一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，更具体地，涉及一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法。

背景技术：

免疫组化用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究的技术，广泛用于临床病理诊断，鉴别诊断、疾病研究、组织学、细胞学等科学研究领域及其他需要免疫组化的领域。

现将其使用领域按照要求分为两类，一类要求在极短时间10-15min得到结果，例如：在术中诊断，常用术中诊断技术为组织化学(he),但是其容易出现假性判断及对微小癌、初期癌症诊断误判率较高，这时就需要借助免疫组化进行鉴别、辅助外科医师判断病变性质、决定手术方式；另一类针对类似临床诊断、组织、细胞、疾病研究等领域长期需要处理大量切片、涂片，需要简化实验步骤，减少实验时间，提高效率同时对组化结果要求较高，例如：在临床诊断中随着肿瘤的发病率持续增长，由于病理医生较缺乏，工作量大，病理结果的实效性，都要求免疫组化可以实现简单快捷高效的模式。

传统的免疫组化反应时间长、需要8-20h，步骤多，操作较为繁琐，容易产生非特异性染色，无法在术中快速简单准确的完成疾病诊断，也很难为病理医生及生命科学领域的科研人员提供及时的疾病信息和科学数据。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种多聚酶法快速免疫组化试剂盒及其免疫组化方法，该方法利用hrp多聚体直接与多个一抗分子结合，反应只需一步即可完成，显著提高反应速率，减少操作步骤、定位更准确、特异性更高，大幅减少实验时间，为病理医生提供及时准确的疾病信息，避免he染色出现的假阳性或假阴性以及传统的免疫组化耗时长，贻误病情。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提出一种多聚酶法免疫组化试剂盒，包括浓度为10-20μg/ml的多聚酶hrp标记抗体结合物溶液、dab显色液和苏木素复染液。

进一步地，所述多聚酶hrp标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/ml。

更进一步地，所述多聚酶hrp标记抗体结合物溶液是采用抗体稀释液稀释多聚酶hrp标记抗体结合物制备而成；所述抗体稀释液包括5g/l的酪蛋白、1g/l的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％的吐温20、质量浓度为0.04％的proclin300。

进一步地，所述多聚酶hrp标记抗体结合物的制备方法为：

1)氧化反应：取8mg辣根过氧化物酶，加8mmolnaio4，反应20分钟，得到含醛基的hrp；

2)聚合形成多聚酶：步骤1)得到的含醛基的hrp中加入2ml质量浓度为3％的非离子表面活性剂，再用1mna2co3-nahco3溶液调ph至8.8-9.2，然后4℃旋转反应过夜得多聚酶；所述的非离子表面活性剂为tritonx-100；

3)纯化：步骤2)得到的多聚酶用10mm磷酸盐生理缓冲液透析换液3次，得透析物；

4)连接一抗：取出步骤3)得到的透析物，加入适用于临床诊断的抗体；用10μl浓度为1m的na2co3-nahco3缓冲溶液调ph至8.3-8.7，旋转反应4小时；

5)还原稳定化：加入120μl浓度为5mg/mlnahb4，摇匀，室温静置还原90分钟；

6)纯化：10mm磷酸盐生理缓冲液透析，换液3次，取出透析物，得多聚酶hrp标记抗体结合物。

本发明的第二个目的在于提出一种基于上述任一所述多聚酶法免疫组化试剂盒的快速免疫组化方法，包括如下步骤：

(1)取新鲜组织冰冻切片；

(3)组织切片固定，晾干，pbs冲洗；

(3)抗体孵育：滴加多聚酶hrp标记抗体结合物溶液，孵育2-6min后用pbs冲洗；所述多聚酶hrp标记抗体结合物溶液浓度为10-20μg/ml；

(4)滴加dab显色2-5min后，pbs冲洗；

(4)苏木精染色2-3min，水洗后封固。

进一步地，所述步骤(3)中抗体孵育时间为3-4min。

本发明的第三个目的在于提出另一种基于上述任一所述多聚酶法免疫组化试剂盒的免疫组化方法，包括如下步骤：

1)石蜡切片脱蜡-水化-修复/冰切固定；

2)3％h2o2阻断13-18min，pbst/tbst冲洗3*5min；

3)孵育多聚酶标记抗体37℃25-35min，pbst/tbst冲洗3*5min；

4)滴加dab显色2-5min后，pbs冲洗30s；

5)苏木精染色2-3min，蓝化液返蓝；

6)脱水-透明-封片。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明的免疫组化方法基于多聚酶技术，采用多个hrp分子聚合成hpr多聚体，作为此方法的信号放大系统，采用hrp多聚体与多个一抗分子结合，形成抗体-hrp结合物，作为此方法的反应系统，达到信号放大的效果，无需级联放大。该方法简化操作步骤，不用孵育二抗，也不必清洗二抗，节约大量时间，避免因二抗产生的非特异性染色。多抗体分子结合hrp聚合物，大大提高反应速率，缩短反应时间，同时hrp多聚体信号放大系统，信号更强。该方法同时满足术中快速检测和术后的临床诊断、疾病研究、指导用药及科学研究。

附图说明

图1为实施例1中免疫组化实验的阳性结果图(孵育时间2min)；

图2为实施例1中免疫组化实验的阳性结果图(孵育时间4min)；

图3为实施例1中免疫组化实验的阳性结果图(孵育时间6min)；

图4为实施例2中免疫组化实验的阳性结果图(多聚酶标记her-2在丙酮固定-冰冻切片的乳腺癌组织。

图5为实施例3中免疫组化实验的阳性结果图(多聚酶标记msh6在丙酮固定-冰冻切片的结肠癌组织。

图6为实施例4中免疫组化实验的阳性结果图。

图7为实施例5中免疫组化实验的阳性结果图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照工具书(著[美]j.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

本实施例研究对象为多聚酶标记p63在丙酮固定-冰冻切片的扁桃体组织上实施多聚酶法快速免疫组化。

1、多聚酶hrp标记抗体结合物的制备

(1)氧化反应：取8mg辣根过氧化物酶(hrp)，加8mmolnaio4，反应20分钟；naio4(氧化剂)的加入起氧化作用，得到含醛基的hrp；

(2)聚合形成多聚酶(poly-hrp)：步骤(1)得到的含醛基的hrp中加入2ml质量浓度为3％的非离子表面活性剂tritonx-100，再用1mna2co3-nahco3溶液调ph至8.8-9.2(最佳为9.0)，然后4℃旋转反应过夜，第二天室温反应1小时，得多聚酶(poly-hrp)；非离子表面活性剂加入形成胶束化包覆；

(3)纯化：步骤(2)得到的多聚酶10mm磷酸盐生理缓冲液(pbs)透析换液3次，得透析物；

(4)连接p63：取出步骤3)得到的透析物(透析物中含hrp2mg)，加入p630.27mg；

(5)用10ul浓度为1m的na2co3-nahco3缓冲溶液调ph至8.3-8.7(最佳为8.5)，旋转反应4小时；

(6)还原稳定化：加入120ul浓度为5mg/mlnahb4(还原剂，用2mmnaoh配制)，摇匀，室温静置还原90分钟；

(7)纯化：10mmpbs透析换液3次；取出透析物，得多聚酶hrp标记抗体结合物(poly-hrp-p63)。

2、多聚酶标记p63在丙酮固定-冰冻切片的扁桃体组织上实施多聚酶法快速免疫组化

(1)分别取3份新鲜扁桃体组织与切片机载物台，-20℃冷冻切片，黏附于载玻片上；

(2)三份切片分别用丙酮固定20s后晾干，pbs冲洗15s；

(3)分别滴加多聚酶hrp标记p63一抗，三份切片分别孵育2min、4min、6min，其中poly-hrp-p63的浓度为10μg/ml；

(4)pbs冲洗10sx2次；

(5)各滴加bab显色3min，pbs冲洗10sx2次

(6)苏木精染色2-3min，水洗后封固、拍照。

图一、图二和图三均为扁桃体组织免疫组化实验的阳性结果图，图一、图二、图三分别对应孵育时间为2min、4min、6min，图一表明快速免疫组化显示p63在该组织复层扁平上皮细胞上染色有较弱阳性结果，信号稍弱(×100)；图二表明快速免疫组化显示p63在该组织复层扁平上皮细胞上染色结果较强阳性，信号清晰明确(×100)，说明该方法能够在较短的时间内完成实验并且可以得到非常强的清晰的阳性信号；图三表明快速免疫组化显示p63在该组织复层扁平上皮细胞上染色结果强阳性，信号清晰明确(×100)。本实施例的研究表明，本发明通过酶标记技术使标记的一抗可以在短时间孵育达到以往长时间多步骤操作相同的效果，大大提高反应速率，缩短反应时间，同时hrp多聚体信号放大系统，信号更强。

实施例2：

1、多聚酶hrp标记抗体结合物(poly-hrp-her-2)的制备

poly-hrp-her-2的制备同实施例1。

2、多聚酶标记her-2在丙酮固定-冰冻切片的乳腺癌组织上实施多聚酶法快速免疫组化

(1)取新鲜乳腺癌组织与切片机载物台，-20℃冷冻切片，黏附于载玻片上；

(2)切片用丙酮固定20s后晾干，pbs冲洗15s；

(3)滴加多聚酶hrp标记her-2一抗，切片孵育3min，其中poly-hrp-her-2的浓度为20μg/ml；

(4)pbs冲洗10sx2次；

(5)滴加bab显色3min，pbs冲洗10sx2次

(6)苏木精染色2-3min，水洗后封固、拍照。

图四为乳腺癌组织免疫组化实验的阳性结果图，如图所示在以上条件下，在浸润性乳腺导管癌的癌细胞膜呈her-2阳性表达(信号为膜信号所看起来是圆圈形的)信号明确，清晰。

实施例3：

1、多聚酶hrp标记抗体结合物(poly-hrp-msh6)的制备

poly-hrp-msh6的制备同实施例1。

2、多聚酶标记msh6在丙酮固定-冰冻切片的结肠癌组织上实施多聚酶法快速免疫组化。

(1)取新鲜结肠癌组织与切片机载物台，-20℃冷冻切片，黏附于载玻片上；

(2)切片用丙酮固定20s后晾干，pbs冲洗15s；

(3)滴加多聚酶hrp标记msh6一抗，切片孵育5min，其中poly-hrp-msh6的浓度为15μg/ml；

(4)pbs冲洗10sx2次；

(5)滴加bab显色3min，pbs冲洗10sx2次

(6)苏木精染色2-3min，水洗后封固、拍照。

图五为结肠癌组织免疫组化实验的阳性结果图，如图所示在以上条件下，在结肠癌的癌细胞核上呈msh6阳性表达，信号明确，清晰。

实施例4：

1、多聚酶hrp标记抗体结合物(poly-hrp-抗ck(pan))的制备

poly-hrp-抗ck(pan)的制备同实施例1。

2、胃癌组织上实施多聚酶标记抗ck(pan)免疫组化

(1)石蜡切片脱蜡-水化-修复/冰切固定；

(2)3％h2o2阻断15minpbst/tbst冲洗3*5min；

3.孵育多聚酶标记抗体37℃30minpbst/tbst冲洗3*5min；其中poly-hrp-抗ck(pan)的浓度为10μg/ml；

4.滴加dab显色3min后，pbs冲洗30s；

5.苏木精染色3min，蓝化液返蓝；

6.脱水-透明-封片。

图6为胃腺癌组织免疫组化实验的阳性结果图，如图所示在以上条件下，在胃腺癌的癌细胞膜呈ck(pan)阳性表达(信号在核周围形成一圈胞质染色)信号明确，清晰，染色强度与常规方法组化染色结果无异。

实施例5：

1、多聚酶hrp标记抗体结合物(poly-hrp-抗ck5)的制备

poly-hrp-抗ck5的制备同实施例1。

2、胃癌组织上实施多聚酶标记抗抗ck5免疫组化

(1)石蜡切片脱蜡-水化-修复/冰切固定；

(2)3％h2o2阻断15minpbst/tbst冲洗3*5min；

(3)孵育多聚酶标记抗体37℃30minpbst/tbst冲洗3*5min；其中poly-hrp-抗ck5的浓度为20μg/ml；

(4)滴加dab显色3min后，pbs冲洗30s；

(5)苏木精染色3min，蓝化液返蓝；

(6)脱水-透明-封片。

图7为肺鳞癌组织免疫组化实验的阳性结果图，如图所示在以上条件下，在胃腺癌的癌细胞膜呈ck5阳性表达(信号在核周围形成一圈胞质染色)信号明确，清晰，染色强度与常规方法组化染色结果无异。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。