一种弯曲毛细管电泳检测多酶的方法与流程

本发明属于纳米生物技术领域，具体涉及一种弯曲毛细管电泳检测多酶的方法。

背景技术：

当前迅速发展并广泛应用的各种酶传感器，将反应与检测两个步骤紧密结合起来，具有快速、方便、灵敏、精确的特点，在酶检测中发挥了巨大的作用，且更进一步推动了酶检测法的发展。通常情况下，使用单一酶底物来检测一种特定的酶，这就造成了检测选择性单一的缺点，而且操作起来较为复杂。

另一方面，毛细管电泳作为一种高分辨率、高灵敏、高通量及低样品小号的微分离技术，在生物分析领域具有广阔的应用前景。同时，通过荧光检测与毛细管电泳相结合，大大提高了检测线，拓展了毛细管的应用。通常采用直的毛细管进行样品的分析与测定。

技术实现要素：

为解决现有技术中尚无快速、高效、便捷地检测多种酶的方法，本发明的目的在于提供一种弯曲毛细管电泳检测多酶的方法，首先，设计含有多个酶切位点的多肽与量子点结合形成多酶探针，利用弯曲毛细管电泳检测不同酶在毛细管内水解多酶探针的情况。利用毛细管弯曲有利于样品在管内充分反应的特点，研究水解酶在毛细管内水解双酶探针的情况。通过毛细管电泳分析检测，并计算荧光染料Cy5的峰面积(S665nm)与QDs的峰面积(S605nm)比值来判断FRET变化情况，从而实现水解酶的检测。

本发明所采用的技术方案为：将量子点与多肽结合形成双酶探针，再将电泳所用的毛细管分别弯曲成不同个数的半圆，固定后，先进样双酶探针，间隔10s后进样水解酶，经荧光光谱仪检测双酶探针的荧光强度；所述的弯曲毛细管为石英毛细管。

所述的水解酶为PreScission蛋白酶和凝血酶。

所述多肽含有(1)双酶切位点；(2)用于和量子点发生FRET的荧光染料Cy5；(3)和量子点结合的6×组氨酸。

所述多肽含有的双酶切位点为LEVLFQGP和LVPRGS。

所述多肽序列为Cy5-D3LEVLFQGPGLVPRGSGP9G2H6(Cy5-LEVLVP-QD)。

所述量子点为含有Zn的量子点，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或CdTe/ZnSe。

所述的双酶探针为1μM量子点与8μM多肽等体积混合孵育10min得到。

所述的弯曲毛细管的内径为75μm，外径为365μm，弯曲的半圆个数为1-4个，弯曲的直径为3cm。

所述的弯曲毛细管为180°等宽圆弧弯曲毛细管。

所述双酶探针的进样时间为15s，所述水解酶的进样时间为15s，所述的水解酶进样间隔为10s。

采用上述技术方案后，本发明所取得的有益效果是：基于CE-FL可以使用一种底物同时检测多种酶，这个设计可以快速筛选来自微生物或其他环境的未知酶。操作简单，可重复性高，进一步拓展了荧光探针在生物分析领域的应用。

附图说明

图1：毛细管不同弯曲程度下(A)PSP和(B)凝血酶管内水解复合物。其中(a)仅Cy5-LEVLVP-QD，(b)直毛细管，(c)弯曲1个半圆，(d)弯曲2个半圆，(e)弯曲4个半圆。[His-PSP]＝10U/ml，[Thrombin]＝10U/ml。(激发光源λex＝420nm，黑线，605nm，QDs供体检测通道，灰色，665nm，Cy5受体检测通道)

图2：不同浓度(A)His-PSP与(B)凝血酶的活性检测。(a)0U/ml，(b)5U/ml，(c)10U/ml，(d)20U/ml，(e)40U/ml。

图3：S665nm/S605nm的值随酶浓度变化的趋势图。(a)His-PSP，(b)凝血酶。

图4：毛细管不同弯曲程度下PSP管内水解Cy5-LEV-QD复合物。其中(a)仅Cy5-LEV-QD，(b)直毛细管，(c)弯曲1个半圆，(d)弯曲2个半圆，(e)弯曲4个半圆。[His-PSP]＝10U/ml。

具体实施方式

本发明将就以下实施例作进一步说明，但应了解的是，这些实施例仅为例示说明之用，而不应被解释为本发明实施的限制。

实施例1

本发明所述的方法采用常规的固相Fmoc法，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸。

1、基本材料：

(1)树脂与连接分子：固相Fmoc法选择的树脂为Rink Amide-树脂。这种树脂具有非常好的溶胀性，可以使肽链之间更好地进行缩合反应，且有足够的网络空间满足不断增长的肽链。采用HBTU和HOBt作为连接分子，将多肽分子固定到树脂上。

(2)单体：合成所用单体为经化学修饰的α-氨基酸。

2、反应步骤：

第一步，将第一个氨基酸共价连接到树脂上

加入适当的缩合剂如HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；

第二步，去保护

采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。

第三步，激活和交联

采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键。

第四步，重复第二步和第三步，反复循环添加单体氨基酸，按照Cy5-LEVLVP序列的顺序从右到左合成，直到合成完成。

第五步，染料标记

采用碱性溶剂20％哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。EDC/Cy5/DIEA/HOBT按比例溶于DMF，加入树脂中避光过夜反应。

3、合成后处理：

(1)洗脱和脱保护：用脱保护剂三氟乙酸(TFA)将肽链从树脂上洗脱下来，并脱除保护基。

(2)HPLC分析纯化，冻干保存。

通过上述方法，合成多肽序列Cy5-LEVLVP。

4、脂溶性QDs经GSH转换成水溶性QDs

将60μL GSH溶液(含有18mg GSH和5mg KOH的250μL甲醇溶液)加入到600μL油溶性QDs(20μM)中，剧烈震荡。然后加入600μL NaOH水溶液(1mM)，将QDs转移至顶部水层。将得到的QDs离心并分散在600μL硼酸盐缓冲液(pH7.4,10mM)中待用。

5、双酶探针的合成：

将1μM QDs与8μM Cy5-LEVLVP等体积混合孵育10min，形成稳定的复合物Cy5-LEVLVP-QD。

6、水解酶和双酶探针在毛细管内相互作用研究：

将毛细管弯曲成0、1、2或4个半圆(直径为3cm)，分别在这4种情况下，首先进样Cy5-LEVLVP-QD 15s，间隔10s后，进样10U/ml的PSP 15s，通过毛细管电泳检测Cy5-LEVLVP-QD的水解情况。当半圆个数为0时，PSP管内水解复合物导致S665nm/S605nm的值为1.44(图1A，曲线b)，当半圆个数为4时，PSP的酶切效果最明显，S665nm/S605nm的值降低至0.89(图1A，曲线e)。

测试条件：水解酶与双酶探针的相互作用过程利用荧光毛细管电泳检测，电泳条件：25mM硼酸缓冲液(pH 9.3)，电压为20kV。

实施例2

按照实施例1的方法，将10U/ml的凝血酶与双酶探针在毛细管内进行水解反应。

同样，随着半圆个数的增加，凝血酶对复合物的酶切效果越来越明显，S665nm/S605nm的值由1.65(图1B，曲线b)降低到1.10(图1B，曲线e)。

实施例3

将毛细管弯曲成4个直径为3cm的半圆，进样Cy5-LEVLVP-QD 15s，间隔10s后，将不同浓度的PSP(5U/ml、10U/ml、20U/ml或40U/ml)进样15s，通过毛细管电泳检测Cy5-LEVLVP-QD的水解情况。在一定时间范围内，酶浓度的增加使得双酶探针FRET信号强度降低。计算QDs供体检测通道峰面积与Cy5受体通道峰面积比(S665nm/S605nm)进行拟合，得出曲线方程y＝1.378*exp(-x/11.307)+0.407。方程式中，y为S665nm/S605nm的值，x为PSP浓度。

其他步骤同实施例1。

实施例4

凝血酶也按照实施例3的方法进行检测。

计算QDs供体检测通道峰面积与Cy5受体通道峰面积比(S665nm/S605nm)进行拟合，得出曲线方程y＝1.467*exp(-x/19.063)+0.355，方程式中，y为S665nm/S605nm的值，x为凝血酶浓度。

对比实施例1

按照实施例1的方法合成仅含PSP酶切位点的多肽Cy5-LEV(Cy5-D3LEVLFQGPGP9G2H6)，并按照实施例1的方法进行弯曲毛细管内PSP酶切Cy5-LEV-QD复合物研究。检测结果发现，单酶切位点的多肽与QDs形成的复合物在毛细管内的水解也会受到毛细管弯曲程度的影响(图4)。