糖皮质激素及其衍生物的筛查方法及其应用与流程

本发明属于分析化学领域，特别涉及一种糖皮质激素及其衍生物的筛查方法及其应用。

背景技术：

糖皮质类激素(glucocorticoids，gcs)属甾体类化合物，具有很好的抗炎作用，对许多皮肤性炎症和过敏症非常有效，在临床上应用广泛。近年来存在在化妆品中添加各类gcs以达到美白抗敏等功效的现象，然而，长期使用该类化妆品会导致激素依赖性皮炎、接触性皮炎或化妆品皮肤病，甚至毁容。因此，《化妆品安全技术规范》(2015年版)明确将gcs列为化妆品中禁用物质。

针对gcs的检测方法主要有薄层色谱法(tlc)、高效液相色谱法(hplc)和液相色谱-质谱法(lc-ms/ms)等。其中，国标gb/t24800.2-2009采用lc-ms/ms建立了化妆品中41种gcs的检测方法。然而，从检测技术的目标性进行分析，现有化妆品中非法添加gcs的检测方法都是针对固定种类的gcs进行靶向性的检测，即检测模式都是对于已知种类的gcs进行检测。但是，随着化妆品行业技术水平的飞速发展，部分企业可能通过化学合成设计等手段，将某些功效较好的糖皮质激素的化学结构进行有效修饰，合成新型的糖皮质激素衍生物应用到化妆品中。这些新型衍生物甚至可能比母版化合物具有更高的活性。在这种情况下，现有的靶向性的检测技术将无法对新型衍生物进行识别，导致这种产品游离于的监管之外，严重威胁化妆品使用者的健康和安全。因此，建立一种同时可以筛查和鉴定化妆品中gcs及其共母核结构衍生物的方法，对于提升化妆品的产品质量，保障人们身体健康具有重要的意义。

技术实现要素：

基于此，本发明的目的在于提供一种不完全依赖于对照品的、覆盖范围广、灵敏度高、准确性好能实现对糖皮质激素及其新型衍生物进行准靶向和非靶向的筛查及鉴定方法。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种糖皮质激素及其衍生物的筛查方法，包括以下步骤：

s1.待测样品经分散提取后，采用超高效液相色谱仪进行色谱分离，pda串联tofms/ms进行紫外光谱图及质谱信息采集；

s2.采用含有若干组特征碎片离子信息的共母核特征离子数据库，对采集的待测样品的质谱信息进行搜索，搜索待测样品中包含的特征碎片离子信息；

s3.结合质谱断裂特征、离子精确质量数、同位素丰度、紫外吸收光谱的至少一种信息，得待测样品中的糖皮质激素或衍生物。

本发明还提供一种用于飞行时间质谱法筛查糖皮质激素及其衍生物的共母核特征离子数据库，包含以下至少一组特征碎片离子信息：

第一组：泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h24o3和c21h22o2；

第二组：氟轻松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h20o4和c21h18o3；

第三组：泼尼松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h24o4和c21h22o3；

第四组：氢化可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h22o3和c21h20o2；

第五组：可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h26o4和c21h24o3；

第六组：甲基泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c24h28o4和c24h26o3；

第七组：曲安奈德类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c24h26o4和c24h24o3；

第八组：氟米松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h24o4和c22h22o3；

第九组：倍他米松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h24o3和c22h22o2；

第十组：氯倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h25clo3和c22h23clo2；

第十一组：氯倍他松丁酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h23clo3和c21h23clo2；

第十二组：卤倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h23clo3和c22h21clo2。

本发明还提供一种糖皮质激素及其衍生物的筛查方法和所述共母核特征离子数据库的应用，具体技术方案如下：

如上所述的糖皮质激素及其衍生物的筛查方法或如上所述的共母核特征离子数据库在筛查化妆品中糖皮质激素及其衍生物中的应用。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明基于uplc-tofms/ms技术，在ms^e全信息串联质谱模式下，对待测样品进行质谱信息采集，将待测样品的质谱信息与共母核特征离子数据库进行搜索对比，搜索待测样品的质谱信息中包含的特征碎片离子信息，同时结合质谱断裂特征、离子精确质量数、同位素丰度、紫外吸收光谱等信息对筛查的色谱峰进行进一步的确认，该方法基于质谱断裂规律，形成的准靶向筛查技术在没有对照品的条件下，实现对具有相同母核结构的糖皮质激素及其新型衍生物进行筛查和鉴定，将该方法应用于筛查化妆品中的糖皮质激素，能有效应对通过对某种糖皮质激素进行结构修饰而达到规避监管的情况，以提升化妆品的产品质量，有力保障消费者的健康和安全。

附图说明

图1为常见糖皮质激素在低碰撞能下的基峰离子色谱图；

图2为四种典型糖皮质激素在高碰撞能量下获得的质谱图，其中，图2a为泼尼松龙，图2b为泼尼松龙醋酸酯，图2c为泼尼松龙醋酸戊酸酯，图2d为泼尼卡酯；

图3为chromalynxxs筛查一个化妆品时处理数据的示例示意图；

图4为氯倍他索丁酸酯(a)和倍他米松醋酸丁酸酯(b)在高碰撞能下的mse质谱图和可能的裂解途径；

图5为部分通过本方法筛查出不同糖皮质激素的实际阳性样品的提取离子色谱图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

一种糖皮质激素及其衍生物的筛查方法，包括以下步骤：

s1.待测样品经分散提取后，采用超高效液相色谱仪进行色谱分离，pda串联tofms/ms进行紫外光谱图及质谱信息采集；

s2.采用含有若干组特征碎片离子信息的共母核特征离子数据库，对采集的待测样品的质谱信息进行搜索，搜索待测样品中包含的特征碎片离子信息；

s3.结合质谱断裂特征、离子精确质量数、同位素丰度、紫外吸收光谱的至少一种信息，得待测样品中的糖皮质激素或衍生物。

其中，本发明所述的糖皮质激素及其衍生物的筛查方法，包括对于现有常见的糖皮质激素、常见的糖皮质激素的衍生物以及通过化学合成设计等手段进行化学结构修饰得到的与糖皮质激素共母核的新型衍生物，对其进行筛查和鉴定的方法。

优选地，所述共母核特征离子数据库包含以下至少一组糖皮质激素的特征碎片离子信息：

第一组：泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h24o3和c21h22o2；优选地，所述泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：泼尼松龙、泼尼松龙醋酸酯、泼尼卡酯及其同母核结构的衍生物；

第二组：氟轻松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h20o4和c21h18o3；优选地，所述氟轻松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氟轻松、氟轻松醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第三组：泼尼松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h24o4和c21h22o3；优选地，所述泼尼松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：泼尼松、泼尼松醋酸酯、布地奈德及其同母核结构的衍生物；

第四组：氢化可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h22o3和c21h20o2；优选地，所述氢化可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氢化可的松、氢化可的松醋酸酯、氢化可的松戊酸酯、氢化可的松丁酸酯及其同母核结构的衍生物；

第五组：可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h26o4和c21h24o3；优选地，所述可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：可的松、可的松醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第六组：甲基泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c24h28o4和c24h26o3；优选地，所述甲基泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙醋酸酯、氟米龙、氟米龙醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第七组：曲安奈德类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c24h26o4和c24h24o3；优选地，所述曲安奈德类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：曲安奈德、曲安奈德醋酸酯、曲安西龙、曲安西龙双醋酸酯、安西奈德及其同母核结构的衍生物；

第八组：氟米松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h24o4和c22h22o3；优选地，所述氟米松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氟米松、氟米松特戊酸酯、二氟拉松二氟拉松双醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第九组：倍他米松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h24o3和c22h22o2；优选地，所述倍他米松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：倍他米松、倍他米松醋酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、地塞米松、地塞米松醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第十组：氯倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h25clo3和c22h23clo2；优选地，所述氯倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氯倍他索丙酸酯及其同母核结构的衍生物；

第十一组：氯倍他松丁酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h23clo3和c21h23clo2；优选地，所述氯倍他松丁酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氯倍他松丁酸酯及其同母核结构的衍生物；

第十二组：卤倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h23clo3和c22h21clo2。优选地，所述卤倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：卤倍他索丙酸酯及其同母核结构的衍生物。

更优选地，所述共母核特征离子数据库包含以上十二组糖皮质激素的特征碎片离子信息。

优选地，所述共母核特征离子数据库由以下方法获取得到：

取含有若干种常见糖皮质激素标准物质的对照品溶液，采用超高效液相色谱-飞行时间质谱仪进行色谱分离和质谱信息采集，同时收集目标化合物的母离子和碎片离子信息，找出具有相同母核结构或结构相类似的糖皮质激素的两对共性碎片离子，将共性碎片离子建成.txt格式的文本数据库，碎片离子以元素组成的形式输入，建立共母核特征离子数据库。

优选地，所述色谱分离的色谱条件为：

以甲酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，梯度洗脱；

流动相流速为0.2-0.4ml/min，柱温35±1℃，进样量为3～6μl；

紫外检测器，其紫外光谱采集波长范围为210-400nm。

更优选地，所述色谱分离中使用的色谱柱为watersacquityuplcbehc18柱。

进一步优选地，所述色谱柱的规格为100mm×2.1mm,1.7μm。

优选地，所述色谱分离的色谱条件中，梯度洗脱条件具体如下：

优选地，所述质谱信息采集的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源，正离子模式(esi⁺)；采集模式：ms^e；

毛细管电压：3.0±0.2kv；萃取锥孔电压：4±0.2v；采样锥孔电压：35±1v；

碰撞气：高纯氩气；

trap：0.4-0.6ml/min；

锥孔气：氮气，40-60l/h；去溶剂气：氮气，500-700l/h；

离子源温度：100±5℃；去溶剂气温度：400±10℃；

质量扫描范围：50～1000da；扫描时间：0.2-0.3s；

质谱碰撞电压：trapce为6.0-40v，transferce为4.0v；

tof分析模式：v模式。

优选地，所述质谱信息采集的步骤设置了两个不同质谱碰撞电压的通道，包括：质谱碰撞电压trapce为5.0-6.0v优选为6v、梯度变化的碰撞电压trapceramp为10-40v。

更优选地，质谱方法中，校正物质为亮氨酸脑啡肽(leucineenkephalin)，参比质量([m+h]⁺)为556.2271da，浓度为200±5μg/l，以蠕动泵在线注入，流速为0.2±0.1ml/min。

在其中一些实施例中，所述共母核特征离子数据库由若干种常见糖皮质激素得到，其中所述若干种常见糖皮质激素包括以下36种糖皮质激素中的至少一种：泼尼松龙、泼尼松龙醋酸酯、泼尼卡酯、氟轻松、氟轻松醋酸酯、泼尼松、泼尼松醋酸酯、布地奈德、氢化可的松、氢化可的松醋酸酯、氢化可的松戊酸酯、氢化可的松丁酸酯、可的松、可的松醋酸酯、甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙醋酸酯、氟米龙、氟米龙醋酸酯、曲安奈德、曲安奈德醋酸酯、曲安西龙、曲安西龙双醋酸酯、安西奈德、氟米松、二氟拉松双醋酸酯、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松、倍他米松醋酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、地塞米松、地塞米松醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯和卤倍他索丙酸酯。

优选地，所述若干种常见糖皮质激素含有以下36种糖皮质激素中的至少一种：泼尼松龙、泼尼松龙醋酸酯、泼尼卡酯、氟轻松、氟轻松醋酸酯、泼尼松、泼尼松醋酸酯、布地奈德、氢化可的松、氢化可的松醋酸酯、氢化可的松戊酸酯、氢化可的松丁酸酯、可的松、可的松醋酸酯、甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙醋酸酯、氟米龙、氟米龙醋酸酯、曲安奈德、曲安奈德醋酸酯、曲安西龙、曲安西龙双醋酸酯、安西奈德、氟米松、二氟拉松双醋酸酯、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、倍他米松、倍他米松醋酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、地塞米松、地塞米松醋酸酯、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯和卤倍他索丙酸酯。

优选地，步骤s2具体包括：

(1)将如上所述的若干种常见糖皮质激素，按具有相同母核结构或结构相类似分组，每组选取两对共性碎片离子，将共性碎片离子建成数据库，碎片离子以元素组成的形式输入，建立共母核特征离子数据库；

(2)采用共母核特征离子数据库对采集的待测样品的质谱信息进行搜索，搜索待测样品中包含的特征碎片离子信息，若待测样品的质谱信息中能同时搜索到两对共母核特征离子数据库中的某一组共性碎片离子，即初步推断待测样品中含有糖皮质激素和/或糖皮质激素衍生物。

更优选地，步骤s2中，采用含有若干组特征碎片离子信息的共母核特征离子数据库，对采集的待测样品的质谱信息进行搜索，具体为：将共母核特征离子数据库导入专用分析软件对采集的待测样品的质谱信息进行搜索，搜索待测样品中包含的特征碎片离子信息。

优选地，所述专用分析软件为waters质谱masslynx软件。

更优选地，将共母核特征离子数据库导入专用分析软件对采集的待测样品的质谱信息进行搜索，具体为：将相同的子离子建成.txt格式的文本数据质谱库，子离子以元素组成的形式输入，通过waters质谱masslynx软件中的chromlynxxs模块分别对不同结构类型的糖皮质激素及其衍生物进行筛查。

本发明的一种用于飞行时间质谱法筛查糖皮质激素及其衍生物的共母核特征离子数据库，包含以下至少一组特征碎片离子信息：

第一组：泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h24o3和c21h22o2；优选地，所述泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：泼尼松龙、泼尼松龙醋酸酯、泼尼卡酯及其同母核结构的衍生物；

第二组：氟轻松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h20o4和c21h18o3；优选地，所述氟轻松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氟轻松、氟轻松醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第三组：泼尼松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h24o4和c21h22o3；优选地，所述泼尼松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：泼尼松、泼尼松醋酸酯、布地奈德及其同母核结构的衍生物；

第四组：氢化可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h22o3和c21h20o2；优选地，所述氢化可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氢化可的松、氢化可的松醋酸酯、氢化可的松戊酸酯、氢化可的松丁酸酯及其同母核结构的衍生物；

第五组：可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c21h26o4和c21h24o3；优选地，所述可的松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：可的松、可的松醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第六组：甲基泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c24h28o4和c24h26o3；优选地，所述甲基泼尼松龙类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：甲基泼尼松龙、甲基泼尼松龙醋酸酯、氟米龙、氟米龙醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第七组：曲安奈德类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c24h26o4和c24h24o3；优选地，所述曲安奈德类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：曲安奈德、曲安奈德醋酸酯、曲安西龙、曲安西龙双醋酸酯、安西奈德及其同母核结构的衍生物；

第八组：氟米松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h24o4和c22h22o3；优选地，所述氟米松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氟米松、二氟拉松双醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第九组：倍他米松类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h24o3和c22h22o2；优选地，所述倍他米松类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：倍他米松、倍他米松醋酸酯、倍他米松双丙酸酯、倍他米松戊酸酯、倍氯米松、倍氯米松双丙酸酯、地塞米松、地塞米松醋酸酯及其同母核结构的衍生物；

第十组：氯倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h25clo3和c22h23clo2；优选地，所述氯倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氯倍他索丙酸酯及其同母核结构的衍生物；

第十一组：氯倍他松丁酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h23clo3和c21h23clo2；优选地，所述氯倍他松丁酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：氯倍他松丁酸酯及其同母核结构的衍生物；

第十二组：卤倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物，含有特征碎片离子c22h23clo3和c22h21clo2。优选地，所述卤倍他索丙酸酯类糖皮质及其共母核结构衍生物包括：卤倍他索丙酸酯及其同母核结构的衍生物。

优选地，所述用于飞行时间质谱法筛查糖皮质激素及其衍生物的共母核特征离子数据库，包含以上十二组特征碎片离子信息。

本发明还提供如上所述糖皮质激素及其衍生物的筛查方法，或如上所述的共母核特征离子数据库在筛查化妆品中糖皮质激素及其新型衍生物中的应用。

在筛查化妆品中糖皮质激素及其衍生物中的应用中，将化妆品预处理得待测样品的步骤如下：

用饱和氯化钠溶液使化妆品样品均匀分散，加入乙腈，涡旋提取，取上清液，氮吹浓缩至近干，甲醇复溶，即得。

实施例

1.1仪器和试剂

acquity^tm超高效液相色谱仪(uplc)和waterssynapt^tmms四极杆串联飞行时间质谱仪(tofms/ms，waters公司)，配有光电二极管阵列检测器(pda)；高速冷冻离心机(allegra^tm64r，beckman)；超纯水系统(milli-q，美国millipore公司)；氮吹仪(n-evap^tm111，美国organomation公司)，ms3型旋涡振荡器(ikams3，德国艾卡)，分析天平(bsa224s，德国赛多利斯)。

乙腈、甲酸(质谱纯，美国fisher公司)；甲醇、乙酸(色谱纯，美国fisher公司)；氯化钠(分析纯，广州化学试剂厂)；实验用水为milli-q纯水仪制备。

36种gcs标准物质购于dr.ehrenstorfergmbh和sigma-aldrichlaborchemikaliengmbh公司。

1.2试验方法

1.2.1标准溶液配制

标准储备液(1000mg/l)：准确称取各gcs标准物质10.0mg(精确至0.0001g)于10ml比色管中，用甲醇分别溶解并定容至刻度线，于-18℃条件下冷冻保存。

混合标准中间液(10mg/l)：移取适量上述各标准储备液于10ml比色管中，甲醇定容至刻度，配制成浓度为10mg/l的混合标准中间液，于-18℃条件下冷冻保存。

1.2.2样品处理

准确称取0.2g样品(精确至0.001g)于10ml具塞塑料离心管中，加入3ml饱和氯化钠溶液，于涡旋混合器上混合使样品均匀分散，准确加入2ml乙腈，充分涡旋提取2min，5000r/min离心10min，取上层清夜于10ml具塞塑料离心管中，下层氯化钠溶液用2ml乙腈重复提取一次，合并乙腈提取液，45℃水浴条件下氮吹浓缩至近干，甲醇溶解并定容至2ml，过0.22μm滤膜。

1.2.3色谱条件

色谱柱:watersacquityuplcbehc18柱，100mm×2.1mm,1.7μm；流动相：a为0.002％甲酸水，b为乙腈，梯度洗脱程序见表1；流速：0.3ml/min；柱温：35℃；进样量：5μl；紫外光谱采集波长：210～400nm。

表1.液相色谱流动相梯度洗脱条件

1.2.4质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子模式(esi⁺)；采集模式：ms^e；毛细管电压：3.0kv；萃取锥孔电压：4v；采样锥孔电压：35v；碰撞气：高纯氩气；trap：0.5ml/min；锥孔气：氮气，50l/h；去溶剂气：氮气，600l/h；离子源温度：100℃；去溶剂气温度：400℃；质量扫描范围：50～1000da；扫描时间：0.2s；质谱碰撞电压：trapce为6.0v，transferce为4.0v，为获得更多的化合物碎片信息，本实验设置了2个不同trapce值的ms采集通道(function)，其中一个采用质谱碰撞电压(即trapce为6.0v)，另一个采用梯度变化的碰撞电压(即trapceramp为10～40v)；tof分析模式：v模式；校正物质为亮氨酸脑啡肽(leucineenkephalin)，参比质量([m+h]⁺)为556.2771da，浓度为200μg/l，以蠕动泵在线注入，流速为0.1ml/min。

2结果与讨论

2.1样品前处理方法的选择

gcs衍生物种类繁多、理化性质差异较大，且越来越多的新型gcs衍生物被开发出来。因此，为了获得全面、准确、可靠的信息，达到无遗漏、无丢失地快速提取和鉴定可疑化合物，在gcs的筛查工作中需要开发多组分、低损失、快速简单的前处理方法。目前针对复杂基质样品，常见的前处理方法包括液液萃取(liquid-liquidextraction，lle)、固相萃取(solidphaseextraction，spe)以及quechers(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)等。其中，spe对化合物的选择性较强，需要对前处理方法进行优化获得满意的回收率，较适用于靶向化合物的定量与筛查，不适用于本方法的准靶向筛查。本研究参照gb/t24800.2-2009，采用饱和食盐水和乙腈作提取溶剂，通过液液萃取，可在较宽的范围内保留极性和弱极性化合物，并获得较高的回收率。

2.2ms^e和紫外光谱数据采集

应用超高效液相色谱仪进行色谱分离，tofms/ms进行质谱信息采集；同时，串联了pda进行紫外光谱图采集，对化合物结构进行进一步确认。采用ms^e全信息串联质谱模式，在预设定的低碰撞能扫描(function1)和高碰撞能扫描(function2)之间快速切换，从而同时完成两个扫描功能的dia数据采集，可以一次进样，同时收集化合物的母离子和碎片离子信息，36种gcs在低碰撞能下的基峰离子色谱图(bpi)如图1所示。大部分gcs在碰撞能量为6.0v时就已经可以得到较丰富的子离子碎片信息，但是氢化可的松类和可的松类物质在高碰撞能量的条件下才能得到较为丰富的子离子碎片，所以本实验设置了一个10～30v的梯度碰撞能量的通道，有助于筛查和确认该类物质。

2.3gcs的裂解规律和基于碎片离子库筛查和鉴定方法的建立

收集整理各目标物分子式，以获知其分子量、分子离子峰、质荷比等信息，在优化的色谱和质谱检测条件下，获得浓度为500ng/mlgcs混合标准溶液的色谱保留时间与母离子和子离子信息，结果发现不同类型的gcs质谱图具有相同的离子碎片，这些物质具有相同的母核或结构相类似。以泼尼松龙及其衍生物泼尼松龙醋酸酯、泼尼松龙醋酸戊酸酯和泼尼卡酯为例，图2是四种糖皮质在高碰撞能量(function2，10～30v)下获得的质谱图，其中，a为泼尼松龙，b为泼尼松龙醋酸酯，c为泼尼松龙醋酸戊酸酯，d为泼尼卡酯，从图中可以看出四种化合物都有相同的碎片离子c21h22o2(m/z307.1673da)和c21h24o3(m/z325.1804da)。

基于以上发现，将36种gcs按具有相同子离子碎片划分为12个不同的组，每组选取两个相同的子离子，表2列出了各筛查物质的保留时间及不同组gcs对应的子离子，将相同的子离子建成.txt格式的文本数据质谱库，子离子以元素组成的形式输入，通过waters质谱masslynx软件中的chromlynxxs模块分别对不同结构类型的gcs进行筛查，当同时能筛查到所选取的两个子离子碎片时，再结合其质谱断裂特征、离子精确质量数、同位素丰度进行确证以保证结果可信，同时用紫外光谱图进行验证。

各筛查物质的保留时间(rt)、紫外最大吸收波长(λmax)及不同组gcs对应的子离子如表2所示。

表2

2.4新型gcs衍生物的准靶向筛查

以发现化妆品中新型gcs衍生物氯倍他索丁酸酯和倍他米松醋酸丁酸酯为案例，对本方法的准靶向筛查技术进行描述。chormalynxxs软件可以反卷积解析色谱图，检测出现的所有色谱组分，并为每种确认的组分生成精确的谱图。将chormalynx采集的ms^e数据导入到chormalynxxs软件，按照2.3中建立的数据库进行搜索、匹配，软件在“目标模式”下进行搜索，将生成一系列单个峰，然后软件会将这些峰与包含gcs系列结构的数据库进行对比，并报告匹配结果，结果发现两个样品分别有疑似氯倍他索系列和倍他米松系列糖皮质激素衍生物，通过筛查结果得到的保留时间去查看对应的紫外光谱图，两个化合物分别在242nm和239nm处有最大吸收峰，与糖皮质激素类化合物的特征光谱图相吻合，进一步推测这两个样品中筛查出来的未知物质可能是糖皮质类化合物。图3为chromalynxxs筛查一个化妆品时处理数据的示例。图3中a为筛查列表，b为总离子流色谱图，c为19.7min处的提取离子色谱图(m/z319.1698)，d为19.7min处色谱峰的质谱图(低能量)。

图4所示为两个gcs疑似物标记有manssfragment结构的ms^e质谱图，图4(a)是gcs疑似物a的ms^e质谱图，从质谱图中可以找到质量数为m/z503.1986da和m/z481.2159da碎片离子峰，二者相差21.9827da，刚好是na与h的精确质量数的差值(21.9820da)，推断m/z503.1986为[m+na]⁺的母离子碎片，m/z481.2159为[m+h]⁺的母离子碎片；m/z483.2079为m/z481.2159的同位素质谱峰，其比例与cl的同位素比例相似，推断该未知物可能含有cl原子；子离子碎片m/z461.2101为[m+h]⁺的母离子失去一个hf得到的，碎片离子为[m+h-hf]⁺，较氯倍他索丙酸酯的子离子碎片m/z452.1926多一个14.0175da基团，推测可能是ch2基团；gcs疑似物a与氯倍他索丙酸酯都有m/z373.1552的二级碎片离子，氯倍他索丙酸酯的m/z373.1552是由m/z452.1926脱去一个h2o和一个c3h4o基团得到的，所以推测gcs疑似物a的m/z373.1552是由m/z461.2101脱去一个h2o和一个c4h6o基团得到的；碎片离子m/z355.1467是由m/z373.1552脱去一个h2o得到的；根据masslynx软件数据库匹配出来的未知物a的分子式为c26h34clfo5，[m+h]⁺的质量数的理论值与实测值偏差为0.0mda，结合前面的碎片离子分析，推断gcs疑似物a为氯倍他索丁酸酯。

图4(b)是gcs疑似物b的ms^e质谱图，从质谱图中可以找到质量数为m/z527.2457da和m/z505.2565da碎片离子峰，质量数相差21.9892da，刚好是na与h的精确质量数的差值(21.9820da)，推断m/z527.2457为[m+na]⁺的母离子碎片，m/z505.2565为[m+h]⁺的母离子碎片；子离子碎片m/z485.2509为[m+h]⁺的母离子失去一个hf得到的，碎片离子为[m+h-hf]⁺，与倍他米松双丙酸酯断裂相同；gcs疑似物b的m/z485.2509脱去一个c4h6o基团和一个h2o得到m/z397.1931，m/z397.1931脱去一个c2h2o基团和一个h2o得到m/z337.1797；倍他米松双丙酸酯的二级碎片离子m/z485.2526脱去两个c3h4o基团和两个h2o得到m/z337.1795；根据masslynx软件数据库匹配出来的gcs疑似物b的分子式为c28h37fo7，[m+h]⁺的质量数的理论值与实测值偏差为0.0mda，结合前面的碎片离子分析，推断gcs疑似物b为倍他米松醋酸丁酸酯。购置氯倍他索丁酸酯和倍他米松醋酸丁酸酯的对照品进行实验，确证了疑似物为氯倍他索丁酸酯和倍他米松醋酸丁酸酯。

2.5方法验证

采用加标样品基质来验证该筛查策略的准确性，选用膏霜、精华液和乳液三种类型的化妆品为加标基质，分别添加0.2mg/kg、1.0mg/kg和5.0mg/kg三个浓度水平的若干种gcs标准物质，按照本方法进行验证实验。结果显示，三种类型的化妆品在三个浓度的添加水平下均能筛查鉴定出36种gcs，基于uplc-tofms/ms-dia准靶向筛查策略可应用于化妆品中gcs的筛查鉴定。

2.6实际样品筛查

采用本方法对1746份化妆品样品中的gcs进行筛查鉴定，共筛查出212批次gcs非法添加的样品，筛查出不同糖皮质激素的实际阳性样品结果见表3，图5为部分通过本方法筛查出不同糖皮质激素的实际阳性样品提取离子色谱图。现有标准检测方法无法对地索奈德、地索奈德-21-醋酸酯、16ɑ-羟基泼尼松龙、甲基泼尼松龙乙丙酸酯、倍他米松丁酸丙酸酯、倍他米松丁酸酯、帕拉米松、二氟拉松、卤倍他索丙酸酯、氯倍他索丁酸酯和倍他米松醋酸丁酸酯等进行定性定量分析，且gcs类物质衍生物种类繁多，还有很多其他的新型衍生物可能添加到化妆品中，利用本方法建立的筛查策略可对gcs及其新型衍生物进行准确的定性分析。

表3

可见，本申请建立了uplc-tofms/ms-dia准靶向法快速筛查和鉴定化妆品中非法添加的糖皮质激素及其新型衍生物。将常见糖皮质激素以母核为分类依据分为12组，通过对采集的ms^e全信息质谱图进行归类分析，找出各组相同的特征离子碎片，建立共母核特征离子数据库利用waters质谱masslynx软件中的chromlynx模块对gcs进行自动筛查分析，可获得具有高可信度的鉴定结果。在无对照品的情况下，成功筛查出212批次gcs非法添加的样品，同时，鉴定出10种新型gcs衍生物，包括倍他米松丁酸丙酸酯、倍他米松丁酸酯、倍他米松醋酸丁酸酯、地索奈德-21-醋酸酯、氯倍他索丁酸酯、16ɑ-羟基泼尼松龙、甲基泼尼松龙乙丙酸酯、帕拉米松、二氟拉松和地索奈德等。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。