一种高效液相色谱法测定硫辛酸注射液有关物质的方法与流程

本发明涉及药物检测领域，具体涉及一种高效液相色谱法测定硫辛酸注射液有关物质的方法。
背景技术：
：硫辛酸(alphalipoicacid)是一种存在于线粒体的辅酶，具备很高的自由基反应能力，能消除体内的自由基，具有消炎抗衰老的功效。目前被广泛应用于预防和治疗心脏病、糖尿病、肝病和老年痴呆。2000年德国史达德公司的硫辛酸注射液(奥力宝)在国内进口上市。硫辛酸样品不稳定容易产生杂质，主要包含氧化杂质、6，8-环三硫辛酸、二氢硫辛酸等。硫辛酸注射液的处方工艺中使用的辅料为乙二胺，硫辛酸易与辅料乙二胺产生杂质硫辛酸酰胺单取代和双取代杂质，因此必须对这两个杂质进行控制。目前没有公开的对上述杂质(尤其是硫辛酸酰胺单取代和双取代杂质)的检测方法，因此需要提供一种硫辛酸注射液有关物质的方法。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效液相色谱法测定硫辛酸注射液有关物质的方法，技术方案如下：一种高效液相色谱法测定硫辛酸注射液有关物质的方法，流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为磷酸二氢钾a溶液，所述流动相b为甲醇和乙腈的混合溶液，采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，在第0～40min，所述流动相a的体积由80％递减为40％，所述流动相b的体积由20％递增为60％；在第40～70min，所述流动相a的体积为40％，所述流动相b的体积为60％；在第70-72min，所述流动相a的体积由40％递增为80％，所述流动相b的体积由60％递减为20％。本发明发现，采用高效液相色谱法对硫辛酸注射液中容易出现的杂质进行检测时，流动相的选择对杂质的分离有较大的影响，当采用固定比例的流动相a和流动相b进行检测时，难以将上述杂质很好的分离，经过大量尝试发现，当采用上述方法进行梯度洗脱时，可以很好地将硫辛酸注射液中容易出现的杂质区分开来。本发明所述的硫辛酸注射液有关物质包括硫辛酸及杂质，所述杂质为选自硫辛酸酰胺单取代杂质(式1)、硫辛酸酰胺双取代杂质(式2)、氧化杂质(式3～式6)、硫辛酸乙酯(式7)、6，8-二氯辛酸乙酯(式8)、杂质a(式9)、杂质c(式10)、杂质d(式11)中的一种或一种以上混合物。通过本发明中的方法可同时将上述11个已知杂质与其他未知杂质分离开来。为了进一步提升检测的准确性和灵敏性，本发明对高效液相色谱法的其他条件进行了优化，得到如下优选方案(将各优选方案组合可得本发明较佳实施例)：作为优选，所述磷酸二氢钾a溶液的浓度为0.004～0.006mol/l，优选为0.005mol/l。作为优选，所述磷酸二氢钾a溶液的ph值为2.9～3.3，优选为3.1。作为优选，所述甲醇和乙腈的体积比为40:10～45:5，优选为42:8。作为优选，采用用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂。作为优选，色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm，优选为waterst3，4.6mm×250mm，5μm。作为优选，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min，优选为1.0ml/min。作为本发明的一种优选方案，采用以下条件进行测定：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱的规格为waterst3，4.6mm×250mm，5μm；流动相a：浓度为0.004～0.006mol/l、ph值为2.9～3.3的磷酸二氢钾a溶液；流动相b：体积比为40:10～45:5的甲醇和乙腈的混合溶液；柱温：25～35℃；检测波长：210nm～220nm；流速：0.8～1.2ml/min；采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，在第0～40min，所述流动相a的体积由80％递减为40％，所述流动相b的体积由20％递增为60％；在第40～70min，所述流动相a的体积为40％，所述流动相b的体积为60％；在第70-72min，所述流动相a的体积由40％递增为80％，所述流动相b的体积由60％递减为20％。作为优选，用稀释液将硫辛酸注射液稀释为1.0～2.0mg/ml作为供试品溶液。作为优选，用稀释液稀释硫辛酸和杂质对照品作为混合对照溶液，其中，所述硫辛酸的浓度为1.0～2.0mg/ml；所述杂质对照品为选自硫辛酸酰胺单取代杂质、硫辛酸酰胺双取代杂质、氧化杂质、硫辛酸乙酯、6，8-二氯辛酸乙酯、杂质a、杂质c、杂质d中的一种或一种以上混合物；所述硫辛酸酰胺双取代杂质的浓度为0.002～0.004mg/ml，所述氧化杂质的浓度为0.1～0.2mg/ml，其他各杂质的浓度分别为0.02～0.04mg/ml。采用上述浓度范围的供试品溶液和混合对照溶液均可以较为清晰准确地测出供试品中各成分的含量，在实际应用中为了方便计算，可将供试品溶液的浓度及混合对照溶液中各成分的浓度在上述范围内按比例设置。如设置供试品溶液中硫辛酸注射液的含量为1.5mg/ml，混合对照溶液中，硫辛酸的浓度为1.5mg/ml；所述硫辛酸酰胺双取代杂质的浓度为0.003mg/ml，所述氧化杂质的浓度为0.15mg/ml，其他各杂质的浓度分别为0.03mg/ml，可以在保证准确的同时，更有利于各成分含量的计算。为了同时达到上述目的，在本发明限定范围内对各组分的浓度可以有多种按比例设置方式，在此不做进一步限定。在实际应用时，优选将供试品溶液和混合对照溶液过滤后再注入液相色谱仪。作为优选，所述稀释液为体积比为35：65～45：55的磷酸二氢钾b溶液和乙醇的混合物；优选所述体积比为40：60；优选所述磷酸二氢钾b溶液的浓度为6.8±0.1g/l；优选所述磷酸二氢钾b溶液的ph值为3.5±0.1。作为优选，本申请中所述磷酸二氢钾a溶液和所述磷酸二氢钾b溶液的ph值通过磷酸进行调节。本发明有益效果如下：本发明提供的方法可在高效液相色谱图中将硫辛酸注射液中有关物质(包含硫辛酸和至少11种常见杂质)分离开来；并通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏性及其含量的准确性进一步得到提升。该方法专属性好、分析速度快、重现性高，便于对硫辛酸注射液的质量检测与监控，有利于硫辛酸的安全推广与应用。附图说明图1是本发明一种硫辛酸注射液混合杂质色谱图。图2是本发明一种硫辛酸注射液空白稀释液色谱图。图3是本发明一种硫辛酸注射液空白辅料色谱图。图4是本发明一种硫辛酸注射液等度方法下的混合杂质色谱图。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1一种高效液相色谱法测定硫辛酸注射液有关物质的方法，采用以下条件进行测定：色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相a：浓度为0.005mol/l、ph值为3.1的磷酸二氢钾a溶液；流动相b：体积比为42:8的甲醇和乙腈的混合溶液；柱温：30℃；检测波长：215nm；流速：1.0ml/min；采用梯度洗脱，以所述流动相的总体积为100％计，在第0～40min，所述流动相a的体积由80％递减为40％，所述流动相b的体积由20％递增为60％；在第40～70min，所述流动相a的体积为40％，所述流动相b的体积为60％；在第70-72min，所述流动相a的体积由40％递增为80％，所述流动相b的体积由60％递减为20％。通过稀释液稀释至供试品溶液中硫辛酸注射液的含量为1.5mg/ml，混合对照溶液中，硫辛酸的浓度为1.5mg/ml；所述硫辛酸酰胺双取代杂质的浓度为0.003mg/ml，所述氧化杂质的浓度为0.15mg/ml，其他各杂质的浓度分别为0.03mg/ml。所述稀释液为体积比为40：60的磷酸二氢钾b溶液和乙醇的混合物；所述磷酸二氢钾b溶液的浓度为6.8g/l，ph值为3.5。各溶液的具体配置过程及本发明方法的试验验证过程及结果见实验例1～4。实验例1系统适用性试验稀释液：0.05mol/l磷酸二氢钾溶液-乙醇(40:60)，用磷酸调ph值至3.5。空白辅料溶液：精密称取乙二胺约33mg置5ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，取3ml置50ml棕色量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为空白辅料溶液。混合对照溶液的配制：取杂质a、c、d、氧化杂质、硫辛酸酰胺单取代杂质、硫辛酸酰胺双取代杂质、硫辛酸乙酯和6，8-二氯辛酸乙酯及硫辛酸适量，加稀释液(稀释液为磷酸二氢钾b溶液和乙醇的混合物，体积比为40：60(称取磷酸二氢钾6.80g，加水溶解并稀释至至1000ml。量取磷酸二氢钾b溶液400ml，乙醇600ml，混合，用磷酸调ph值至3.5±0.1))，溶解并稀释制成每1ml中含硫辛酸1.5mg，双取代0.003mg，氧化杂质0.15mg其他各杂质0.03mg的溶液，作为混合对照溶液。各杂质定位溶液的配制：取杂质杂质a、c、d、氧化杂质、硫辛酸酰胺单取代杂质、硫辛酸酰胺双取代杂质、硫辛酸乙酯和6，8-二氯辛酸乙酯各适量，分别加稀释液溶解并稀释制成每1ml中各含双取代0.003mg，氧化杂质0.15mg其他各杂质0.03mg的溶液作为杂质定位溶液。供试品溶液的配制：取硫辛酸注射液3ml，置50ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照溶液：精密量取上述供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置25ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为对照溶液。测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相a为0.005mol/l磷酸二氢钾a溶液(用磷酸调ph值至3.1)，流动相b为甲醇：乙腈(42：8)，柱温为30℃，检测波长为215nm，流速1.0ml/min，采用梯度洗脱，其运行的比例变化过程见表1。表1有关物质梯度洗脱程序精密量取上述各溶液20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表2，混合杂质色谱图见附图1，空白稀释液色谱图见图2，空白辅料色谱图见图3。表2有关物质方法学-专属性-混合对照结果结论：空白稀释液、空白辅料均不干扰供试品溶液中有关物质的检测，混合对照溶液中各峰与其相邻色谱峰之间的分离度均符合规定，表明本发明提供的高效液相色谱法测定硫辛酸注射液有关物质的方法的专属性良好。实验例2线性与范围试验各杂质溶液贮备液：精密称取杂质a、c、d、硫辛酸酰胺单取代杂质、硫辛酸酰胺双取代杂质、硫辛酸乙酯和6，8-二氯辛酸乙酯各3mg，分别置不同10ml量瓶中，氧化杂质75mg置50ml量瓶中，双取代杂质3mg置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，分别作为各杂质溶液的贮备液。硫辛酸对照品贮备液：精密称取硫辛酸对照品35mg，置50ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。线性溶液：精密量取硫辛酸对照品贮备液和各杂质储备液1ml置同一10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为线性储备液。分别精密量取以上线性储备液2ml、1.5ml、1ml、0.5ml、0.2ml等置不同10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。分别作为线性200％、线性150％、线性100％、线性50％、线性20％等溶液。精密量取上述各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3。表3有关物质方法学-线性结果成分标准曲线线性与范围r硫辛酸y＝9199.1228x+2143.46300.3858～15.4320ug/ml0.9992双取代y＝664340.6814x+3537.78730.0075～0.7500ug/ml0.9997单取代y＝3953.8692x-73.65850.6214～6.2140ug/ml1.0000氧化杂质y＝8309.1641x-786.51222.1628～21.6280ug/ml0.9999杂质cy＝7287.5040x+744.12200.7194～7.1940ug/ml0.9999杂质dy＝3118.5209x+354.78050.6806～6.8060ug/ml0.9997杂质ay＝21531.2704x-1096.12200.6546～6.5460ug/ml0.9999硫辛酸乙酯y＝3351.6871x-2018.55140.6382～6.3820ug/ml0.99946，8-二氯辛酸乙酯y＝7729.1341x-320.54170.5788～5.57881ug/ml0.9996结论：硫辛酸在0.3858～15.4320ug/ml浓度范围内(相当于自身对照浓度的5％～200％)，线性方程为y＝9199.1228x+2143.4630，相关系数r为0.9992＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。双取代在0.0075～0.7500ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的2％～200％)，线性方程为y＝664340.6814x+3537.7873，相关系数r为0.9997＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。单取代在0.6214～6.2140ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝3953.8692x-73.6585，相关系数r为1.0000＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。氧化杂质在2.1628～21.6280ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝8309.1641x-786.5122，相关系数r为0.9999＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好；杂质c在0.7194～7.1940ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝7287.5040x+744.1220，相关系数r为0.9999＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。杂质d在0.6806～6.8060ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝3118.5209x+354.7805，相关系数r为0.9997＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。杂质a在0.6546～6.5460ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝21531.2704x-1096.1220，相关系数r为0.9999＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。硫辛酸乙酯在0.6382～6.3820ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝3351.6871x-2018.5514，相关系数r为0.9994＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。6，8-二氯辛酸乙酯在0.5788～5.57881ug/ml浓度范围内(相当于限度浓度的20％～200％)，线性方程为y＝7729.1341x-320.5417，相关系数r为0.9996＞0.9990，峰面积与浓度线性关系良好。实验例3回收率试验供试品溶液：取硫辛酸注射液3ml，置50ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。各杂质溶液贮备液：精密称取杂质a、c、d、硫辛酸酰胺单取代杂质、硫辛酸酰胺双取代杂质、硫辛酸乙酯和6，8-二氯辛酸乙酯各3mg，分别置不同10ml量瓶中，氧化杂质75mg置50ml量瓶中，双取代杂质3mg置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，分别作为各杂质溶液的贮备液。回收率对照品溶液贮备液：精密量取各杂质储备液2ml置同一20ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。回收率对照品溶液：精密量取上述回收率对照品溶液贮备液1ml，置10ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。回收率供试品溶液：精密量取取硫辛酸注射液0.6ml置10ml量瓶中，平行量取9份，平均分为3组，分别精密加入上述回收率对照品溶液贮备液0.5ml、1.0ml、1.5ml，分别加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为50％、100％、150％回收率供试品溶液。精密量取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，结果见表4。表4有关物质方法学-回收率结果结论：50％、100％、150％浓度下，各杂质的组内平均回收率及组间平均回收率均在90％～108％之间，表明本方法用于检测上述杂质，准确度良好。实验例4耐用性试验稀释液：0.05mol/l磷酸二氢钾溶液-乙醇(40:60)，用磷酸调ph值至3.5。空白辅料溶液：精密称取乙二胺约33mg置5ml棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，取3ml置50ml棕色量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为空白辅料溶液。混合对照溶液：取杂质a、c、d、氧化杂质、硫辛酸酰胺单取代杂质、硫辛酸酰胺双取代杂质、硫辛酸乙酯和6，8-二氯辛酸乙酯及硫辛酸适量，加稀释液稀释制成每1ml中含硫辛酸1.5mg，双取代0.003mg，氧化杂质0.15mg其他各杂质0.03mg的溶液，作为混合对照溶液。供试品溶液：取硫辛酸注射液3ml，置50ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度摇匀，滤过，滤过，即得。对照溶液：精密量取上述供试品溶液5ml，置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置25ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。精密量取上述溶液20μl，于各色谱条件下注入液相色谱仪，结果见表5～6。表5有关物质方法学-耐用性-混合对照结果表6有关物质方法学-耐用性-杂质检出情况结论：当柱温变化±5℃、磷酸盐浓度变化±0.001mol/l，流动相ph值变化±0.2以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱的条件下，与正常条件相比，混合对照及杂质检出量均无明显差异。上述结果表明，色谱条件有微小变动(柱温变化±5℃、磷酸盐浓度变化±0.001mol/l，流动相ph值变化±0.2以及更换相同厂家、相同型号、不同批号色谱柱)时，本色谱条件耐用性良好。对比例1本对比例与实施例1的区别在于：不采用梯度洗脱，全程采用体积比为50：50的流动相a和流动相b的混合溶液作为流动相进行洗脱。混合杂质图谱如图4所示，混合杂质中包括(单取代、氧化杂质、双取代、杂质c、杂质d、杂质a)。从图谱中可以看出，单取代杂质、氧化杂质、双取代杂质与溶剂峰出峰时间在2-5分钟之内，杂质间的分离度小于1.5，在该色谱条件下杂质出峰时间均较晚，运行时间较长。由结果可知，使用梯度方法可以将各杂质有效检出，分离度均大于1.5，而且样品运行时间较短。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12