一种右佐匹克隆中杂质的检测方法与流程

本发明属于药物分析
技术领域：
，具体涉及一种右佐匹克隆中杂质的检测方法。
背景技术：
：右佐匹克隆(英文名：eszopiclone)化学名为(+)-6-(5-氯吡啶-2-基)-7-((4-甲基哌嗪-1-基)羰氧基)-5,6-二氢吡咯(3,4-b)吡嗪-5-酮，分子式为c17h17cin6o3，分子量为388.81，cas登录号:43200-80-2。其结构如式i所示；右佐匹克隆(eszopiclone)是由美国sepracor开发的快速短效非苯二氮类镇静安眠药，2005在美国上市，反响良好。其父药佐匹克隆目前也已在世界80多个国家和地区上市，属于临床上用于失眠类最多的药物之一。右佐匹克隆是佐匹克隆的单一异构体形式。单一异构体的开发是目前国内外药品研发的热点。临床前及临床研究表明本品对苯二氮受体的亲和力是左旋佐匹克隆的50倍，右佐匹克隆的ld50为左旋佐匹克隆的1/5。因此本品在其父药的基础上，不但增加的药品的活性，减少药品使用剂量，还能减少不良反应的产生，具有疗效强、毒性低等优势。通常以化合物6-(5-氯-2-吡啶基)-5h-吡咯并[3,4-b]吡嗪-5,7(6h)-二酮为起始原料，经还原、缩合、拆分等反应合成右佐匹克隆。在此合成工艺中会产生还原物、氨基吡啶、原料酮、开环还原物、佐匹克隆醇、哌嗪脲、氮氧化物、去甲基物、开环佐匹克隆等9个杂质。建立检测方法对这些杂质进行控制是十分必要的。需要建立检测右佐匹克隆中杂质且分离度符合标准的检测方法。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种右佐匹克隆中杂质的检测方法。本发明的技术方案概述如下：一种右佐匹克隆中杂质的检测方法，包括如下步骤：(1)取待测的右佐匹克隆样品，精密称定，加流动相超声，使待测的右佐匹克隆样品溶解，配成3-5mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取右佐匹克隆标准品，精密称定，加流动相超声,使右佐匹克隆标准品溶解，配成3-5μg/ml的溶液，作为对照品溶液；另取右佐匹克隆标准品和杂质标准品，精密称定，加流动相超声，使标准品和杂质标准品溶解，配成右佐匹克隆标准品浓度为0.3-0.5mg/ml、每个杂质标准品均为0.03-0.05mg/ml的溶液，作为系统适应性溶液；另取杂质标准品，精密称定，加流动相超声，使杂质标准品溶解，配成浓度为0.03-0.05mg/ml的溶液，作为杂质定位溶液；所述流动相为：按体积比为51：49的比例，将流动相a和乙腈混合，所述流动相a用下述方法制成：取十二烷基硫酸钠6.5-9.5g与磷酸二氢钠1.0-2.2g，溶解于1000ml水中，用10％磷酸调节ph至3.95-4.05；(2)使用高效液相色谱仪，用十八烷基键合硅胶为填充剂，其中：所采用的色谱柱为glsciencesinertsilods-3v，4.6mm×250mm，5.0μm；流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长为220nm；取对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6针，相对标准偏差不得大于5.0％；取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，所述杂质和右佐匹克隆分离度应大于1.5；取杂质定位溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，通过杂质的保留时间，来判断系统适用性溶液色谱图中杂质的归属，可以得出已知杂质的出峰顺序、保留时间和相对保留时间；取供试品溶液和对照品溶液各20μl，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图,采集时间为主成分峰保留时间的2倍；根据杂质的归属，来确认供试品溶液中各杂质峰的归属，按照外标法计算各杂质质量含量和杂质质量含量的总和，杂质质量含量＝(ru/rs)×(cs/cu)×(1/fi)×100％；其中：ru为供试品溶液中杂质的响应值或峰面积；rs为对照品溶液中右佐匹克隆的响应值或峰面积；cs为对照品溶液右佐匹克隆的浓度mg/ml；cu为供试品溶液中右佐匹克隆的浓度mg/ml；fi为对应杂质峰的相对校正因子；fi为fa、fb、fc、fd、fe、ff、fg、fh和fi中至少一种；相对校正因子fa＝0.94、fb＝2.14、fc＝2.76、fd＝1.22、fe＝1.60、ff＝3.18、fg＝1.42、fh＝2.48、fi＝0.79；杂质质量含量的总和等于各杂质质量含量之和。所述杂质为杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h和杂质i中至少一种。本发明的优点：本发明的方法实现了右佐匹克隆中杂质的快速准确测定，具有较高的灵敏度和专属性，操作简捷，分离度符合标准(即，主峰与杂质分离度均大于1.50)，本发明的方法可用于右佐匹克隆的质量控制，并为此类化合物的研究开发及质量检测奠定了基础。附图说明图1是实施例4中系统适应性溶液的液相色谱图；具体实施方式相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。r越大，表明相邻两组分分离越好。一般说当r＜1时，两峰有部分重叠；当r＝1.0时，分离度可达98％；当r＝1.5时，分离度可达99.7％。通常用r＝1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。当r＝1时，称为4σ分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4％，内侧峰基重叠约2％。r＝1.5时，称为6σ分离，裸露峰面积为99.7％。r≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定r应大于1.5。分离度计算公式：r＝2(tr2-tr1)/(w1+w2)。杂质a：cas号43200-96-0；英文化学名：6-(5-chloro-2-pyridyl)-5h-pyrrolo[3,4-b]pyrazine-5,7(6h)-dione；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。杂质b：cas号43200-81-3；英文化学名：6-(5-chloro-2-pyridinyl)-6,7-dihydro-7-hydroxy-5h-pyrrolo[3,4-b]pyrazin-5-one；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。杂质c：cas号148891-53-6；英文化学名：6-(5-chloropyridin-2-yl)-6,7-dihydro-5hpyrrolo[3,4-b]pyrazin-5–one；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。杂质d：cas号300701-71-7；英文化学名：1-piperazinecarboxylicacid,(5s)-6-(5-chloro-2-pyridinyl)-6,7-dihydro-7-oxo-5h-pyrrolo[3,4-b]pyrazin-5-ylester,hydrochloride(1:1)；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。杂质e：cas号1072-98-6；英文化学名：2-amino-5-chloro-pyridine；来源：上海中乃生物医药科技有限公司。杂质f：cas号43200-82-4；英文化学名：6-(5-chloro-2-pyridyl)-5h-pyrrolo[3,4-b]pyrazine-5,7(6h)-dione；来源：上海中乃生物医药科技有限公司。杂质g：化学名为(3-((5-氯吡啶-2-基)氨基甲酰)吡嗪-2-基)甲基-4-甲基哌嗪-1-羧酸酯；英文化学名：(3-((5-chloropyridin-2-yl)carbamoyl)pyrazin-2-yl)methyl4-methylpiperazine-1-carboxylate；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。杂质h：cas号1122549-43-2英文化学名：n-(5-chloro-2-pyridinyl)-3-(hydroxymethyl)-2-pyrazinecarboxamide；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。杂质i：cas号：4180-30-7；英文化学名：piperazine,1-methyl-4-4[(4-methyl-1-piperazinyl)caronyl]-(9cl)；来源：深圳菲斯生物科技有限公司。fi为杂质峰的相对校正因子。使用该分析方法，分别测定3ng-50ug/ml浓度范围内至少5个浓度的杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i和右佐匹克隆的对照品溶液，测得对应峰的响应值或峰面积，分别用最小二乘法进行线性回归，计算得出各化合物浓度-响应值的线性回归方程，参考表1。此f值为参考值，当方法参数调整时，此值会有波动，需重新进行线性考察和校正因子的计算。fi＝ki/k右佐匹克隆其中：ki为对应杂质的线性系数；fi为对应杂质的校正因子；k右佐匹克隆为右佐匹克隆的线性系数；通过计算，依次可以得出各杂质的校正因子。表1已知化合物的线性数据表下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。高效液相色谱法分离测定右佐匹克隆中还原物、氨基吡啶、原料酮、开环还原物、佐匹克隆醇、哌嗪脲、氮氧化物、去甲基物、开环佐匹克隆等9个杂质的方法，可用于右佐匹克隆的制备过程和最终产品的质量控制。实施例1右佐匹克隆中杂质b的检测方法，包括如下步骤：(1)取含有杂质b的右佐匹克隆样品适量，精密称定，加流动相超声，使待测的右佐匹克隆样品溶解，配成4mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取右佐匹克隆标准品，精密称定，加流动相超声,使右佐匹克隆标准品溶解，配成4μg/ml的溶液，作为对照品溶液；另取右佐匹克隆标准品和杂质b标准品，精密称定，加流动相超声，使标准品和杂质b标准品溶解，配成右佐匹克隆标准品浓度为0.4mg/ml、杂质b标准品为0.04mg/ml的溶液，作为系统适应性溶液；另取杂质b标准品，精密称定，加流动相超声，使杂质b标准品溶解，配成浓度为0.04mg/ml的溶液，作为杂质b定位溶液；所述流动相为：按体积比为51：49的比例，将流动相a和乙腈混合，所述流动相a用下述方法制成：取十二烷基硫酸钠8.1g与磷酸二氢钠1.6g，溶解于1000ml水中，用10％磷酸调节ph至4.00；(2)使用高效液相色谱仪，用十八烷基键合硅胶为填充剂，其中：所采用的色谱柱为glsciencesinertsilods-3v，4.6mm×250mm，5.0μm；流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长为220nm；表2：实施例1色谱图提供信息摘要取对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图，相对标准偏差不得大于5.0％；实际测定数据见表3，右佐匹克隆的平均保留时间为14.127min，右佐匹克隆6针的平均峰面积为158286，rsd％为0.38％，符合要求。表3实施例1对照品溶液数据信息序号右佐匹克隆的峰面积右佐匹克隆的保留时间115857514.121min215860314.129min315780214.135min415842914.128min515734614.121min615896314.125min平均值15828614.127minrsd％0.38％0.03％取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，所述杂质b和右佐匹克隆分离度应大于1.5；色图谱显示得到两个色谱峰，保留时间分别为5.290min和14.141min，分离度为14.1，表明两峰完全分离，符合要求。取杂质b定位溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，色图谱显示杂质b的保留时间为5.285min；结合对照溶液中右佐匹克隆的保留时间为14.127min来判断系统适用性溶液色谱图中5.290min的峰为杂质b，14.141min的峰为右佐匹克隆，出峰顺序为杂质b、右佐匹克隆；相对保留时间为5.290/14.127＝0.37。取供试品溶液和对照品溶液各20μl，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图,采集时间为主成分峰保留时间的2倍；根据杂质b的归属，来确认供试品溶液中5.288min的峰为杂质b，杂质b的峰面积为3389860按照外标法计算杂质b质量含量，杂质质量含量＝(ru/rs)×(cs/cu)×(1/fi)×100％；其中：ru为供试品溶液中杂质的响应值或峰面积；rs为对照品溶液中右佐匹克隆的响应值或峰面积；cs为对照品溶液右佐匹克隆的浓度mg/ml；cu为供试品溶液中右佐匹克隆的浓度mg/ml；fi为对应杂质峰的相对校正因子，即fi＝fb＝2.14；根据公式，杂质b的质量含量＝(338986/158286)×(0.004mg/ml/4.012mg/ml)×(1/2.14)*100％＝0.10％实施例2右佐匹克隆中杂质c的检测方法，包括如下步骤：(1)取待测的含有杂质c的右佐匹克隆样品，精密称定，加流动相超声，使待测的右佐匹克隆样品溶解，配成3mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取右佐匹克隆标准品，精密称定，加流动相超声,使右佐匹克隆标准品溶解，配成3μg/ml的溶液，作为对照品溶液；另取右佐匹克隆标准品和杂质c标准品，精密称定，加流动相超声，使标准品和杂质c标准品溶解，配成右佐匹克隆标准品浓度为0.3mg/ml、杂质c标准品均为0.03mg/ml的溶液，作为系统适应性溶液；另取杂质c标准品，精密称定，加流动相超声，使杂质c标准品溶解，配成浓度为0.03mg/ml的溶液，作为杂质c定位溶液；所述流动相为：按体积比为51：49的比例，将流动相a和乙腈混合，所述流动相a用下述方法制成：取十二烷基硫酸钠6.5g与磷酸二氢钠1.0g，溶解于1000ml水中，用10％磷酸调节ph至3.95；(2)使用高效液相色谱仪，用十八烷基键合硅胶为填充剂，其中：所采用的色谱柱为glsciencesinertsilods-3v，4.6mm×250mm，5.0μm；流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长为220nm；表4：实施例2色谱图提供信息摘要取对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图，相对标准偏差不得大于5.0％；实际测定数据见表5，右佐匹克隆的平均保留时间为14.124min，右佐匹克隆6针的平均峰面积为118620，rsd％为0.32％，符合要求。表5实施例2对照品溶液数据信息序号右佐匹克隆的峰面积右佐匹克隆的保留时间111894014.122min211895214.121min311835014.128min411882914.125min511801014.119min611863814.130min平均值11862014.124minrsd％0.32％0.03％取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，所述杂质c和右佐匹克隆分离度应大于1.5；色图谱显示得到两个色谱峰，保留时间分别为7.701min和14.138min，分离度为10.3，表明两峰完全分离，符合要求。取杂质c定位溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，色图谱显示杂质c的保留时间为7.729min；结合对照溶液中右佐匹克隆的保留时间为14.129min来判断系统适用性溶液色谱图中7.701min的峰为杂质c，14.138min的峰为右佐匹克隆，出峰顺序为杂质c、右佐匹克隆；相对保留时间为7.701/14.138＝0.55。取供试品溶液和对照品溶液各20μl，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图,采集时间为主成分峰保留时间的2倍；根据杂质c的归属，来确认供试品溶液中7.703min的峰为杂质c，杂质c的峰面积为329721按照外标法计算杂质c质量含量，杂质c的质量含量＝(ru/rs)×(cs/cu)×(1/fi)×100％；其中：ru为供试品溶液中杂质的响应值或峰面积；rs为对照品溶液中右佐匹克隆的响应值或峰面积；cs为对照品溶液右佐匹克隆的浓度mg/ml；cu为供试品溶液中右佐匹克隆的浓度mg/ml；fi为对应杂质峰的相对校正因子，即fi＝fc＝2.76；根据公式，杂质c的质量含量＝(329721/118620)×(0.003mg/ml/3.018mg/ml)×(1/2.76)*100％＝0.10％。实施例3右佐匹克隆中杂质b和杂质c的检测方法，包括如下步骤：(1)取待测的取含有杂质b和杂质c的右佐匹克隆样品，精密称定，加流动相超声，使待测的右佐匹克隆样品溶解，配成5mg/ml的溶液，作为供试品溶液；另取右佐匹克隆标准品，精密称定，加流动相超声,使右佐匹克隆标准品溶解，配成5μg/ml的溶液，作为对照品溶液；另取右佐匹克隆标准品、杂质b和杂质c标准品，精密称定，加流动相超声，使标准品和杂质标准品溶解，配成右佐匹克隆标准品浓度为0.5mg/ml、每个杂质标准品均为0.05mg/ml的溶液，作为系统适应性溶液；另取杂质b标准品，精密称定，加流动相超声，使杂质标准品溶解，配成浓度为0.05mg/ml的溶液，作为杂质b定位溶液；另取杂质c标准品，精密称定，加流动相超声，使杂质标准品溶解，配成浓度为0.05mg/ml的溶液，作为杂质c定位溶液；所述流动相为：按体积比为51：49的比例，将流动相a和乙腈混合，所述流动相a用下述方法制成：取十二烷基硫酸钠9.5g与磷酸二氢钠2.2g，溶解于1000ml水中，用10％磷酸调节ph至4.05；(2)使用高效液相色谱仪，用十八烷基键合硅胶为填充剂，其中：所采用的色谱柱为glsciencesinertsilods-3v，4.6mm×250mm，5.0μm；流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长为220nm；表6：实施例3色谱图提供信息摘要取对照品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图，相对标准偏差不得大于5.0％；实际测定数据见表7，右佐匹克隆的平均保留时间为14.151min，右佐匹克隆6针的平均峰面积为197947，rsd％为0.41％，符合要求。表7实施例3对照品溶液数据信息序号右佐匹克隆的峰面积右佐匹克隆的保留时间119673314.153min219725614.148min319886814.149min419824314.154min519795014.152min619862914.152min平均值19794714.151minrsd％0.41％0.02％取系统适用性溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，所述杂质b、杂质c和右佐匹克隆相邻两峰间分离度均应大于1.5；色图谱显示得到三个色谱峰，保留时间分别为5.288min、7.689min和14.133min，相邻峰分离度为9.6和10.1，表明完全分离，符合要求。取杂质b定位溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，色图谱显示杂质b的保留时间为5.299min；取杂质c定位溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，色图谱显示杂质c的保留时间为7.729min；结合对照溶液中右佐匹克隆的保留时间为14.151min来判断系统适用性溶液色谱图中5.288min的峰为杂质b，7.689min的峰为杂质c，14.133min的峰为右佐匹克隆，出峰顺序为杂质b、杂质c、右佐匹克隆；杂质b的相对保留时间为5.288/14.133＝0.37，杂质c的相对保留时间为7.689/14.133＝0.54。取供试品溶液和对照品溶液各20μl，依次注入高效液相色谱仪，记录色谱图,采集时间为主成分峰保留时间的2倍；根据杂质b、杂质c的归属，来确认供试品溶液中5.292min的峰为杂质b，峰面积为423745；7.704min的峰为杂质c，杂质c的峰面积为532688；按照外标法计算杂质b质量含量、杂质c质量含量和杂质含量总和。杂质的质量含量＝(ru/rs)×(cs/cu)×(1/fi)×100％；其中：ru为供试品溶液中杂质的响应值或峰面积；rs为对照品溶液中右佐匹克隆的响应值或峰面积；cs为对照品溶液右佐匹克隆的浓度mg/ml；cu为供试品溶液中右佐匹克隆的浓度mg/ml；fi为对应杂质峰的相对校正因子，即fi为fb时相对校正因子fi＝fb＝2.14，fi为fc时相对校正因子fi＝fc＝2.76；根据公式，杂质b的质量含量＝(423745/197947)×(0.005mg/ml/5.011mg/ml)×(1/2.14)*100％＝0.10％杂质c的质量含量＝(532688/197947)×(0.005mg/ml/5.011mg/ml)×(1/2.76)*100％＝0.10％杂质质量含量的总和＝杂质b的质量含量+杂质c的质量含量＝0.10％+0.10％＝0.20％实施例4此方法的专属性考察实验，包括如下步骤：(1)取右佐匹克隆标准品、杂质a、杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h和杂质i标准品，精密称定，加流动相超声，使标准品和杂质标准品溶解，配成右佐匹克隆标准品浓度为0.4mg/ml、每个杂质标准品均为0.04mg/ml的溶液，作为系统适应性溶液；另取右佐匹克隆和各杂质标准品，分别精密称定，加流动相超声，使杂质标准品溶解，配成浓度为0.04mg/ml的溶液，作为杂质定位溶液；所述流动相为：按体积比为51：49的比例，将流动相a和乙腈混合，所述流动相a用下述方法制成：取十二烷基硫酸钠8.1g与磷酸二氢钠1.6g，溶解于1000ml水中，用10％磷酸调节ph至4.00；(2)使用高效液相色谱仪，用十八烷基键合硅胶为填充剂，其中：所采用的色谱柱为glsciencesinertsilods-3v，4.6mm×250mm，5.0μm；流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长为220nm；表8：实施例4色谱图提供信息摘要参考实施例1、实施例2、实施例3的分析方法，根据表8的数据，可以对9个已知杂质和右佐匹克隆进行归属定位，相邻峰的分离度均大于1.5，证明该方法有较好的分离度和杂质区分能力；对于含有该9个杂质中至少一种的右佐匹克隆样品，均可以有效测定杂质含量和杂质含量总和。当前第1页12