人D-二聚体定量检测卡及其临床应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体的涉及两种抗人d-二聚体(d-dimer)抗体及其制备方法以及上述抗体在人d-二聚体检测中的应用。
背景技术：
：d-二聚体(d-dimer)是纤维蛋白降解的最终产物(分子量约180kda)，其含有三个多肽链的降解产物，通过二硫键交联。二聚体结构通过γ链c端之间的两个异肽键形成交联结构而维持。正常状态下，纤溶酶和抑制酶之间保持了动态平衡，使血液循环能正常进行。人体内的纤溶系统，对保持血管壁的正常通透性及维持血液的流动状态和组织修复发挥着重要的作用。病理状态下，机体发生凝集时，凝血酶作用于纤维蛋白，转变为交联纤维蛋白，同时纤溶系统被激活，降解纤维蛋白形成各种碎片。γ链可将两个含d片段的碎片连接起来，形成d-二聚体。d-二聚体的升高，反映继发性纤溶亢进。临床上，d-二聚体的检测主要用于深静脉血栓、肺栓塞的早期排除诊断；弥漫性血管内凝血的早期诊断和动态监测；外科手术后的血栓监测；妊娠高血压、先兆子娴的监测；恶性肿瘤、白血病的早期识别及血栓监测；肝脏疾病、肾脏疾病的监测；溶栓治疗评估及血栓复发的监测；心血管疾病病情评估；脑梗死鉴别和治疗监测等等。目前国内外d-二聚体胶体金定量产品的应用主要是在即时检验(poct)领域，国外广泛应用与门诊、急诊、icu病房及医生诊所，作为疾病就诊早期的快速诊断手段，有别于临床检验中心及各种大型医院检验科所采用的全自动生化分析仪或化学发光仪等，具有简便、快速同时兼顾准确性的特点。d-二聚体胶体金定量产品在欧美已有广泛应用。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供能有效的、特异性结合人d-二聚体的抗体。更具体地说：本发明的第一目的在于提供两种抗人d-二聚体抗体。第一抗人d-二聚体抗体(dd17)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：1所示的hcdr1、如序列seqidno：2所示的hcdr2和/或如序列seqidno：3所示的hcdr3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：4所示的lcdr1、如序列seqidno：5所示的lcdr2和/或如序列seqidno：6所示的lcdr3。优选的是上述抗体(dd17)的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示。第二抗人d-二聚体抗体(dd89)，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：9所示的hcdr1、如序列seqidno：10所示的hcdr2和/或如序列seqidno：11所示的hcdr3；其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列seqidno：12所示的lcdr1、如序列seqidno：13所示的lcdr2和/或如序列seqidno：14所示的lcdr3。优选的上述抗体(dd89)的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:15所示，抗体轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:16所示。本发明第二个目的是提供两种单链抗体，所述单链抗体(dd17)的氨基酸序列如seqidno:17所示；所述单链抗体(dd89)的氨基酸序列如seqidno:18所示。本发明第三个目的是提供两种编码上述单链抗体的核苷酸序列，编码单链抗体(dd17)的核苷酸序列如seqidno:19所示，和编码单链抗体(dd89)的核苷酸序列如seqidno:20所示。本发明第四个目的是提供一种含有上述核苷酸序列的表达载体。本发明第五个目的是提供一种含有上述表达载体的重组宿主细胞。所属宿主细胞可以是大肠杆菌、毕赤酵母或哺乳动物细胞，优选为毕赤酵母。本发明第六个目的是提供一种生产上述单链抗体的方法，包括：1)在合适的条件下培养上述重组宿主细胞表达抗体；2)然后从宿主细胞中纯化、收集抗体。本发明的第七个目的在于提供上述抗人d-二聚体抗体在检测人d-二聚体含量中的应用。本发明的第八个目的在于提供一组可进行配对并检测人d-二聚体的抗体对组合dd17和dd89；该抗体对组合的检测灵敏度高，特异性好。本发明的第九个目的在于提供一种利用所述抗人二聚体抗体检测人二聚体的胶体金免疫层析定量检测卡，包括样品吸收垫、金标垫、反应膜和吸水垫；所述金标垫喷涂有胶体金颗粒标记的抗体dd89，所述反应膜上有检测带和质控带，检测带位置包被有抗体dd17。所述分封闭液是1％-10％bsa、0.01mpb溶液，ph7.4。所述金标抗体复溶液是1％-10％bsa、5％海藻糖、0.025％tween20、0.01mpb溶液，ph7.4。所述抗体包被液是0-0.25％bsa、0-2.5％异丙醇、0.01mpb溶液，ph7.4。所述样本稀释液是0-2.5％bsa、0-2.5％tween20、0.01％-0.1％proclin300、0.01mpbs溶液，ph7.4。所述质控带位置包被抗his标签抗体或proteinl。所述反应膜优选硝酸纤维素膜。所述抗his标签抗体优选鼠抗his抗体。本发明制备了多种抗体，并进行配对筛选，获得灵敏度及特异性均能满足需求的抗体组合(dd17及dd89)；同时其方便大量生产，可满足日后大规模临床应用的需求。对上述抗体组合进行检测体系的调试优化工作，获得操作简便，灵敏度，特异性及相关检测性能均可满足人临床样本检测的胶体金定量检测试纸卡。附图说明图1.抗体dd17及dd89特异性检测效果图(westernblot)，泳道1为标准蛋白质(marker)；泳道2为人天然d-二聚体。图1(a)检测抗体为dd17-hrp；图1(b)检测抗体为dd89-hrp。图2.本发明胶体金免疫层析定量检测卡结构示意图。1为样品垫、2为反应膜、3为吸收垫、4为质控线(c线)、5为检测线(t线)、6为金标垫、7为pvc片材。图3.d-二聚体胶体金检测卡检测范围拟合曲线。图4.d-二聚体胶体金检测卡线性范围拟合曲线。图5.d-二聚体胶体金检测卡与对照产品比对拟合曲线。具体实施方式定义“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由b淋巴细胞分泌的大型y形蛋白质，能够通过y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。“单链抗体”(scfv)指的是抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)通过15～20个氨基酸短肽(linker)连接形成的单一链融合蛋白，用于连接的linker通常富含甘氨酸和丝氨酸，以利于单链抗体的稳定性与柔韧性。连接方式可将vl的n端连接至vh的c末端，或者相反。尽管去除了恒定区并引入linker，单链抗体依然保留了抗体对抗原的特异性，且其具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。互补决定区(complementarity-determiningregion，cdr)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。实施例1.抗人d-二聚体杂交瘤细胞株的制备1.动物免疫以天然人d-二聚体(购买于meridian公司)按照一般免疫程序免疫balb/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接elisa法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。2.细胞融合(1).脾脏细胞的制备将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。(2).饲养细胞的制备取8～10周龄的雌性balb/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10ml1640ht培养基(购自sigma公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640hat培养基中备用；取2～3周龄的雌性balb/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640hat培养基中，备用。(3).细胞融合选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与2×107个上述sp2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1ml预热的peg1450(聚乙二醇1450，购自sigma公司)，加入1640ht培养基30ml终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640hat培养基中。将上述hat培养基充分混匀后，以200μl/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640ht培养基替换20％1640hat培养基，3天后取上清进行检测。3.抗人d-二聚体特异性杂交瘤株筛选(1).检测板的准备：用cb包被液稀释天然人d-二聚体(购买于meridian公司)至1μg/ml，包被96孔elisa酶标板，100μl/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的pbst缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μl/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔的hrp标记的羊抗鼠igg，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μl/孔的tmb显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μl的2mh2so4终止反应，并于od450处读取数值。阳性孔确定原则：od450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株dd17及dd89均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。实施例2.杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定对上述杂交瘤细胞株dd17及dd89抗体可变区序列进行测定。a.rna的提取：参照细胞总rna抽提试剂盒(购自roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株dd17及dd89进行总rna提取并立即进行反转录；b.rna反转录成为dna：参照thermoscientificrevertedfirststrandcdnasynthesiskit(购自thermo公司)对上一步骤中所提取的总rna进行反转录，制得cdna，冻存于-20℃备用；c.可变区序列的pcr扩增及回收：以上一步骤中所得cdna为模板，以鼠igg亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行pcr扩增，将pcr产物经dna胶回收试剂盒(购自tiangen公司)进行回收；d.可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pmd18-tkit(购自takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pmd18-t载体进行连接，转化大肠杆菌dh5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序得到杂交瘤细胞株dd17的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno:7所示、轻链可变区氨基酸序列如seqidno：8所示。vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列seqidno：1所示的hcdr1、如序列seqidno：2所示的hcdr2和如序列seqidno：3所示的hcdr3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列seqidno：4所示的lcdr1、如序列seqidno：5所示的lcdr2和如序列seqidno：6所示的lcdr3。测序得到杂交瘤细胞株dd89的抗体重链可变区氨基酸序列如seqidno:15所示、轻链可变区氨基酸序列如seqidno：16所示。vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列seqidno：9所示的hcdr1、如序列seqidno：10所示的hcdr2和如序列seqidno：11所示的hcdr3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列seqidno：12所示的lcdr1、如序列seqidno：13所示的lcdr2和如序列seqidno：14所示的lcdr3。实施例3.单链抗体的重组表达及纯化根据实施例2中测序结果，将杂交瘤细胞株dd17及dd89的抗体重链及轻链可变区之间加入连接肽(ggggs)3，引入六个组氨酸，并将其全基因直接融合并用毕赤酵母表达系统进行单链抗体的重组表达。所表达得到的抗体分别命名为抗体dd17及dd89。上述单链抗体的重组表达具体如下：a)单链抗体基因表达载体构建单链抗体dd17的基因序列如seqidno:19所示、氨基酸序列如seqidno:17所示；单链抗体dd89的基因序列如seqidno:20所示、氨基酸序列如seqidno:18所示。将单链抗体dd17，dd89基因片段上游引入xhoi酶切位点以及ppiczαa载体中xhoi序列后dna序列，下游引入组氨酸标签和xbai酶切位点，进行全基因合成并构建到puc57质粒(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)中，得到一种长期保存质粒，质粒记为puc57-dd17-scfv、puc57-dd89-scfv。进行pcr扩增，其中上游引物p1为tgtaaaacgacggccagt；下游引物p2为:caggaaacagctatgac。常规pcr程序后，琼脂糖凝胶电泳分析，显示产物大小与预期大小一致。分别将pcr获得基因产物回收纯化后，采用xhoi(#r0146s,购自newenglandbiolabs公司)和xbai(#r0145v,购自newenglandbiolabs公司)双酶切，用t4连接酶连接到ppiczαa(v19520，购自invitrogen)质粒中，转化到dh5α感受态细胞中，在含有zeocin(r250-01，购自invitrogen公司)的lb平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到单链抗体dd17、dd89的表达载体，记为ppiczα-dd17-scfv、ppiczα-dd89-scfv。b)单链抗体基因在毕赤酵母宿主工程菌株的构建、筛选及表达ypds固体培养基配制：参照invitrogen公司easyselectpichiaexpressionkit说明书；毕赤酵母感受态细胞：参照easyselectpichiaexpressionkit说明书；bmgy培养基配制：参照invitrogen公司multi-copypichiaexpressionkit说明书；bmmy培养基配制：参照invitrogen公司multi-copypichiaexpressionkit说明书。分别将ppiczα-dd17-scfv、ppiczα-dd89-scfv质粒，用saci限制性内切酶酶切线性化。乙醇沉淀后将线性化载体，电转化进入到x-33感受态酵母细胞，涂布到含有zeocin的ypds固体培养基，30℃培养3-5天，就有阳性克隆产生。将上述获得的dd17及dd89重组单链抗体基因工程菌株接种于bmgy培养基中，30℃，220rpm培养至菌体密度到od600＝2.0～6.0，每隔24小时补加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)。一周后，收集发酵培养液。c)单链抗体纯化采用组氨酸标签亲和柱纯化单链抗体dd17及dd89，预装柱子选择为histraphp，具体步骤如下：(1)发酵液的除杂预处理：将上述表达得到单链抗体dd17及dd89融合蛋白发酵液上清，离心收集上清，并加入结合缓冲液，使得上清终浓度为300mmnacl，20mmnah2po4，10mmimidazole，调ph7.5，0.45μm滤膜过滤。(2)histraphp亲和柱纯化：运用全自动智能蛋白纯化系统(aktaavant150，购自gehealcare公司)对预处理获得的单链抗体dd17及dd89发酵液进行亲和纯化，柱子为histraphp(17-5248-02,购自gehealcare公司)。结合缓冲液为300mmnacl，20mmnah2po4，10mmimidazole，ph7.5，洗脱缓冲液为300mmnacl，20mmnah2po4，500mmimidazole，ph7.5。洗脱时进行线性洗脱，并收集各个洗脱峰。纯化后的蛋白纯度均达到95％以上；合并符合要求的收集管，更换缓冲液为pbs溶液并超滤浓缩(1mg/ml)，过滤除菌于-20℃保存备用。实施例4.抗体的性能评价1、抗体dd17及dd89的westernblot鉴定a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置7.5％分离胶、5％浓缩胶，分别上样(非还原)标准蛋白质及人天然d-二聚体(购买于hytest公司)，恒压下电泳1小时；b.转膜：恒流(35ma/膜)条件下转膜80分钟，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝g250对完成转膜的sds-page胶进行染色，观察蛋白的残留情况；c.封闭：含5％脱脂奶的tbst缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(tbst，详见takara公司tbstbuffer)洗涤一次，10分钟；d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记dd17(dd17-hrp，1mg/ml，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)及辣根过氧化物酶标记dd89(dd89-hrp，1mg/ml，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，分别加入上述两张硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；tbst洗涤5次，每次10分钟；e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2ml稳定型过氧化物酶溶液(1ml)与鲁米诺/增强剂溶液(1ml)的混合液(购买于thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像系统(购买于ge公司)拍照(图1)，留取结果。检测结果可见，抗体dd17及dd89均具有较好的特异性，可特异性检测人d-二聚体。2.单链抗体dd17及dd89在胶体金检测平台的评价将实施例3中纯化的抗体进行配对组合，分别作为包被抗体或标记抗体进行配对检测d-二聚体(d-二聚体)，检测步骤如下：1)用抗体包被液将dd17或dd89稀释至1.5mg/ml，划线于硝酸纤维素膜上；2)用金标抗体重悬液将胶体金标记的dd17或dd89稀释后喷与结合垫上；3)按附图所示贴膜，切条，装卡(具体制备参见实施例5)4)用样本稀释液稀释d-二聚体标准品(众红自制)，至浓度为5mg/l，1mg/l，将这两个浓度标准品和零浓度标准品(即样本稀释液)分别添加50ul到胶体金检测卡中(dd17包被-dd89标记或dd89包被-dd17标记)，10min后将检测卡放置在读数仪上进行读数。结果如下表所示：由上述结果可知，可见dd17作为包被抗体，dd89作为标记抗体组成的双抗体夹心法检测系统可应用于胶体金检测平台，进行d-二聚体的检测。实施例5抗d-二聚体的胶体金免疫检测卡的制备1、溶液配制1)0.01mpb缓冲液制备：称取na2hpo4·12h2o3.22g，nah2po4·2h2o0.15g，加纯化水1000ml，转子搅拌至溶解，用ph计测定其ph7.4±0.1，0.45um滤膜过滤。2)封闭液制备：称取牛血清白蛋白5g，加0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)50ml，转子搅拌至溶解。3)抗体包被液制备：称取0.2ml异丙醇，加入9.8ml0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)转子搅拌5-10min。4)金标抗体复溶液制备：称取1g牛血清白蛋白，5g海藻糖，加入100ml0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)，转子搅拌至溶解后，加入25ultween-20，继续用转子搅拌5-10min5)样本稀释液制备：取18.75g牛血清白蛋白加入750ml0.01mpb溶液(ph7.4±0.1)，转子搅拌至溶解，加入0.75mlproclin300，继续用转子搅拌5-10min,0.45um滤膜过滤。2、d-二聚体的胶体金免疫检测卡的制备1)胶体金的标记抗体dd89的胶体金标记(以1ml胶体金溶液标记为例)：用k2co3调节胶体金ph值(每1ml胶体金中加入5ul0.2mk2co3)，搅拌5-10分钟，向胶体金溶液中缓慢加入抗体dd89(每1ml胶体金中加入8ug抗体dd89)，低速搅拌30分钟；加入封闭液100ul，搅拌20分钟；将胶体金溶液转入离心管中，1500rpm，2-8℃离心15min.；上清移至另一离心管中，12000rpm，2-8℃离心30min；去上清用70ul金标抗体复溶液复溶沉淀即得胶体金标记的dd89抗体。2)金标垫及反应膜制备将dd89金标抗体喷涂在金标垫6上，干燥备用；将抗体dd17用抗体稀释液稀释至1.5mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的t线5位置；将抗his标签抗体用抗体稀释液稀释至0.2mg/ml后，包被于反应膜2(硝酸纤维素膜)的c线4位置，反应膜干燥备用。3)组装大卡、切条、组装将样品垫1、金标垫6、包被有抗体的硝酸纤维素膜2、吸水垫3从左至右依次黏贴在pvc底板上(如图2所示)，所述包被有抗体的硝酸纤维素膜的t线5在左、c线4在右。将大板切割成宽度为2.92mm的小条；将切好的条子放置在底卡的卡槽内，面板加样孔位置对应样本垫；将面板与底板对合，用力按压，使面板与底板吻合；压卡时应使卡竖向排列在压壳机传送带上依次压盖。4)试剂盒组装将组装好的检测卡，干燥剂装入铝箔袋中，热封机封口，贴标签；将样本稀释液按0.45ml/管进行分装，并按照试剂盒规格装入自封袋，贴标签；按照成品规格，将一定份数的内包，1个含样本稀释液的自封袋，1份说明书，1个合格标签装入包装盒内，并在包装盒外贴好标签。3、d-二聚体胶体金检测卡使用方法1)打开外包装，从密封铝箔袋中取出检测卡，置于平坦台面上。2)吸取30μl血浆样本，加入0.45ml样本稀释液中充分混合。3)吸取50ul经处理后的样本加入检测卡的加样孔中，室温下静置10min。4)将检测卡放入免疫层析定量分析仪中，按“快速检测”键开始检测，仪器将自动对检测卡进行扫描。5)从免疫层析定量分析仪的显示屏幕上读取/打印检测结果。4、d-二聚体胶体金检测卡检测效果评估1)精密性：将dd17(包被)-dd89(标记)检测卡按检测卡使用方法检测5mg/l、1mg/l的d-二聚体参考品各10次重复测定，剔除离群值后计算检测卡精密度。实验结果显示检测结果变异系数cv<12％。浓度(mg/l)51cv10.44％9.92％2)检测范围：将dd17(包被)-dd89(标记)检测卡检测不同浓度的d-二聚体重组蛋白0.3/0.625/1.25/2.5/5/10mg/l，拟合曲线及检测范围为0.3-10mg/l(如附图3)。3)线性范围：将高值样本与样本稀释液配制成5个系列浓度样本0.3/0.625/2.5/5/10mg/l，用dd17(包被)-dd89(标记)检测卡检测，每个样本检测3次，将结果与理论浓度进行回归统计，判断在该浓度范围内是否成线性。线性范围为0.3-10mg/l(如附图4)。4)准确度：将dd17(包被)-dd89(标记)检测卡按检测卡使用方法检测5mg/l、1mg/l的d-二聚体参考品各3次重复，计算平均值和理论值的相对偏差，实验结果显示三个浓度检测结果相对偏差b<15％。浓度(mg/l)51b0.13％9.33％5、准确度—方法学比对选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的商品化d-二聚体胶体金检测卡作对照产品比对验证。选择30份临床病人标本，按1到30的顺序编号，用对照产品和待评价的dd17(包被)-dd89(标记)的胶体金检测卡同时进行实验，按照1，2，3......28，29，30，30，29，28......3，2，1的样本顺序进行测定。对照和待评价产品的检测结果相关系数r2＝0.987，说明两种方法检测结果有较好的相关性。6、配方筛选除上述最优制备例1外，申请人还尝试多种制备方案，例如下面几组检测卡制备及应用结果如下表：序列表<110>江苏众红生物工程创药研究院有限公司<120>人d-二聚体定量检测卡及其临床应用<130>人d-二聚体定量检测卡及其临床应用<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>1glytyrthrleuseraspasptrp15<210>2<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>2ileleuproglyasnglyleuthr15<210>3<211>13<212>prt<213>musmusculus<400>3alaargglylysvalargargvaltyrcyspheasptyr1510<210>4<211>5<212>prt<213>musmusculus<400>4serservalsertyr15<210>5<211>3<212>prt<213>musmusculus<400>5serthrser1<210>6<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>6hisglntrpsersertyrprocysthr15<210>7<211>120<212>prt<213>musmusculus<400>7glnvalglnleuglnglnserglyprogluleumetlysproglyala151015servallysilesercyslysalathrglytyrthrleuseraspasp202530trpileglutrpvallysglnargproglyhisglyleuglutrpile354045glygluileleuproglyasnglyleuthrasntyrasngluargphe505560lysglylysalathrphethralaaspserserserasnthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargglylysvalargargvaltyrtyrpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrleuthrvalserser115120<210>8<211>106<212>prt<213>musmusculus<400>8glnilevalleuthrglnserproalailemetseralaserleugly151015glugluilethrleuthrcysseralaserserservalsertyrmet202530histrptyrglnglnlysserglythrserprolysleuleuiletyr354045serthrserasnleualaserglyvalproserargpheserglyser505560glyserglythrphetyrserleuthrileserservalglualaglu65707580aspalaalaasptyrtyrcyshisglntrpsersertyrprocysthr859095pheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>8<212>prt<213>musmusculus<400>9valpheleupheseraspalatrp15<210>10<211>10<212>prt<213>musmusculus<400>10valargasnlysproasnasnhisalathr1510<210>11<211>11<212>prt<213>musmusculus<400>11thrglythrtyrglyasntyrasnpheasptyr1510<210>12<211>6<212>prt<213>musmusculus<400>12glnaspvalserthrala15<210>13<211>3<212>prt<213>musmusculus<400>13trpalaser1<210>14<211>9<212>prt<213>musmusculus<400>14glnglnhistyrserthrproprothr15<210>15<211>120<212>prt<213>musmusculus<400>15gluleuserhismetvalaspleuglnalaalaalaasnserleuval151015tyrproargleutrpaspglyalaglyvalpheleupheseraspala202530trpmetasptrpvalargglnserprogluargglyleuglutrpval354045alagluvalargasnlysproasnasnhisalathrtyrtyralaglu505560servallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser65707580valtyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthrglyiletyr859095tyrcysthrglythrtyrglyasntyrasnpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrleuthrvalserser115120<210>16<211>107<212>prt<213>musmusculus<400>16aspilevalmetthrglnserhislysphemetserthrservalgly151015aspargvalserilethrcyslysalaserglnaspvalserthrala202530valthrtrptyrglnglnlysproglyglnserprolysleuleuile354045tyrtrpalaserthrarghisthrglyvalproaspargphethrgly505560serglyserglythrasptyrthrleuthrileserservalglnala65707580gluaspleualaleutyrtyrcysglnglnhistyrserthrpropro859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>17<211>241<212>prt<213>人工序列()<400>17glnvalglnleuglnglnserglyprogluleumetlysproglyala151015servallysilesercyslysalathrglytyrthrleuseraspasp202530trpileglutrpvallysglnargproglyhisglyleuglutrpile354045glygluileleuproglyasnglyleuthrasntyrasngluargphe505560lysglylysalathrphethralaaspserserserasnthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargglylysvalargargvaltyrtyrpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrleuthrvalserserglyglyglyglyserglyglygly115120125glyserglyglyglyglyserglnilevalleuthrglnserproala130135140ilemetseralaserleuglyglugluilethrleuthrcysserala145150155160serserservalsertyrmethistrptyrglnglnlysserglythr165170175serprolysleuleuiletyrserthrserasnleualaserglyval180185190proserargpheserglyserglyserglythrphetyrserleuthr195200205ileserservalglualagluaspalaalaasptyrtyrcyshisgln210215220trpsersertyrprocysthrpheglyglyglythrlysleugluile225230235240lys<210>18<211>242<212>prt<213>人工序列()<400>18gluleuserhismetvalaspleuglnalaalaalaasnserleuval151015tyrproargleutrpaspglyalaglyvalpheleupheseraspala202530trpmetasptrpvalargglnserprogluargglyleuglutrpval354045alagluvalargasnlysproasnasnhisalathrtyrtyralaglu505560servallysglyargphethrileserargaspaspserlysserser65707580valtyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthrglyiletyr859095tyrcysthrglythrtyrglyasntyrasnpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrleuthrvalserserglyglyglyglyserglyglygly115120125glyserglyglyglyglyseraspilevalmetthrglnserhislys130135140phemetserthrservalglyaspargvalserilethrcyslysala145150155160serglnaspvalserthralavalthrtrptyrglnglnlysprogly165170175glnserprolysleuleuiletyrtrpalaserthrarghisthrgly180185190valproaspargphethrglyserglyserglythrasptyrthrleu195200205thrileserservalglnalagluaspleualaleutyrtyrcysgln210215220glnhistyrserthrproprothrpheglyglyglythrlysleuglu225230235240ilelys<210>19<211>723<212>dna<213>人工序列()<400>19caggttcagctgcagcagtctggacctgagctgatgaagcctggggcctcagtgaagata60tcctgcaaggccactggctacacgctcagtgacgactggatagagtgggtaaagcagagg120cctggacatggccttgagtggattggagagattttacctggaaatggtcttactaactac180aatgagagattcaagggcaaggccaccttcactgcagattcatcctccaacacagcctac240atgcaactcagcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtgcaagggggaag300gtacgacgggtctactactttgactattggggccaaggcaccactctcacagtctcctca360ggtggtggtggatccggaggtggtggttctggtggtggtggttctcaaattgttctcacc420cagtctccagcaatcatgtctgcatctctaggggaggagatc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