭空间的底部之间的横截面积比为1:1-1:5，例如为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5。优选地，该横截面积比为1:1，以获得最佳检测灵敏度。

用于本申请的支撑体主要用于提高检测部件的强度和可加工性。固相载体通常为很薄的膜材料，强度低且难以进行进一步的加工处理。通过将固相载体与支撑体紧密贴合，可有效提高检测部件的稳定性。在一些优选实施方案中，支撑体由包括泡沫的材料形成，例如该支撑体为硬质泡沫。在一些优选实施方案中，固相载体与支撑体之间的紧密贴合通过粘合剂和/或热压和/或双面含胶的制品实现，以使固相载体完全或部分地覆盖支撑体，即完全或部分地覆盖检测部件的上表面。该双面含胶的制品可以是可商购的双面胶，也可以通过在制品(如膜、板等)的两面涂覆粘合剂获得。该双面含胶的制品的厚度并无特别限制，可以为0.01-5mm，优选为0.05-1mm，例如可以为0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm。

在一些优选实施方案中，检测部件的上表面还包括至少两个通过凹槽彼此隔开的子区域，至少一个半密闭空间的底部位于该子区域内。凹槽可以进一步地将半密闭空间部分地或完全地隔开。在这种情况下，即使有部分液体从半密闭空间的底部溢出，也会优先进入该凹槽中，而不会影响其他检测区(例如进入其它半密闭空间)，从而进一步提高装置的稳定性。优选地，子区域通过凹槽包围形成，以将位于该子区域内的半密闭空间完全地隔开。子区域的形状并无特别限制，例如可选自下组：圆形、非圆形、正方形、长方形、椭圆形及多角形。在一些实施方案中，至少两个半密闭空间的底部分别落入与之一一对应的通过凹槽包围形成的子区域内。最优选地，每个半密闭空间的底部分别落入与之一一对应的通过凹槽包围形成的子区域内，以实现最大通量。

在一些优选实施方案中，凹槽的深度应小于检测部件的厚度，以防止液体从检测部件的底部流出。在一些实施方案中，凹槽的深度为检测部件厚度的10％-90％，例如为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％。优选地，为了兼顾储液量以及强度稳定性，凹槽的深度为检测部件厚度的50％-80％。

在一些实施方案中，孔板与检测部件通过粘合剂贴合和/或通过硬质底托扣紧，以使通孔的下孔口与检测部件的上表面紧密贴合，进而形成半密闭空间。在一些优选实施方案中，硬质底托设置为敞口结构，其内沿紧贴所述孔板以及所述检测部件的外周，以使通孔的下孔口与检测部件的上表面紧密贴合。在一些优选实施方案中，该硬质底托由包括硬质塑料、木材或金属的材料形成。

在一些优选实施方案中，孔板和/或检测部件表面具有横坐标和/纵坐标刻度线，以便于操作者进行试验记录。

本申请的第二方面提供一种免疫印迹方法，其使用了本申请第一方面涉及的装置。

本申请的第三方面提供一种免疫印迹方法，包括：

(a)将蛋白质从样品转移至位于本申请第一方面涉及的半密闭空间底部范围内的固相载体上；

(b)将缓冲激活液加入该半密闭空间中；

(c)将一抗溶液加入该半封闭空间中；

(d)将二抗溶液加入该半封闭空间中；

(e)检测所述抗体溶液中的抗体与蛋白质的结合。

在一些实施方案中，可以在两个或两个以上的半密闭空间中，同时分析不同的样品。

在一些实施方案中，可以使用任何设备或方法将溶液加入到半密闭空间中，例如注入、泵入等。在一些实施方案中，使用注射针将溶液注入通道中。

用于本申请的溶液包括但不限于抗体溶液、激活溶液、封闭溶液、洗涤溶液等，尤其包括指定浓度的tween-20和牛血清白蛋白。在一些实施方案中，可以利用合适浓度的tween-20和牛血清白蛋白来获得最佳效果。在一些实施方案中，该溶液包含0.01％-5％的牛血清白蛋白，诸如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％。在一些实施方案中，溶液包含0.01％-5％的tween-20，诸如0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％。在一些优选实施方案中，溶液包含0.1％的牛血清白蛋白和0.1％的tween20。在一些实施方案中，溶液包含0.1％的牛血清白蛋白和0.1％的tween20。

在一些实施方案中，用于本申请的溶液还可包含适当的盐、缓冲剂、金属等。

在一些实施方案中，可以通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段检测结合靶蛋白的抗体。在一些实施方案中，以酶促方法进行检测，例如可以使用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，采用荧光检测。可用于本申请的荧光染料并无特别限制，可以采用本领域中常用的那些，例如alexa染料、amca、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、cy2、cy3、cy5、hex、6-joe、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、reg、罗丹明绿、罗丹明红、rox、tamra、tet、四甲基若丹明、德克萨斯红、瀑布蓝、6-fam、荧光素等。

本申请所用的一抗和二抗并无特别限定，只要能够特异性并稳定地结合靶标、分析物或抗原的任何抗体、抗体片段或其他分子即可，例如核酸、树枝状聚合物、亲和标签等。虽然在本申请中，通常使用抗体来定性分析样品中的蛋白质，但本发明不限于仅使用抗体。因此，应当将本申请的实施方案理解为还可包括其他结合分子。

优选实施例

下面结合说明书附图，进一步对本发明的优选实施例进行详细描述，以下的描述为示例性的，并非对本发明的限制，任何的其他类似情形也都落入本发明的保护范围之中。

在以下的具体描述中，方向性的术语，例如“上”、“下”等，参考附图中描述的方向使用。本发明的实施例的部件可被置于多种不同的方向，方向性的术语是用于示例的目的而非限制性的。

用于斑点免疫印迹的装置

如图1-8所示，本发明的装置1包括：

长方体孔板2(长16.0cm、宽10.2cm、高1.0cm)，该孔板上规则地横竖排列有96个通孔3(共8行、12列；相邻通孔在水平、垂直方向上均间隔0.4cm)，该通孔3的上孔口4和下孔口5均为相同尺寸的圆形(直径为0.7cm)；以及

位于该孔板2下方的长方体检测部件6(长16.0cm、宽10.2cm)，该检测部件6自上而下包括固相载体7(硝酸纤维素膜，长16.0cm、宽10.2cm、厚度300.0μm)和支撑体8(泡沫，长16.0cm、宽10.2cm、厚度0.5cm)，该固相载体7完全覆盖该支撑体8(不考虑凹槽部分)，且该固相载体7与该支撑体8之间通过双面胶9(长16.0cm、宽10.2cm、厚度0.01cm)紧密贴合，该检测部件6的上表面规则设置有96个正方形子区域10(长1.096cm、宽1.096cm；共8行、12列)，该子区域10通过凹槽11(刀刻得到，凹槽宽0.04cm、深0.3cm)包围形成且与孔板2上的通孔3在垂直方向上一一对应。通孔3与检测部件6紧密贴合，且其下孔口5完全落入该子区域10内；

位于检测部件下方的硬质塑料底托12，其设置为敞口结构，其内沿紧贴所述孔板2的外周，以将孔板2和检测部件6扣紧，从而使通孔3的下孔口5与检测部件6上表面的子区域10贴合，以在装置1中形成96个半密闭空间13；

孔板2和检测部件6的表面均具有横坐标和纵坐标刻度线。

斑点免疫印迹方法

将蛋白质样品点样在半密闭空间13底部的固相载体7上。然后，用注射器向半密闭空间13内注入0.1％的bsa和0.1％的tween-20tbs溶液，以激活硝酸纤维素膜。然后注入一抗溶液并孵育1小时。其中，一抗和二抗稀释液均在0.1％的bsa和0.1％的tween-20tbs溶液中制备。一抗孵育后，洗涤硝酸纤维素膜，并注入0.1％的bsa和0.1％的tween-20tbs溶液封闭1小时。去除该封闭液，再注入二抗溶液，1小时后，用碱性磷酸酶进行化学发光检测。

虽然以上描述了本发明的具体实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方案做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。