基于多克隆抗体制备的HDL3免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法与流程

本发明属于免疫学测定分析领域，涉及蛋白质的测量测试，尤其涉及一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒及其制备使用方法。
背景技术：
：高密度脂蛋白3(high-densitylipoprotein3，hdl3)是高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein，hdl)的亚组分之一。hdl是血浆中主要脂蛋白之一，其密度最高，颗粒直径最小，蛋白组成以载脂蛋白为主，有hdl1、hdl2和hdl33种亚型。人类hdl颗粒大小为7.2-12.9nm，水合密度介于(1.063-1.210)g/ml之间，相对分子质量为200-400kd。hdl3的密度为1.125g/ml-1.210g/ml。hdl主要由肝脏产生，而且主要又是由肝脏分解，小肠亦可合成。首先apoa-i初步酯化，在lpl介导的脂解作用下，从cm、vldl获得载脂蛋白，形成盘状新生hdl。新生hdl在lcat的作用下先转变为hdl3，然后酯化胆固醇继续增加，逐步变为密度较小、颗粒较大的hdl2。hdl的重要生理功能是介导胆固醇逆转运，还为其他脂蛋白提供多种必需成分，具有抗动脉粥样硬化和血管保护作用，可减少心血管事件的发生。流行病学调查显示，血浆hdl-c水平与动脉粥样硬化等心血管疾病的危险性呈高度负相关。hdl-c可对抗由血脂代谢紊乱引起的心血管疾病，升高hdl-c有可能成为冠心病防治的有效措施。且有报道动物实验证明，hdl中起作用的亚组分为hdl3，而hdl2在调节血脂(及逆向胆固醇转运)方面并没有可观测到的作用。所以，hdl3可以用作心血管疾病的治疗剂，也可以用于心血管疾病、糖尿病、肾脏疾病的检测标志物。抗体是由抗原刺激机体，产生的免疫球蛋白。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个b淋巴细胞接受该抗原刺激所产生的抗体称之为单克隆抗体(monocloneantibody)。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样一种抗原决定簇，也可刺激机体产生igg、igm、iga、ige和igd等五类抗体。免疫比浊法(turbidimetricinhibitionimmunoassay)是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂的作用下，自液相析出，形成微粒，使反应液出现浊度；当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。目前，高密度脂蛋白亚组分测定的方法有：超速离心法、高效液相色谱(hplc)法、沉淀法、核磁共振波谱(nmr)法等。其中，超速离心法通过离心，并利用脂蛋白的比重之差来进行分型；其缺点很明显：操作技术要求高、成本高、耗时长。冈崎等人提出的利用hplc来区分hdl2和hdl3的方法也存在上述问题。沉淀法为通过含有2价金属离子和硫酸葡聚糖的试剂将hdl3以外聚集，通过离心来回收上清液部分的hdl3并用自动分析装置进行测定的方法；其仍然存在下述缺点：作业需要熟练，另外需要手工操作，有时需要检样的前处理操作，耗时过长，且非通用。nmr法为通过磁共振来测定脂蛋白的颗粒数，非一般性的方法，需要有特定的设备和相应的技术人员。日本某公司专利(国内公开号为cn104169432a)公开了一种高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法，用酶促反应法通过检测hdl3中胆固醇来间接检测hdl3的含量。该方法同市场上众多的高密度脂蛋白胆固醇检测方法一样，通过苯醌亚胺络合物显色。但此方法具有以下缺陷：①无法对高密度脂蛋白胆固醇亚型进行鉴别；②易受血清中血红蛋白、胆红素及甘油三酯的影响。其虽然通过采用特异性识别hdl3-c的表面活性剂来对其他脂蛋白组分进行遮蔽，提高了鉴别的特异性，但其无法避免血清中高血红蛋白、胆红素及甘油三酯的影响，且由于遮蔽hdl3-c，血清中游离胆固醇的影响就更加凸显，由此造成r1试剂的使用量加大，检测的重复性不高。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于提供一种能直接测定hdl3含量的基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒及其制备、使用方法，直接测定蛋白含量，不需要通过胆固醇的测定来间接反映hdl3的含量，测试结果可靠，重复性高。本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂r1：其溶剂为纯化水；其溶剂为纯化水。作为本发明的优选方式之一，还包括hdl3校准品，包括的成分及相应含量为：其溶剂为纯化水。作为本发明的优选方式之一，所述polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative由一种或几种hbl值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物构成。作为本发明的优选方式之一，所述hbl值13.0-14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物具体为花王公司产品emulgenb-66、emulgena-90或日光化学公司产品nikkolbc-10。作为本发明的优选方式之一，所述polyoxyethylenepolycyclicphenylether由一种或几种hbl值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚构成。作为本发明的优选方式之一，所述hbl值15.0-15.6的聚氧乙烯多环苯基醚具体为日光化学公司产品nikkolbc-15、nikkolbo-15v或nikkolbd-10。作为本发明的优选方式之一，所述鸡抗人hdl3多克隆抗体的获取方法如下：①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1ml2.0mg/mlhdl3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2ml乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2ml1.0mg/mlhdl3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上,终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血；②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；加入等体积的pbs混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200ml的pbs溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件下离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200ml的pbs溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200ml的pbs溶解，并进一步装入10kd透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的pbs透析液透析6h除盐，即得鸡抗人hdl3多克隆抗体。作为本发明的优选方式之一，所述hdl3的获取方法如下：①hdl分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、mgcl2·6h2o105g、nan3250mg，并用900ml的蒸馏水溶解，然后用1mol/l的naoh液调节ph至7.0，最后用蒸馏水加至1000ml，备用；②hdl3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、mgcl2·6h2o315g、nan3250mg，并用900ml蒸馏水溶解，接着用1mol/l的naoh调节ph至7.0，最后用蒸馏水加至1000ml，备用；③分离：吸取人血清50ml，加hdl分离液5ml，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20ml，并加入hdl3分离液2ml，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为hdl3产物；④浓度标定：用tris-hcl缓冲液稀释hdl3产物，使用微量定量仪标定到10mg/ml，备用。一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：(1)制备人hdl3：①hdl分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、mgcl2·6h2o105g、nan3250mg，并用900ml的蒸馏水溶解，然后用1mol/l的naoh液调节ph至7.0，最后用蒸馏水加至1000ml，备用；②hdl3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、mgcl2·6h2o315g、nan3250mg，并用900ml蒸馏水溶解，接着用1mol/l的naoh调节ph至7.0，最后用蒸馏水加至1000ml，备用；③分离：吸取人血清50ml，加hdl分离液5ml，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20ml，并加入hdl3分离液2ml，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为hdl3产物；④浓度标定：用tris-hcl缓冲液稀释hdl3产物，使用微量定量仪标定到10mg/ml，备用；(2)制备鸡抗人hdl3多克隆抗体：①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1ml2.0mg/mlhdl3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2ml乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2ml1.0mg/mlhdl3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血；②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；接着，加入等体积的pbs混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200ml的pbs溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200ml的pbs溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200ml的pbs溶解，并进一步装入10kd透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的pbs透析液透析6h除盐，即得鸡抗人hdl3多克隆抗体；(3)配制试剂r1：按照试剂r1的组分含量，将步骤(2)制得的鸡抗人hdl3多克隆抗体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1；(4)配制试剂r2：按照试剂r2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2。作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中还包括“多克隆抗体的验证”，具体验证方法为：使用步骤(1)中制备的hdl3为抗原，使用abcam公司山羊多克隆抗体toapoa1bp为阳性对照，以hdl3蛋白为检测抗原，使用琼脂双扩散法验证纯化后鸡抗人hdl3多克隆抗体的特异性及效价。一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：(1)吸取2μl样本，加入150μl试剂r1，37℃孵育5min；(2)再加入50μl试剂r2进行混合，并使其充分反应；(3)1min后读取吸光值a1，3min后读取吸光值a2，计算δa；(4)定标方法：6点定标；采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0μg/ml、11.8μg/ml、46.9μg/ml、187.5μg/ml、375μg/ml、1500μg/ml；(5)依据定标值，根据δa测算样本中hdl3含量。检测原理：目前，国内外没有直接检测hdl3的试剂盒，通常是通过检测hdl3胆固醇来间接反应蛋白的量；该方法存在诸多弊端，且血脂中胆固醇的量不能够代替脂蛋白的量，其在分子结构上非特定的比例是动态变化的。本发明提供的基于多克隆抗体直接检测hdl3的免疫比浊法试剂盒，其通过表面活性剂(polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative)与hdl3特异性结合生成胶束结构从而达到屏蔽hdl3的目的，而试剂r1中的抗体(鸡抗人hdl3多克隆抗体)先与血清中的其他脂蛋白反应获得吸光度1；加入r2后，r2所含的增溶剂(polyoxyethylenepolycyclicphenylether)可以解除表面活性剂(polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative)与hdl3所形成的胶束，释放hdl3，试剂中过量的抗体再与hdl3反应，获得吸光度2；接着，通过吸光度差与标准品比对，即可从血清或血浆中直接检测hdl3的量，且不受高血红蛋白、胆红素及甘油三酯的干扰。本发明相比现有技术的优点在于：(1)本发明试剂盒由多克隆抗体(鸡抗人hdl3多克隆抗体)、表面活性剂(polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative)、促聚剂(peg6000)、缓冲液(tris-hcl)、防腐剂(nan3)、增溶剂(polyoxyethylenepolycyclicphenylether)、蛋白保护剂(bsa)等构成，可直接测得血清或血浆中hdl3的含量，且不受高血红蛋白、胆红素及甘油三酯的干扰；相对于间接测定的试剂盒而言，本发明试剂盒中加入了抗干扰蛋白和表面活性剂，具有更高的抗干扰能力，以保证试剂盒的稳定性和精密度；(2)本发明试剂盒基于免疫透射比浊法，适用于各类全自动生化分析仪分析；其使用方便、成本低廉，且自动化程度高，可大大节省检测时间；同时，相比于同类产品，本发明试剂盒具有更好地稳定性。附图说明图1是实施例4中从abcam公司购入羊抗人apoa1bp作为阳性对照琼脂双扩散试验12h结果图(图中，孔1：hdl3抗原，10mg/ml，加入10μl；孔2：apoa1bp1：4稀释后加入10μl；孔3：apoa1bp1：8稀释后加入10μl；孔4：apoa1bp1：16稀释后加入10μl；孔5：apoa1bp1：32稀释后加入10μl；孔6：apoa1bp1：64稀释后加入10μl；孔7：缓冲液对照)；图2是实施例4中纯化后的鸡抗人hdl3多克隆抗体琼脂双扩散试验12h结果图(图中，孔1：hdl3抗原，10mg/ml，加入10μl；孔2：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：4稀释后加入10μl；孔3：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：8稀释后加入10μl；孔4：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：16稀释后加入10μl；孔5：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：32稀释后加入10μl；孔6：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：64稀释后加入10μl；孔7：缓冲液对照)；图3是实施例6中本发明试剂盒与离心法线性关系曲线图；图4是实施例6中本发明试剂盒线性范围线性回归图。具体实施方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1本实施例的一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂r1：其溶剂为纯化水；试剂r2：其溶剂为纯化水。此外，所述试剂盒中还附带有hdl3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：其溶剂为纯化水。进一步地，所述polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative具体为花王公司产品emulgenb-66。进一步地，所述polyoxyethylenepolycyclicphenylether具体为日光化学公司产品nikkolbc-15。实施例2本实施例的一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂r1：其溶剂为纯化水；试剂r2：其溶剂为纯化水。此外，所述试剂盒中还附带有hdl3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：其溶剂为纯化水。进一步地，所述polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative具体为日光化学公司产品nikkolbc-10。进一步地，所述polyoxyethylenepolycyclicphenylether具体为日光化学公司产品nikkolbd-10。实施例3本实施例的一种基于多克隆抗体制备的hdl3免疫比浊法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂r1：其溶剂为纯化水；试剂r2：其溶剂为纯化水。此外，所述试剂盒中还附带有hdl3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：其溶剂为纯化水。进一步地，所述polyoxyethylenestyrenatedphenyletherderivative具体为花王公司产品emulgenb-66、emulgena-90和日光化学公司产品nikkolbc-10的混合物。进一步地，所述polyoxyethylenepolycyclicphenylether具体为日光化学公司产品nikkolbc-15、nikkolbo-15v和nikkolbd-10的混合物。实施例4本实施例的一种上述实施例中检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：(1)制备人hdl3：①hdl分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、mgcl2·6h2o105g、nan3250mg，并用900ml的蒸馏水溶解，然后用1mol/l的naoh液调节ph至7.0，最后用蒸馏水加至1000ml，备用；②hdl3分离液的配制：称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、mgcl2·6h2o315g、nan3250mg，并用900ml蒸馏水溶解，接着用1mol/l的naoh调节ph至7.0，最后用蒸馏水加至1000ml，备用；③分离：吸取人血清50ml(来自于健康捐献者)，加hdl分离液5ml，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min离心条件下离心20min；取上清液20ml，并加入hdl3分离液2ml，混匀；接着，室温静置15min后，再于2000r/min离心条件下离心20min，此上清即为hdl3产物；④浓度标定：用tris-hcl缓冲液稀释hdl3产物，使用微量定量仪标定到10mg/ml，备用。(2)制备鸡抗人hdl3多克隆抗体：①鸡的免疫：选择30日龄、体重400g以上公鸡，取1ml2.0mg/mlhdl3抗原与等量弗氏佐剂充分匀浆形成稳定乳液，记为乳化抗原；每只鸡于脖外侧注射共2ml乳化抗原；7日后进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后进行第四次免疫，采用翅静脉注射2ml1.0mg/mlhdl3抗原；49日取翅静脉血分离血清，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用心脏无菌采血法获得全血；②多克隆抗体的纯化：将上述步骤获得的全血于室温划十字口静置1h，再取上清获得粗制血清，粗制血清于4℃、1000r/min的条件下离心30min，得血清；接着，加入等体积的pbs混匀得混合液，并向混合液中缓慢滴加同等体积的饱和硫酸铵，4℃静置5h；接着，于4℃、4500r/min条件下离心30min，弃去上清，沉淀用200ml的pbs溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，再于4℃、4500r/min条件离心30min；此时，弃去上清，并将沉淀用200ml的pbs溶解，加入总体积量33％的饱和硫酸铵，4℃下静置5h后，4℃、4500r/min离心30min；离心后的沉淀再用200ml的pbs溶解，并进一步装入10kd透析袋中；最后，将其置于4℃环境下，采用20倍体积的pbs透析液透析6h除盐，即得鸡抗人hdl3多克隆抗体；③多克隆抗体的验证：使用上述制备的hdl3为抗原，使用abcam公司山羊多克隆抗体toapoa1bp(ab81907)为阳性对照，以上述hdl3蛋白为检测抗原，使用琼脂双扩散法验证多抗特异性及效价，验证结果见图1、图2；图1为从abcam公司购入羊抗人apoa1bp作为阳性对照琼脂双扩散试验12h结果图(图1中，孔1：hdl3抗原，10mg/ml，加入10μl；孔2：apoa1bp1：4稀释后加入10μl；孔3：apoa1bp1：8稀释后加入10μl；孔4：apoa1bp1：16稀释后加入10μl；孔5：apoa1bp1：32稀释后加入10μl；孔6：apoa1bp1：64稀释后加入10μl；孔7：缓冲液对照)；从图1中可以看出明显的免疫沉淀线，表明对照设置成立；图2为纯化后的鸡抗人hdl3多克隆抗体琼脂双扩散试验12h结果图(图2中，孔1：hdl3抗原，10mg/ml，加入10μl；孔2：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：4稀释后加入10μl；孔3：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：8稀释后加入10μl；孔4：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：16稀释后加入10μl；孔5：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：32稀释后加入10μl；孔6：纯化后的鸡抗人hdl3血清1：64稀释后加入10μl；孔7：缓冲液对照)；从图2中可以看出明显的免疫融合型免疫沉淀线，效价达到1：32，效价较高。与图1综合比较可知，所得的鸡免疫血清含有同apoa1bp相似的抗体，由于apoa1bp为高密度脂蛋白的蛋白组成部分，判定所得抗血清为鸡抗hdl3阳性血清。(3)配制试剂r1：按照上述实施例中试剂r1的组分含量，将步骤(2)制得的鸡抗人hdl3多克隆抗体以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r1。(4)配制试剂r2：按照上述实施例中试剂r2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂r2。(5)配制hdl3校准品：按照上述实施例中试剂hdl3校准品的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得hdl3校准品。实施例5本实施例的一种上述实施例中检测试剂盒的使用方法：分析方法：两点终点法；反应方向：上升反应；校准方式：logit-log(4p)；测定波长：340nm/700nm；测定温度：37℃；样本：试剂r1：试剂r2＝2：150：50(μl)；使用步骤：吸取2μl样本，加入150μl试剂r1，37℃孵育5min；再加入50μl试剂r2进行混合，并使其充分反应；1min后读取吸光值a1，3min后读取吸光值a2，计算δa。定标方法：6点定标，采用贝克曼au680全自动生化分析仪(或其他品牌型号)进行检测，并设置校准品浓度分别为：0μg/ml、11.8μg/ml、46.9μg/ml、187.5μg/ml、375μg/ml、1500μg/ml；依据定标值，根据δa测算样本中hdl3含量。检测原理：本发明试剂盒通过表面活性剂与hdl3特异性结合生成胶束结构从而达到屏蔽hdl3的目的，而试剂r1中的抗体先与血清中的其他脂蛋白反应获得吸光度1；加入r2后，r2所含的增溶剂可以解除表面活性剂与hdl3所形成的胶束，释放hdl3，试剂中过量的抗体再与hdl3反应，获得吸光度2；接着，通过吸光度差与标准品比对，即可从血清或血浆中直接检测hdl3的量。实施例6本实施例用以评价上述实施例中hdl3免疫比浊试剂盒：(1)线性相关性验证：利用实施例1-3配方配制试剂，并与超速离心方法进行对照检测，检测30份临床血清样本，检测结果如表1所示，获得了本发明试剂盒与超速离心方法的相关性曲线(见图3)。通过检测结果显示，两试剂盒的线性相关曲线为y＝2.2396+0.9549x，相关系数r2＝0.97004，说明两者具有较大的相关性。表1本发明试剂盒与离心法相关性比对值序号测试值对照值序号测试值对照值序号测试值对照值125.426.61126.527.52127.529.1228.529.31234.235.62228.829.5333.634.11328.527.92331.231.5424.325.61431.632.32433.634.4526.9271529.931.52529.330.6627.829.21629.830.92633.334.2730.2311738.538.72733.534.3833.633.91833.934.22827.428930.131.41932.733.52928.8311028.728.72025.326.93035.536.7(2)线性范围验证：使用重组hdl3纯化品和生理盐水配制成浓度400mg/l、200mg/l、100mg/l、50mg/l、25mg/l、12.5mg/l、6.25mg/l、3.125mg/l和0mg/l(生理盐水对照)的测试品，并使用本发明试剂盒测定各测试品浓度；以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程，计算测定结果的相对偏差。检测与计算结果如表2所示，结果显示，测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为方程:y＝-1.20481+0.99005x，相关系数r2＝0.99986(线性回归图见图4)，说明线性关系良好，线性范围可达6.25-400mg/l。表2本发明试剂盒线性范围验证序号稀释浓度测试值1测试值2测试值3平均数绝对偏差相对偏差1400391.80402.10394.00395.974.031.01％2200194.30198.50196.60196.473.531.77％310091.2093.3097.8094.105.905.90％45047.0045.9049.2047.372.635.27％52524.1023.7023.8023.871.134.53％612.512.0011.3011.5011.600.907.20％76.255.906.005.805.900.355.60％83.132.802.802.702.770.3611.61％1000.100.000.000.000.00(3)重复性验证：由于该产品无质控血清，取具有溯源性的hdl-c高值血清质控和低值血清质控各一份，使用所述试剂盒对同一份血清样本连续检测10次，计算所述试剂盒的变异系数。检测数据如表3所示，检测结果表明，本发明试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小，分别为1.44％和4.69％，重复性较好。表3本发明试剂盒的精密度(重复性)验证结果(5)干扰试验：使用上述质控血清样本，分别混入血红蛋白、胆红素和甘油三酯，使三者最终浓度达到：480g/l、60μmol/l和5.1mmol/l，均是正常人血清含量的三倍。使用本发明试剂进行检测，检测结果见表4。结果表明，所述试剂盒具有较强的抗干扰能力。本发明的突出优点是抗干扰性较强，直接测定hdl3的含量，从而大大地提高临床检测的准确性，以满足临床检测的需求。表4干扰试验检测结果以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12