基于Fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接ELISA检测方法及其检测试剂盒与流程

本发明涉及一种基于fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接elisa检测方法及其检测试剂盒以及应用。

背景技术：

鸭3型腺病毒(duckadenovirus3，dadv-3)是近年来在中国出现的新型鸭腺病毒，具有明显的致病力，感染鸭临床剖检病变为肝脏黄化、质地变脆、肿大、出血及坏死。鸭3型腺病毒具有一般禽腺病毒的基本结构，呈二十面体对称，无囊膜，直径60-80nm，为双链dna病毒，基因组全长为43842bp，有2个纤突蛋白(fiber1和fiber2)基因。纤突蛋白作为腺病毒的主要结构蛋白之一，具有亚群和型特异性抗原表位，因此它们在腺病毒传染性和致病性方面起着至关重要的作用。fiber蛋白作为保护性免疫原能够诱导产生中和抗体。fiber蛋白还通过介导腺病毒与宿主细胞受体的结合，在病毒感染的初始阶段起重要作用。

近年来鸭3型腺病毒引起鸭群感染发病的形势日益严峻，给养禽业造成了巨大的经济损失，目前急需一种血清学检测方法，用于该病毒感染的临床检测以及今后疫苗免疫后抗体水平的监测，对于该病的有效防控具有十分重要的意义。酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)是将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。由于elisa方法具有很高的敏感性和再现性，并且可以用于大量血清样品的检测，因此该方法是最常用的血清学方法之一。纤突蛋白作为腺病毒的主要结构蛋白之一，具有亚群和型特异性抗原表位，能诱导产生特异性中和抗体。为此，本发明利用原核表达的鸭3型腺病毒fiber1蛋白作为包被抗原，建立检测鸭3型腺病毒血清抗体的间接elisa方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速、简便地基于fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接elisa检测方法及其检测试剂盒以及应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种fiber1蛋白的制备方法：以鸭3型腺病毒的核酸作为模板，利用设计合成的特异性引物进行pcr扩增，回收扩增的pcr产物；将扩增的pcr产物、pet-28a表达载体先用ndei与xhoi酶切后再连接，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化rosetta(de3)感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物进行纯化，即得所述fiber1蛋白；

其中，所述特异性引物的序列如下：

上游引物f1f:catatgctctgtccgtttagattcatc；

下游引物f1r:ctcgagttatacaatcttcgctaggtacgaga；

所述fiber1蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。

一种基于fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接elisa检测方法，以fiber1蛋白作为包被抗原包被酶标板，将待测血清样品经稀释后加入酶标板孵育，加入酶标二抗孵育后显色，测定反应后血清样品的od值。

一种鸭3型腺病毒抗体间接elisa检测试剂盒，所述试剂盒以fiber1蛋白作为elisa酶标板的包被抗原。

所述的鸭3型腺病毒抗体间接elisa检测试剂盒，在鸭3型腺病毒血清抗体检测中的应用。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：。

1.本发明利用原核表达的鸭3型腺病fiber1蛋白作为包被抗原，建立了检测鸭3型腺病血清抗体的间接elisa方法。

2.本发明以fiber1蛋白作为包被抗原建立间接elisa检测方法，可以快速检测鸭3型腺病毒抗体，具有良好的特异性和重复性。对临床样品进行检测，结果表明本方法可以作为鸭3型腺病毒抗体检测的一种方法而运用到生产实际中。

3.本发明的检测方法还具有可同时进行大量样品的检测以及检测快速、便捷的优点。

附图说明

图1是fiber1蛋白纯化的sds-page分析图。

图2是elisa方法的特异性分析结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种fiber1蛋白的制备方法：以鸭3型腺病毒的核酸作为模板，利用设计合成的特异性引物进行pcr扩增，回收扩增的pcr产物；将扩增的pcr产物、pet-28a表达载体先用ndei与xhoi酶切后再连接，构建重组表达质粒；将重组表达质粒转化rosetta(de3)感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物进行纯化，即得所述fiber1蛋白；

其中，所述特异性引物的序列如下：

上游引物f1f:catatgctctgtccgtttagattcatc；

下游引物f1r:ctcgagttatacaatcttcgctaggtacgaga；

其中，上下游引物中下划线部分的序列分别为ndei和xhoi限制性酶切位点。

所述fiber1蛋白的氨基酸序列如seqidno.3所示。

一种基于fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接elisa检测方法，以fiber1蛋白作为包被抗原包被酶标板，将待测血清样品经稀释后加入酶标板孵育，加入酶标二抗孵育后显色，测定反应后血清样品的od值。

纤突蛋白作为腺病毒的主要结构蛋白，具有亚群和型特异性抗原表位，能诱导产生特异性中和抗体。本发明利用原核表达的鸭3型腺病fiber1蛋白作为包被抗原，建立的检测鸭3型腺病血清抗体的间接elisa方法，能够快速、有效的对鸭3型腺病血清抗体进行检测。

所述的基于fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接elisa检测方法，具体包括以下步骤：

(1)包被：以fiber1蛋白为包被抗原，将包被抗原用包被液稀释后，加入96孔的elisa塑胶孔板上，每孔100μl，于4℃包被过夜；之后，弃去包被后孔中多余的抗原，每孔加入200μl的洗涤液洗涤4次，洗完后将板拍干；

(2)封闭：每孔加入200μl封闭剂，37℃，封闭2h；之后，弃去封闭后孔中多余的封闭剂，用洗涤液洗涤4次，洗完后拍干；

(3)加待检血清：每孔加入100μl用样品稀释液稀释过的血清，37℃，孵育1h；之后弃去孵育后孔中多余的血清，用洗涤液洗涤4次，洗完后拍干；

(4)加二抗：每孔加入100μl用样品稀释液稀释过的酶标二抗，37℃，孵育1h；之后，弃去孵育后孔中多余的酶标二抗，用洗涤液洗涤4次，洗完后拍干；

(5)显色：每孔加入100μl显色剂，37℃避光显色10min；

(6)终止：每孔加入100μl终止液；反应终止后置于酶标仪中，在450nm下，读取每个样品的od值；

(7)结果判定：待检血清od值≥0.353时判定为鸭3型腺病毒抗体阳性，od值＜0.353判定为阴性；

其中，步骤(1)中，包被抗原用包被液稀释至4μg/ml。

所述包被液为0.05m、ph9.6的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为pbst缓冲液；所述封闭剂为5％的脱脂乳；所述样品稀释液为pbs缓冲液；所述显色剂为tmb。所述终止液为0.5m的硫酸溶液；待检血清用样品稀释液按照1:100倍稀释；所述酶标二抗为羊抗鸭igg酶标二抗；酶标二抗用样品稀释液按1:4000倍稀释。

一种鸭3型腺病毒抗体间接elisa检测试剂盒，所述试剂盒以fiber1蛋白作为elisa酶标板的包被抗原。

所述的鸭3型腺病毒抗体间接elisa检测试剂盒，它还包括包被液、洗涤液、封闭剂、样品稀释液、酶标二抗、显色剂、终止液、鸭3型腺病毒阳性血清、spf鸭阴性血清。

所述包被液为0.05m、ph9.6的碳酸盐缓冲液；所述洗涤液为pbst缓冲液；所述封闭剂为5％的脱脂乳；所述样品稀释液为pbs缓冲液；所述显色剂为tmb。所述终止液为0.5m的硫酸溶液；所述酶标二抗为羊抗鸭igg酶标二抗；

所述的鸭3型腺病毒抗体间接elisa检测试剂盒可用于鸭3型腺病毒血清抗体的检测中。

下面结合具体实施例对本发明内容作更细致地阐述：

实施例一：fiber1蛋白的制备：

1材料：

1.1实验试剂与耗材：

pcr扩增试剂盒phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司；病毒核酸提取试剂盒easypureviraldna/rnakit、dh5a感受态菌株、rosetta(de3)感受态菌株均购自北京全式金生物技术有限公司；ndei、xhoi限制性内切酶以及连接酶t4dnaligase购自thermoscientific公司；pet-28a表达载体购自takara公司；羊抗鸭igg酶标二抗购自kpl公司；tmb显色剂购自博士德生物技术有限公司；其他常规试剂和耗材购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2毒株与血清：

鸭3型腺病毒(dadv-3)、鸭瘟病毒(dpv)、禽流感病毒(aiv)、鸭甲肝病毒(dhav)、番鸭细小病毒(mdpv)、鸭疫里默氏菌(ra)和鸭坦布苏病毒(dtmuv)的鸭源阳性血清以及鸭3型腺病毒株由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病室保存。

2.鸭3型腺病fiber1蛋白原核表达

2.1引物设计

利用引物设计软件oligo7，针对鸭3型腺病毒fiber1基因设计引物，引物序列如下：

上游引物f1f:catatgctctgtccgtttagattcatc

下游引物f1r:ctcgagttatacaatcttcgctaggtacgaga

上下游引物有下划线部分的序列分别为ndei和xhoi限制性酶切位点。

2.2目的基因钓取

2.2.1核酸的制备

利用北京全式金生物技术有限公司的viraldna/rnakit核酸提取试剂盒，按照说明书的操作方法提取鸭3型腺病毒的核酸。

2.2.2fiber1基因的扩增

本发明使用的pcr扩增试剂盒phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase购自南京诺唯赞生物科技有限公司。在结合试剂盒推荐的反应体系配置的基础上对pcr反应液进行了优化，优化出的50μl最佳反应体系的具体配置方法见表1，最佳反应条件为：95℃3min，预变性；95℃15s，58℃15s，72℃90s，共30个循环；72℃延伸7min。用胶回收试剂盒纯化pcr产物。

表1pcr反应液的配置

2.3原核表达载体构建

2.3.1换载酶切

将上述纯化的pcr产物和pet-28a表达载体分别进行酶切，pcr产物和pet-28a表达载体的50ul酶切体系分别见表2和表3。

表2pcr产物片段酶切体系

表3表达载体的酶切体系

以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应2h，回收酶切的载体pet-28a和目的dna片段。

2.3.2目的片段与载体连接

将步骤2.3.1回收纯化好的酶切目的dna片段和酶切载体pet-28a，进行连接。连接体系为20ul，具体方法见表4。

表4目的片段与载体连接体系

上述连接混合液放在22℃pcr仪1h。

2.3.3转化，筛选克隆

将上述连接液进行转化，转化采用42℃热激法进行，感受态菌株为dh5a。挑取转化后平板上的单菌落于试管中37℃、220rpm/min培养过夜，抽提质粒，采用ndei，xhoi双酶切鉴定，并将重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

2.3.4阳性重组质粒转化表达菌

取1μl已鉴定为阳性的重组质粒转化rosetta(de3)感受态，42℃热击90s后冰上静置5min后涂布含有终浓度为50μg/ml氨苄霉素和34μg/ml氯霉素的lb固体平板上，37℃培养过夜。

2.4fiber1蛋白诱导表达

挑取表达菌株rosetta(de3)的单菌落于装有12mllb液体培养基的三角瓶中，37℃，220rpm过夜培养。将过夜培养的菌液按1:100比例接种于1l的lb培养基中，37℃，220rpm培养。当od值达到0.6时，添加终浓度为0.5mm的iptg，220rpm，20℃诱导过夜。4000rpm离心10min收集菌体，弃上清。将收集的细菌菌体用破碎buffer溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400w，20min，超声2s，暂停6s为一个循环。超声完毕，12000rpm，4℃，离心20min，收集上清进行下一步纯化。

2.5镍琼脂糖凝胶亲和层析法纯化fiber1蛋白

取5mlni-nta，用5倍柱床体积的bindingbuffer清洗平衡柱子，流速5ml/min。填料和样品孵育1h后上柱，收集穿透液。5倍柱床体积的bindingbuffer清洗柱子，流速5ml/min。washbuffer洗杂，流速2ml/min，收集洗脱液。elutionbuffer洗脱，流速2ml/min，收集洗脱液。将收集的洗脱液于50mmtris，300mmnacl，2mmdtt，ph8.0中透析。透析结束后peg20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1ml/tube，于-80℃冻存。fiber1蛋白最终纯化sds-page分析见图1。其中，图1中，m为proteinmarker；1为目的蛋白即fiber1蛋白。

实施例二：鸭3型腺病毒抗体间接elisa检测

3.elisa方法建立

(1)包被：以纯化后的fiber1蛋白为包被抗原，fiber1蛋白用0.05m、ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释后加入96孔的elisa塑胶孔板上，每孔100μl，于4℃包被过夜；弃去包被后孔中多余的抗原，每孔加入200μl的pbst洗涤4次，洗完后将板拍干；

(2)封闭：每孔加入200μl5％的脱脂乳，37℃，封闭2h。弃去封闭后孔中多余的脱脂乳，用pbst洗涤4次，洗完后拍干；

(3)加待检血清：每孔加入100μl用pbs缓冲液稀释过的鸭血清，37℃，孵育1h；弃去孵育后孔中多余的血清，用pbst洗涤4次，洗完后拍干；

(4)加二抗：每孔加入100μl用pbs缓冲液稀释过的羊抗鸭igg酶标二抗，37℃，孵育1h。之后，弃去孵育后孔中多余的酶标二抗，用pbst洗涤4次，洗完后拍干；

(5)显色：每孔加入100μltmb显色剂，37℃避光显色10min；

(6)终止：鸭3型腺病毒阳性血清样品孔出现蓝绿色，立即加入0.5m的h2so4终止反应。反应终止后置于酶标仪中，在450nm读取每个样品的od值。

用上述方法对包被抗原浓度、血清稀释度以及酶标二抗稀释度进行了优化，优化出的最佳条件如下：包被抗原浓度4μg/ml(即纯化后的fiber1蛋白用包被液稀释至4μg/ml后，再加入96孔的elisa塑胶孔板上)、血清1:100倍稀释、酶标二抗1:4000倍稀释。用以上建立的elisa方法测定35份鸭3型腺病毒阴性血清的od值，求出平均数为0.230，标准差为0.041，将该平均数加上3倍的标准差作为判定阳性和阴性的临界值，求得临界值为0.353，即若待检血清od值≥0.353时判定为鸭3型腺病毒抗体阳性，od值＜0.353判定为阴性。

4.elisa方法的特异性分析

用上述建立的elisa方法同时测定鸭3型腺病毒(dadv-3)、鸭瘟病毒(dpv)、禽流感病毒(aiv)、鸭甲肝病毒(dhav)、番鸭细小病毒(mdpv)、鸭疫里默氏菌(ra)和鸭坦布苏病毒(dtmuv)的鸭源阳性血清的od值，结果如图2所示，只有鸭3型腺病毒的血清检测结果为阳性，其他病原的阳性血清，检测结果均为阴性。

5.临床应用

用以上建立的elisa检测方法对临床送检的62份鸭血清样品进行检测，检测出鸭3型腺病毒阳性血清16份，阳性率为25.8％。表明鸭3型腺病毒在该次送检的鸭群中有较高的感染率。

序列表

<110>福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>基于fiber1蛋白检测鸭3型腺病毒抗体的间接elisa检测方法及其检测试剂盒

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catatgctctgtccgtttagattcatc27

<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcgagttatacaatcttcgctaggtacgaga32

<210>3

<211>459

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

metleucyspropheargpheileglntyraspseralametmetgln

151015

thralaleupheglyargserleulysargargargargalaasnser

202530

aspthrgluleuglualaglulysglnilelysprogluthrthrthr

354045

serserglyglyaspproproilealaproproproprothrpropro

505560

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65707580

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245250255

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260265270

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