本发明属于新型纳米复合材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的无标记型电化学免疫传感器的制备方法，应用于乙肝e抗原hbeag的检测。
背景技术：
目前，癌症是世界许多地区的主要公共卫生问题，癌症通常仅在全身转移后才被诊断出来，癌症不仅致命，而且是全球最昂贵的疾病之一，癌症晚期治愈率低，因此发展高灵敏的癌症致病因子的定量检测方法检测早期癌症具有重要意义。
乙型肝炎病毒感染是最受关注的健康问题之一，它可引发癌症死亡率第二名的肝癌，乙肝e抗原hbeag已被确定为乙肝病毒感染引起的疾病诊断和预后的可靠肿瘤标志物，因而，开发灵敏、快速、准确的乙肝e抗原hbeag检测，对于乙肝病毒的检测具有重要意义。
传统的免疫测定技术有耗费时间、准确度不高等缺点，因此具有小型化、便携式等特点电化学免疫传感器应运而生，电化学免疫传感器将免疫反应的特异性和换能器的灵敏性与便捷性结合在一起，给提高癌症诊断和治疗检测的水平带来了希望。
本发明以pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子作为电化学信号放大平台，实现了对乙肝e抗原hbeag的定量检测，具有检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，构建此电化学免疫传感器的研究对乙肝e抗原hbeag的检测具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种无标记型pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备方法及应用，实现了对乙肝e抗原hbeag的超灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器用于乙肝e抗原hbeag的检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
1.一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径为3.0~5.0mm的玻碳电极用al2o3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0µl、0.5~2.0mg/ml的pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0µl、5~15µg/ml的乙肝e抗体滴加到电极表面，用ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0µl、1~2mg/ml的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0µl、0.1pg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的乙肝e抗原hbeag溶液，用ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4.0℃冰箱中干燥，制得一种无标记型电化学免疫传感器。
2.一种基于铂钯功能化二硫化钼的无酶电化学免疫传感器的制备方法，所述相关材料的制备，步骤如下：
（1）pdcu纳米线的制备
在室温下，分别取0.5~1.5ml的20mmol/l四氯钯酸钠溶液，0.5~1.5ml的20mmol/l氯化铜溶液，0.03~0.1ml的6mmol/l盐酸溶液，30~90mg溴化钾和20~60.0mg聚醚f127，将其溶于去离子水中，然后向溶液中加入0.5~1.5ml的0.1mmol/l抗坏血酸溶液，将其在90℃的油浴中保持30min，自然冷却至室温，在转速10000rpm离心收集得到pdcu纳米线的水分散系；
（2）多孔石墨烯的制备
在连续超声下将0.33~1.0g六水合三氯化铁与0.33~1.0ml的5.0mg/ml氧化石墨烯溶液混合1h，然后，通过滤纸过滤混合物，将滤纸在60℃的真空烘箱中干燥，将带盖的滤纸放在锡箔上，用钳子放入马弗炉中，并在450℃下点火，然后，用钳子取出锡箔上的片材并自然冷却至室温，用超纯水离心10次直到上清液变为无色，将产物用乙醇洗涤之后，60℃下干燥过夜，用稀盐酸洗涤得到多孔石墨烯；
（3）pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
向20.0mg制备的多孔石墨烯加入5.0~15.0ml、1.0mg/ml的pdcu纳米线分散液，将混合物超声1h，离心后的黑色沉淀物在室温下干燥，将20.0mg黑色粉末再分散在5.0ml、ph=7.4的缓冲溶液中。
3.一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备，用于乙肝e抗原hbeag的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站，在三电极体系下进行测试，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝电极为对电极，以所制备的免疫传感器为工作电极，在10ml包含5.0mmol/l过氧化氢溶液的ph=7.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4v，取样间隔0.1s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10ml、50mmol/l的ph=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10µl、5mol/l的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（3）记录不同浓度下的乙肝e抗原hbeag所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到待测样品中乙肝e抗原hbeag的浓度。
本发明的有益成果
（1）本发明制备了pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子，pdcu纳米线有很好的催化性能，并且可以容易地与抗体结合，多孔石墨烯纳米片具有大的比表面积，良好的催化性能，优良的导电性，而且能有效负载pdcu纳米线，pdcu纳米线和多孔石墨烯纳米片结合后，有效增强了材料的导电性，通过这种协同作用和多重放大作用，降低了传感器的检测限，实现高灵敏、快速电化学检测；
（2）一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器对乙肝e抗原hbeag的检测，其对乙肝e抗原hbeag检测范围是0.1pg/ml~100ng/ml，最低检测下限为0.03pg/ml，表明所制备的一种无标记型pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器可以精确定量检测乙肝e抗原hbeag。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为3.0mm的玻碳电极用al2o3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0µl、0.5mg/ml的pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0µl、5.0µg/ml的乙肝e抗体滴加到电极表面，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0µl、1.0mg/ml的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0µl、0.1pg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的乙肝e抗原hbeag溶液，用ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4℃冰箱中干燥，制得一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器。
实施例2一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为4.0mm的玻碳电极用al2o3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0µl、1.0mg/ml的pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0µl、10.0µg/ml的乙肝e抗体滴加到电极表面，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0µl、1.5mg/ml的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0µl、0.1pg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的乙肝e抗原hbeag溶液，用ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4℃冰箱中干燥，制得一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器。
实施例3一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器的制备方法
（1）将直径为5.0mm的玻碳电极用al2o3抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；
（2）将6.0µl、2.0mg/ml的pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；
（3）将6.0µl、15.0µg/ml的乙肝e抗体滴加到电极表面，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中干燥；
（4）继续将3.0µl、2.0mg/ml的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4℃冰箱中晾干；
（5）继续滴加6.0µl、0.1pg/ml~100ng/ml的一系列不同浓度的乙肝e抗原hbeag溶液，用ph=7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，4℃冰箱中干燥，制得一种pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器。
实施例4所述pdcu纳米线的制备
在室温下，分别取0.5ml的20mmol/l四氯钯酸钠溶液，0.5ml的20mmol/l氯化铜溶液，0.03ml的6mmol/l盐酸溶液，30mg溴化钾和20mg聚醚f127，将其溶于去离子水中，然后向溶液中加入0.5ml的0.1mmol/l抗坏血酸溶液，将其在90℃的油浴中保持30min，自然冷却至室温，在转速10000rpm离心收集得到pdcu纳米线的水分散系。
实施例5所述pdcu纳米线的制备
在室温下，分别取1.0ml的20mmol/l四氯钯酸钠溶液，1.0ml的20mmol/l氯化铜溶液，0.06ml的6mmol/l盐酸溶液，60mg溴化钾和40.0mg聚醚f127，将其溶于去离子水中，然后向溶液中加入1.0ml的0.1mmol/l抗坏血酸溶液，将其在90℃的油浴中保持30min，自然冷却至室温，在转速10000rpm离心收集得到pdcu纳米线的水分散系。
实施例6所述pdcu纳米线的制备
在室温下，分别取1.5ml的20mmol/l四氯钯酸钠溶液，1.5ml的20mmol/l氯化铜溶液，0.1ml的6mmol/l盐酸溶液，90mg溴化钾和60.0mg聚醚f127，将其溶于去离子水中，然后向溶液中加入1.5ml的0.1mmol/l抗坏血酸溶液，将其在90℃的油浴中保持30min，自然冷却至室温，在转速10000rpm离心收集得到pdcu纳米线的水分散系。
实施例7所述pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
①多孔石墨烯的制备
在连续超声下将0.33g六水合三氯化铁与0.33ml的5.0mg/ml氧化石墨烯溶液混合1h，然后，通过滤纸过滤混合物，将滤纸在60℃的真空烘箱中干燥，将带盖的滤纸放在锡箔上，用钳子放入马弗炉中，并在450℃下点火，然后，用钳子取出锡箔上的片材并自然冷却至室温，用超纯水离心10次直到上清液变为无色，将产物用乙醇洗涤之后，60℃下干燥过夜，用稀盐酸洗涤得到多孔石墨烯；
②pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
向20.0mg制备的多孔石墨烯加入5.0ml、1.0mg/ml的pdcu纳米线分散液，将混合物超声1h，离心后的黑色沉淀物在室温下干燥，将20.0mg黑色粉末再分散在5.0ml、ph=7.4的缓冲溶液中。
实施例8所述pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
①多孔石墨烯的制备
在连续超声下将0.66g六水合三氯化铁与0.66ml的5.0mg/ml氧化石墨烯溶液混合1h，然后，通过滤纸过滤混合物，将滤纸在60℃的真空烘箱中干燥，将带盖的滤纸放在锡箔上，用钳子放入马弗炉中，并在450℃下点火，然后，用钳子取出锡箔上的片材并自然冷却至室温，用超纯水离心10次直到上清液变为无色，将产物用乙醇洗涤之后，60℃下干燥过夜，用稀盐酸洗涤得到多孔石墨烯；
②pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
向20.0mg制备的多孔石墨烯加入10.0ml、1.0mg/ml的pdcu纳米线分散液，然后将混合物超声1h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0mg黑色粉末再分散在5.0ml、ph=7.4的缓冲溶液中。
实施例9所述pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
①多孔石墨烯的制备
在连续超声下将1.0g六水合三氯化铁与1.0ml的5.0mg/ml氧化石墨烯溶液混合1h，然后，通过滤纸过滤混合物，将滤纸在60℃的真空烘箱中干燥，将带盖的滤纸放在锡箔上，用钳子放入马弗炉中，并在450℃下点火，然后，用钳子取出锡箔上的片材并自然冷却至室温，用超纯水离心10次直到上清液变为无色，将产物用乙醇洗涤之后，60℃下干燥过夜，用稀盐酸洗涤得到多孔石墨烯；
②pdcu纳米线功能化多孔石墨烯纳米粒子的制备
向20.0mg制备的多孔石墨烯加入15.0ml、1.0mg/ml的pdcu纳米线分散液，将混合物超声1h，离心后的黑色沉淀物在室温下干燥，将20.0mg黑色粉末再分散在5.0ml、ph=7.4的缓冲溶液中。
实施例10所述的pdcu纳米线功能化多孔石墨烯的电化学免疫传感器对乙肝e抗原hbeag的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10ml、50mmol/l的ph=7.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
（2）用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4v，取样间隔0.1s，运行时间400s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50s向10ml、50mmol/l的ph=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10µl、5mol/l的过氧化氢溶液，记录电流变化；
（3）记录不同浓度下的乙肝e抗原hbeag所对应的电流峰值；
（4）利用工作曲线法，得到所述免疫传感器对乙肝e抗原hbeag的线性检测范围是0.1pg/ml~100ng/ml，检测限为0.03pg/ml。